博 士 （ 水 産 学 ） 浦 和 寛 学 位 論 文 題 名

     博 士 （ 水 産 学 ） 浦    和 寛 学 位 論 文 題 名

Molecular biological studies on gill Na+,K+‑ATPase in masu salmon,        Oncorhynchusmasou .

（サ ク ラマ ス の鰓

Na+

，

K+

―

ATPase

に 関する分 子生物学的 研究）

学位論文内容の要旨

  

北部日本に 広く分布するサクラマス

(Oncorhynchus masou)

は沿岸漁業資源 として非常に重要な魚種である。しかし近年、その天然資源が激減しており、

沿岸漁業資源の増大のため、北海道沿岸においては河川や海中への稚魚の放流

事業およぴ海中養殖が推進されているが、斃死や成長遅滞ひいては低母川回帰

率等の問題を抱え必ずしも十分な成果をあげてはいない。その原因として、十

分に海水適応能が発達していない稚魚を河川または海中へと放流していること

が考えられる。．このような問題点を克服するためには、放流魚の海水適応能を

厳密に評価する方法の開発が望まれており、サクラマスの海水適応能の発達な

ら ぴ に そ の 内 分 泌 調 節 機 構 の 解 明 が 重 要 な 課 題 に な っ て い る 。

  

サクラマスを含む降海型サケ科魚類は、海水適応能の発達、体色の銀自化と

いったいわゆる銀化変態を引き起こした後に降海する。一般に、海産魚の体内

浸透圧は外界の浸透圧に比ベ低いため、水分が奪われるとともに体内には多量

の塩が侵入してくる。不足した水分を補給するため海水を積極的に飲み、過剰

となった塩分は鰓塩類細胞に存在しているNa+ ，K+‑ ATPase によって能動的に排

出されている。海産魚の鰓Na+ ，K+‑ ATPase 活性は淡水魚に比ベ顕著に高いこと

や、サケ科魚類の海水適応能の発達に伴い鰓Na+ ，K+‑ ATPase の活性が上昇する

ことから、Na+ ，K+‑ ATPase は海水適応に関与する重要な酵素のーっと考えられて

いる。これまでに、サケ科魚類の海水適応能の発達およびその内分泌調節機構

を解明するために多くの研究がなされてきた。しかし、これらの研究の多くは

Na

＋，K ゛‑ ATPase 活性を測定するにとどまっており、Na ＋，K ゛‑ ATPase 蛋白の発現変 化 に 着目 し た 研究 は 行な わ れ てい な い 。そ こ で本 研 究 は、 サ クラ マ ス の海水適 応 能の発達お よぴその 内分泌調 節機構の 解明を目 的とし、 鰓Na ＋、 K+‑ ATPase の 蛋白並びに遺伝子レベ渺での発現変化を解析した。

  Na

＋ ，K ゛‑ ATPase は分子 量の異な るQ および

p

サブュニ ットのニつのサブュニツ

  

トに よ り 構成 さ れ てい る 。こ の う ち

a

サブユ ニットの アミノ酸 配列の中 で、魚 類 か ら哺 乳 類 に至 る まで 共 通 した 配 列 を有 し 親水 性 の 高い 部 位の ベ ブ チドを合 成 し 、こ れ を 抗原 に 用い て ボ リク ロ ー ナル 抗 体を 作 製 し、 そ の特 異 性 を免疫生 化 学 的手 法 に より 検 討し た 。 ウサ ギ

(Oryctolagus cuni‑culus)

腎臓 、 サクラマ ス 鰓 お よ び 腎 臓 の ミ ク ロ ソ ー ム 画 分 を

sodium dodecyl sulfate

く

SDS)

によ り 可 溶 化し 、 非 還元 下 によ る ウ ェス タ ン ブ口 ッ トに よ り 解析 し た。 そ の 結果、こ れ ま でに 報 告 され て いる 哺 乳 類の

