博 士 （ 農 学 ） 奥 山 正 幸
学 位 論 文 題 名
7 ．
Scカ zzosaccカ 口 ダ 〇 刀 ゑ yC￠ Sウ 〇 刀 2ろ ￠a‐ GluCOSldaSeの
構 造 と 機 能 に 関 す る 研 究 学 位 論 文 内 容 の 要 旨
oc‑glucosidase (a‑D‑glucoside glucohydrolase，EC 3.2.1.20)は、a‑glucoside結合を持つ基質 の非 還 元 末 端 か ら 加 水 分 解 に よ っ てa‑D‑glucoseを 遊 離 さ せ る エ キ ソ 型 の 酵 素 で あ る 。 微 生 物 か ら 動 物 、 植 物 に 至 る ま で 広 く 分 布 し 、 そ の 基 質 特 異 性 は 起 源 に よ り 多 様 で 、 合 成 配糖 体も し くは マル ト オ リ ゴ 糖 の よ う な 低 分 子 の 基 質 の み に 作 用 す る も の か ら 、 澱 粉 や グ リ コ ー ゲン のよ う な高 分子 に作 用 する もの ま で存 在す る 。
a‑glucosidaseのア ミ ノ酸 配列 を 比較 する と 、aーglucosidase familyl、family IIに分類する こと が で き 、 そ れ ぞ れ の フ ァ ミ リ ー 内 で 共 通 の ア ミ ノ 酸 配 列 を 有 し て い る 。familyIに 属 す る 酵 素 に はa‑amylase familyの 特 徴 が認 め られ る。a‑amylase familyとは 一 次構 造上 に 活性 中心 を 形成 する 相 同 性 の 高 い4つ の 領 域 を も ち 、 ま た 触 媒 ド メ イ ン が （D／a）8バ レ ル 構 造 を とる とい っ た構 造の 類 似 性 に 併 せ て 、 触 媒 機 構 にも 共 通性 をも つ 糖質 加水 分 解お よび 関 連酵 素群 で ある 。一 方 、family IIに 属 す る 酵 素 はa‑amylase familyの 特 徴 を 有 せ ず 、 機 能 と 構 造 に 関 す る 知 見は ほと ん どな い。
触 媒 残 基 は 一 般 酸 塩 基 触 媒 反 応 に お け る 求 核 残 基 が 自 殺 基 質 で 明 ら か に さ れ てい るの み であ り、
立体 構 造も 決定 さ れて いな い 。
本 研 究 で は ま ずSchizosaccharomyces pombe a,‑glucosidase cDNAク ロー ニ ング によ ル アミ ノ酸 配 列 を 推 定 し 、 本 酵 素 がfamily IIに 属 す る こ と を 調 べ た 。 次 にSpombe a‑glucosidase cDNAを Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastrisで発現させ、部位 特異的変異の手法 を用しゝて、触媒 活性 に 必 須 な ア ミ ノ 酸 残 基 を 推 定 し た 。 ま た そ れ ら の 近 傍 に 保 存 さ れ て い るTrp残 基 を 置 換 し た 変 異 酵素 を 作製 しそ の 役割 を考 察 した 。
1）S pombe a‑glucosidase cDNAおよびゲノ ム遺伝子の単離と構 造
S pombe a‑glucosidase cDNAを そ の ラ イ ブ ラ ル ー か ら ス ク ル ー ニ ン グ した 。プ 口 ーブ には ア ミ ノ 酸 配 列 か ら 合 成 し た オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド プ ラ イ マ ー で のRT‑PCR産 物 を 用 い た 。cDNAは 全 長 4，176 bpからなり、5 ‑UTR，1，037 bp、2，910 bp，970コドンのORF、157 bp，3 ‑UTR、72 bp，poly(A) を 含 ん で い た 。ORFか ら 推 定 され る アミ ノ酸 配 列はa‑glucosidase family II酵 素と 相 同性 のあ る も のであった。またa‑glucosidaseの他にoc‑xylosidase、aー1，4‑glucan lyaseとも相同性を示し、glucoside hydrolase family 31に属す ることが明らかに なった。