Na

＋，

K

゛‑ ATPase の 分子量と 同じ大き さの約

150 kD

の 位 置 に 免 疫 反 応 が 認 め ら れ た 。 こ の こ と か ら 、 作 製 さ れ た 抗 体 は

Q

お よ ぴp サブ ユニ ットが結 合したイ ンタクトな

Na

＋，K ゛‑ ATPase 蛋 白を認識 して い る こと を 明 かに し た。 免 疫 組織 化 学 的解 析 によ り 本 抗体 の 特異 性 を 検討した 結 果 、ウ サ ギ 、サ ク ラマ ス 、 ニホ ン ウ ナギ

(Anguilla jap

（

mica)

お よぴ ク口ソ イ

(Sebastes schlegeli

ア の 腎 臓で は 、近 位 お よび 遠 位尿 細 管 、集 合 管の 上 皮 細 胞 に特 異 的 免疫 陽 性反 応 が 認め ら れ た。 ま た、 サ ク ラマ ス 、ニ ホ ン ウナギお よ び クロ ソ イ の鰓 で

i

ま 、一 次 お よび 二 次鰓 弁上に存 在すろ塩 類細胞に 特異的免 疫 陽 性 反 応 が 観 察 さ れ た 。 ． こ れ ら の こ と か ら 、 作 製 され た 抗体 は 特 異的 に

Na

＋ ，K ゛‑ ATPase 蛋白を認識し、この酵素蛋白の発現変化の解析に有用であること が示された。

  

サ ク ラ マ ス の

Na

＋ ，

K

゛

‑ATPaseQ

サブ ユ ニ ット

cDNA

の 単離 お よ び塩 基 配列 の

決 定 を 行 な っ た 。 鰓 由 来 の

cDNA

ライ ブ ラ リー を 作製 し 、 シビ レ エイ

(Torped

〇

caljrornica)  Na

＋ ，

K

＋

‑ATPaseQ

サ ブ ユ こットcDNA を ブローブ に用いてス クリ

ー ニ ン グ を 行 な っ た 。 そ の 結 果 、

5

お よ ぴ

3

側 の 非 翻 訳 領 域 を 各 々 含 む

1432 base pair (bp)

お よ び

2234 bp

の 大 き さ を 持 つ ニ つ の

cDNA

断 片 が 得 ら

れ 、 そ れ ぞ れ の 塩 基 配 列 を 決 定 し た 。 二 つ の

cDNA

断 片 に は

338 bp

の 重 複 し

た 部 分 が 見 ら れ た が 、

5

箇 所 の 塩 基 配 列 が 異 な っ て い た 。 し か し 、 両

cDNA

断

片は、アミノ酸配列において他の魚類との相同性が約

70 ‑ 80%

と非常に高かっ た 。 こ の こ と か ら 、 今 回 得 ら れ た ニ つ の

cDNA

断 片 は サ ク ラ マ ス の

Na

＋ ．

K

゛

‑ATPaseQ

サ ブ ユ ニ ッ ト を コ ー ド し て い る こ と が 示 さ れ た 。

  

サクラ マスの

Na+

，K 十‑ATPaseQ サブユニットcDNA をブローブに用いたノー ザンブロットにより、サクラマスの鰓、腎臓、腸、肝臓および脳におけるQ サ ブユニ ット

mRNA

の発現を調べた。その結果、鰓では約3 ．

3kilo base

くkb) 、 約

3.7 kb

お よび 約

5.0 kb

の

3

本 の 特異 的な バンドが検 出された。 脳では約

3.3 kb

お よ び約

5.0 kb

の

2

本の バ ンド が 、腎 臓 、 腸お よ び肝 臓 では 約3.3

kb

のバン ドが検出された。また、筋肉では約

4.0 kb

のバンドが検出された。

一般に、哺乳類の

Na

＋，

K

゛‑ATPasea サブユニットには3 つの

isoform

が存在し ている ことがゲノ ムDNA の解 析により明 かにされている。サクラマスゲノム

DNA

を用いたサザンブロット解析の結果でも、異なる大きさの複数のバンドが 検出された。これらの結果から、サクラマスにおいて．も哺乳類と同様に異なる 複数の

isoform

が存在 している可 能性が示さ れたが、各々が機能的な

mRNA

と し て 働 い て い る か 否 か は 、 今 後 明 か に す べ き 問 題 と し て 残 さ れ た 。

  

天然サクラマスの銀化変態に伴う鰓Na ＋，K ゛‑ ATPase 活性を測定すると共に得 られた

Na

＋．

K

゛‑ATPaseQ サブユニットに対する抗体とcDNA を用いた免疫組織 化学的解析およびノーザンブロット解析により、Na ＋，K ゛‑ATPaseQ サブユニット 蛋白およびmRNA の発現変化を調べた。鰓

Na

＋，K ゛‑ ATPase 活性は銀化変態の進 行に伴い徐々に上昇した。この酵素活性の上昇に先立ち、鰓一次鰓弁上の免疫 陽陸反応を示す塩類細胞の数および大きさが増すと共に免疫活性が強くなった。

一方、鰓二次鰓弁上の塩類細胞の数は、酵素活性が最高値を示した時期には減

少した。ノーザンブロット解析の結果、鰓では上述した異なる大きさを持つ3

つ のmRNA が 検出された 。これら

mRNA

の 発現は、酵 素活性の上 昇に先立ち 増

加したが、酵素活性が最高値を示した時期には減少した。これらの結果は、サ

クラマスの海水適応能の発達には一次鰓弁上の塩類細胞の増加および肥大が深

く関与していることを示している。また、Na ＋，

K

゛‑ATPaseQ サブユニット蛋白の

発現、塩類細胞の増加および肥大は酵素活性の低い銀化変態初期から開始して

いることが明かとなった。

   他のサケ科魚類において成長ホルモンやコーチゾルが海水適応能の発達に深 く関与していることが知られている。そこで、 0 年魚サクラマスにヒッジ成長 ホルモン (oGH) およびコーチゾルを投与し、免疫組織化学的解析およびノーザ ンブロット解析により、Na+ ， K+‑ATPaseQ サブユニット蛋白およびmRNA の発現 変化を調べた。その結果、鰓 Na+ ， K+‑ ATPase 活性の上昇はoGH 投与群において のみ観察された。免疫陽性反応を示す塩類細胞の増加および Na+ ，K+‑ATPasea サブユニ ット mRNA の発現は両ホルモンによっで誘起されたが、特にコーチゾ ル投与群において強く誘起された。これらの結果から、酵素活性の上昇には成 長ホルモンが、塩類細胞の増殖およびNa+ ，K+‑ATPaseQ サブユニット蛋白並び に mRNA の発現に はコーチゾルが主に働いている可能性が示された。しかし、

Na+ ， K+‑ ATPase の活性化にはD サブユニットが必要と考えれるが、本研究では

このサブユニット蛋白の発現については不明であり、今後検討すべき課題とし

て残された。

学位論文審査の要旨 主査

副査 副査 副査 副査

教 授    山 内 晧 平 教 授    麦 谷 泰 雄 教 授    原    彰 彦 助教授   上田   宏 助教授   足立伸次

学 位 論 文 題 名

Molecular biological studies on gill Na+,K+‑ATPase in masu salmon,       Oncorhynchus masou