S pombe a‑glucosidase遺 伝 子 を 含 む ゲ ノ ムDNA断 片 をPCRに よ り 単 離 し た 。 遺 伝 子 に は イ ント 口ン が 含ま れな か った 。3 下流 に はABC superfamily transporter類似 夕 ンパク質がコ ードされ
ていた。5 上流にはS cerevisiaeやAspergillus属などでカタポライトルプレッションタンバク質 が結 合す る 配列GC‑box様 配列(CCGGGG)が 見出 され た 。Spombe a.‑glucosidase遺 伝子の発現 量は培地中のglucoseの 濃度により転写レベルで制 御されていた。glucose高濃度で発現は抑制さ れたが、おそらくその 制御はcAMP非依存性であるこ とを考察した。
2）S pombe a‑glucosidase cDNAのScerevisiaeお よ びPpasrisで の 発 現 S cerevisiae発現系では培養液lmlあた り無細胞抽出液から0.6Uの組 み換え酵素が得られた。
S cerevisiae組み 換え 酵素 を無 細 胞抽 出液 から 精製 し た。 性質はS pombeから精製された酵素 (Native酵 素） とほ ぼ同 じ 性質 を示 した 。 戸pasris発現 系で は 培養 液1mlあ たり 培養 上清から 1.0U、 無細 胞 抽出 液か ら2.5Uの 酵 素が 得ら れた 。Ppasris組 み換え酵 素を培養上清から精製し た。性質はNative酵素とほぽ同じ性質 を示したが、分子量はNative酵素210 kDaに対して戸pas′む 組 み換 え酵 素 は173 kDaで あっ た。 これ は 戸pastrisがSpombe、Scerevisiaeよりも過度の糖鎖 付加を行わ ないことが原因であると考 えられた。
3）S pombe a‑glucosdlaSe活性中心の推定
酵 素 反応 に対 するpHの影 響か らSpombe a‑glucosidaseの 活性 解離 基は2つ のカ ルボ キ シル 基であると推定 した。そこでa‑glucosidase family IIに属する17種の酵素で完全に保存されたカ ルボキシル基に 部位特異的変異を導入し、S cerevisiaeで発現させたと ころAsp‑481、Glu‑484、 Asp‑647が活性 に必須であることが明らかと なった。
Asp‑481は触 媒反応における求核残基であ ると予想できた。S pombe a‑glucosidaseが自殺基質 conduritolBepoxide (CBE)と1対1で結合す ることで失活し、Asp‑48lが 他起源a‑glucosidaseで CBEにより修飾 されるAsp残基と相同である こと、またAsp‑481変異酵素(Asp→ Asn，Ala，or Glu) が活性を失うこ とから推測した。
Glu‑484はGln、Alaへの変異ではmaltase活性を失うのに対し、Gluへ の変異では野生型の10％ のmaltase活性 を示した。Aspー481近傍での カルポキシル基の提供が加 水分解反応に必須である こ とが 明ら かと なっ た 。Glu‑484のAlaへの 変異 酵素はmaltoseを加水 分解することはできない が、D‑glucalを 水和できた。従ってこの残 基は触媒残基ではないと結論 した。D‑glucalが通常の 基 質よ り遷 移状 態に 近 い構 造を もつ こ とか らGlu‑484は基質に歪みを 与える役割を果たしてい ると推定した。
Asp‑647変異 酵素(Asp→ Asn，Ala，or Glu)は いずれの変異でも触 媒活性を失った。よって Asp‑647が触媒 活性の酸塩基触媒残基の最有 力候補であることをはじめ て明らかにした。またこ れら3残基近傍 はa‑glucosdiase family IIにおいて非常に保存された領域であり、a‑glucosidase familyllに お け る 触 媒 残 基 を 含 む 保 存 領 域RegionA、RegionBと し て 提 案 し た 。
4） S pombe a‑glucosidase活 性 中 心 近 傍 の 芳 香 族 ア ミ ノ 酸 残 基 の 役 割 活 性中 心 近傍 に保 存さ れたTrp残基 、Trp‑479、Trp‑644. Trp‑652のそれぞれ のAla変異酵素 を作 製し 、 それ らの 各種 基質 に 対する速度バラメー ターを求めた。すべての変 異酵素で島値が 大幅に減少した。よっ てこれらの残基が触媒活性には必須ではないが重要であることがわかった。