（サクラマスの鰓Na+ ，K+ ―ATPase に関する分子生物学的研究）

  サ クラマ スを含 む降海 型サケ 科魚類 は、海 水適応能 の発達 、体色 の銀自 化とぃ ったいわゆる銀 化 変態を 引き起 こした 後に降 海する。 一般に 、海産 魚の体 内浸透 圧は外 界の浸 透圧に比ベ低いた め 、水分 が奪わ れると ともに 体内には 多量の 塩が侵 入して くる‥ 不足し た水分 を補給するため海 水を積極的に飲み、．過剰となった塩分は鰓塩類細胞に存在しているNa゛，K゛・ATPaseによって能動 的 に排出 されている。海産魚の鰓Na゛，K゛，ATPase活性は淡水魚に比ベ顕著に高いことや、サケ科 魚類の海水適応能の発達に伴い鰓Na゛，K゛‑ATPaseの活性が上昇することから、Na゛，K゛‑ATPaseは 海 水適応 に関与 する重 要な酵 素のーっ と考え られて いる。 これま でに、 サケ科 魚類の海水適応能 の 発達お よびそ の内分 泌調節 機構を解 明する ために 多くの 研究が なされ てきた 。しかし、これら の研究の多くはNa＋，K゛．ATPase活性を測定するにとどまっており、Na゛，K゛．ATPaseタンパクの発 現 変化に 着目し た研究 は行な われてい ない。 そこで 本研究 は、サ クラマ スの海 水適応能の発達お よ びその 内分泌 調節機 構の解 明を目的 とし、 鰓Na＋，K゛・ATPaseのタンバク並びに・遺伝子レベ ルでの発現変化を解析した。  、

  Na＋．K゛ ・ATPaseaサブ ユニッ トのアミノ酸配列の中で、魚類から哺乳類に至るまで共通した配 列 を有し 親水性 の高い 部位の べプチド を合成 し、こ れを抗 原に用 いてポ リクロ ーナル抗体を作製 し 、その 特異性 を免疫 生化学 的手法に より検 討した 。ウサ ギ腎臓 、サク ラマス 鰓および腎臓のミ ク ロソー ム画分 を可溶 化し、 非還元下 による ウェス タンブ ロット により 解析し た。その結果、こ れ までに 報告さ れてい る哺乳 類のNa＋ ，K゛．ATPaseの分子 量と同じ大きさの約150 kDの位置に免 疫 反 応 が 認め ら れ た 。こ の こ と から 、作 製され た抗体 はuおよ びpサブ ユニッ トが結 合した イン タクトなNa＋，K゛．ATPaseタンノヾクを認識していることを明かにした。免疫組織化学的解析の結果、

ウ サギ、 サクラ マス、 ニホン ウナギお よびク ロソイ の腎臓 では、 近位お よび遠 位尿細管、集合管 の 上皮細 胞に特 異的免 疫陽性 反応が認 められ た。ま た、サ クラマ ス、ニ ホンウ ナギおよびクロソ     ‑ 907一

イの鰓 では、塩 類細胞 に特異 的免疫 陽性反 応が観 察され た。こ れらのこ とから 、作製 された抗体 は特異 的にNa＋ ，K゛・ATPaseタンパクを認識し、この酵素夕ンパクの発現変化の解析に有用である ことが示された。

  サクラ マスのNa＋．K゛ ・ATPaseQサ ブユニ ットcDNAの 単離お よび塩 基配列 の決定を 行なった。

その結 果、5 および3 側の非 翻訳領 域を各 々含む1432 base pair (bp)お よぴ2234 bpの大きさ を持 つ ニ っ のcDNA断 片 が 得 られ 、 そ れ ぞれ の 塩 基 配列 を 決 定 した ヵ 両cDNA断 片 は、 ア ミ ノ 酸 配列に おいて他 の魚類 との相 同性が 約70 8090と非常に高かった。，このことから、今回得られた ニつのcDNA断片は サクラ マスのNa゛，K゛ ，ATPaseuサ ブユニ ットをコ ードし ている ことが示され た。

  サクラ マスのNa゛．K゛ ・ATPaseQサ ブユニ ットcDNAを プ由ー ブに用 いたノ ーザシブ ロットによ り、 サ ク ラ マス の 鰓 、 腎臓 、 腸 、 肝臓 、 筋 肉 およ び 脳 に おけ るnサ ブユ ニットmRNAの発現 を調 べた。その結果、鰓では約3．3 kilo base (kb)、約3．7kbおよび約5．（）kl）の3本の特異的なパンド が検 出 さ れ た。 脳 で は 約3．3 kbおよ び 約4．Okbの2本のバ ンドが 、腎臓、 腸およ び肝臓 では約 3.3 kbのバン ドが検 出され た。ま た、筋 肉では 約4．0kbの バンド が検出 された 。これ らの結果か ら、サクラマスにおいても哺乳類と同様に異なる複数の1S（）f（)rmが存在している可能性が示され た。

  天然サ クラマ スの銀化変態に伴う鰓Na＋，K゛・ATPase活性を測定すると共に免疫組織化学的解析 および ノーザン ブロッ ト解析 により 、Na゛，K゛・ATPaseQサブユ ニット タンバ クおよ びmRNAの発 現変化 を調べた 。鰓Na＋，K゛．ATPase活性は銀化変態の進行に伴い徐々に上昇したーこの酵素活性 の上昇 に先立ち 、鰓一 次鰓弁 上の免 疫陽性 反応を 示す塩 類細胞 の数およ び大き さが増 すと共に免 疫活 性 が 強 くな っ た。 ノーザ ンブロ ット解析 の結果 、鰓で は上述 した異 なる大 きさを 持つ3っ の mRNAが検 出 さ れ た。 こ れ らmRNAの 発現 は 、 酵 素活 性 の 上 昇に 先 立 ち 増加 し た が 、酵 素 活 性 が 最高値 を示した 時期に は減少 した。 これら の結果 は、サ クラマ スの海水 適応能 の発達 には一次鰓 弁上の 塩類細胞 の増加および肥大が深く関与していることを示している。また、Na゛，K゛・ATPase Qサ ブユ ニ ッ ト タン パク の発現 、塩類 細胞の 増加およ び肥大 は酵素 活性の 低い銀 化変態 初期か ら 開始していることが明かとなった。

  他のサ ケ科魚 類にお いて成長 ホルモ ンやコ ーチゾ ルが海 水適応 能の発 達に深 く関与し ているこ とが 知 ら れ てい る 。 そ こで 、0年 魚 サ クラ マ スにヒ ッジ成長 ホルモ ン(oGH)お よびコ ーチゾ ルを 投与し 、免疫組 織化学 的解析 および ノーザ ンブロ ット解 析によ り、Na＋，K゛‑ATPaseqサブユニツ トタ ン バ ク およ びmRNAの 発 現変 化 を 調 べた 。そ の結果 、鰓Na゛ ，K゛ ATPase活性 の上昇 はoGH 投与群 において のみ観 察され た。免 疫陽性 反応を示す塩類細胞の増加およびNa＋，K゛，ATPaseQサ ブユ ニ ッ トmRNAの発 現 は 両 ホル モ ン に よっ て誘 起され たが、 特にコ ーチゾ ル投与群 におぃ て強 く誘起 された。 これら の結果 から、 酵素活 性の上 昇には 成長ホ ルモンが 、塩類 細胞の 増加および Na゛．K゛ ，ATPaseQサ ブユニ ットタン バクの発現にはコーチゾルが主に働いている可能性が示され た。

  上述の ように 、本研 究では、 サクラ マスの海水適応能の発達に伴う鰓でのNa゛，K゛ ATPaseaサ ブユニ ットタン パクの 発現変 化およ びその 内分泌制御機構の一部を明かにした。これらの結果は、

サケ科 魚類の海 水適応 能の発 達機構 のみな らず魚 類の浸 透圧調 節機構の 解明に 重要な 基礎的知見 を提供 したもの として 高く評 価され 、本論 文が博 士（水 産学） の学位請 求論文 として 相当の業績 であると認定した‥  ー908―