Trp変異 酵素 のh値の 変化 から 、Trp‑479はサ ブサ イト2、Trp‑644がサ ブサ イ ト3に 貢献してい ると 推測 し た。 またTrp‑652はAla変異酵素のpH活性 曲線がアルカル側にシフト したことから、
他のTrp‑479、Trp‑644よ り活 性 中心 に近 い位 置 で触 媒活 性に 貢献 し てい るこ とを 考察した。
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N‑bromosuccinimideによる化学修飾の結果、この3つのTrp残基以外にも活性発現に関与するTrp 残基が存在することが明らかとなった。それは活性中心以外の部位で高次構造維持に貢献してい ると考えられた。
学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
7 量 ．
Scカ zzosaccカ ロ ダ 〇 ガ 2ツ C￠ Sウ 〇 ケ 九 み ￠ a− G1uCOSldaSeの
構造と機能に関する研究
本 論 文 は 、 和 文171頁 、 図66、 表20、6章 か ら な り 、 他 に 参 考 論 文2篇 が 付 さ れ て い る 。 Q―glucosidase (EC3，2，1，20)は 、 微 生 物 、 植 物 、 動 物 に 至 る ま で 生 物 界 に 広 く 分 布 し て お り 、 そ の 基 質 特 異 性 や 一 次 構 造 か らfamilyIお よ びnの ニ つ の グ ル ー プ に 分 け ら れ る 。 本 酵 素 は 、d− グ ル コ シ ド 結 合 を も つ 基 質 の 非 還 元 末 端 か ら 加 水 分 解 に よ っ て ぱ ー glucoseを 遊 離 さ せ る が 、 そ の 基 質 特 異 性 は 起 源 に よ り き わ め て 多 様 で あ る 。 S（m恢 ）Sac曲ar〇my℃esp〇mbeQ−glucosidaseは 、 そ の 基 質 特 異 性 か ら はfamilynに 属 す る 酵 素 と み な さ れ る が 、 構 造 と 機 能 に 関 す る 知 見 は き わ め て 乏 し い 。 本 研 究 は 、S．p〔 ）mbea―glucosidaseのcDNAク ロ ー ニ ン グ に よ り そ の 一 次 構 造 の 解 析 、 異 種 宿 主 細 胞 に お け る 発 現 、 部 位 特 異 的 変 異 に よ る 触 媒 活 性 に 必 須 の ア ミ ノ 酸 残 基の 推 定 を 意 図 し て な さ れ た も の で あ り 、 研 究 の 結 果 は 以 下 の よ う に 要 約 さ れ る 。
1） 精 製 酵 素 の 部 分 ア ミ ノ 酸 配 列 に 基 づ し ゝ て 合 成 し た オリ ゴ ヌ ク レオ チ ド プラ イ マ ーを 用 い て 、S． pombed―glucosidase cDNAを そ の ラ イ ブ ラ ル ー か ら ス ク リ ー ニ ン グ し た 。 そ のcDNAは 、 全 長4，176bpか ら な り 、ORFは2910bp、970 コ ド ン を 含 ん で い た 。ORFか ら 推 定 さ れ た 全 ア ミ ノ 酸969の 配 列 は 、family II酵 素 群 と 相 同 性 が 高 く 、 一 次 構 造 の面 か ら も 本 酵 素 はfamily IIに 属 す る こ と が 確 認 さ れ た 。
S． Dombea−glucosidase cDNA遺 伝 子 を 含 む ゲ ノ ムDNA断 片 をPCR法 に よ り 単 離 、 解 析 し た 結 果 、 そ の 遺 伝 子 に は イ ン ト 口 ン が 含 ま れ て い な い こ と を 明 ら か に し た 。 2）S． pombe cDNAのSaccharomycesCere価 ぬeお よ び 鬥 曲jap丑S舩 で の 発 現 を 試 み た 。S．cereWsぬe発 現 系 で は 、 培 養 液1mlに 含 ま れ る 細 胞 の 抽 出 液 か らO．6単 位 の 組 換 え 酵 素 が 得 ら れ 、 精 製 し た 組 換 え 酵 素 はS．p〇mbeか ら 精 製 さ れ た 酵 素 （ オ リ ジ ナ ル 酵
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