博 士 （ 農 学 ） 福 島 道 広
学 位 論 文 題 名
生 菌 製 剤 投 与 に よ る ラ ッ ト の 脂 質 代 謝 に 関 す る 研 究
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
生 菌 製 剤 は 抗 生 物質 に代 わる もの とし て関 心が 高 く， 微生 物学 およ ぴ栄 養学 的研 究 にお いて もそ の効 果が 注目 され は じめ ，数 多くの生菌剤が開発・生産されている 。 し か し ， こ れ ら の 生菌 製剤 は単 一微 生物 もし くは2〜3種 類の 微生 物で 構成 され てい る もの がほ とん どで ある 。そ のた め ，100兆 個近 く分 布す ると い われ ている腸内細 菌 叢 ヘ 影 響 を 及 ぽ し てい る可 能性 は少 ない 。ま た， コ レス テロ ール 低下 作用 につ いて も そ の 効 果 に 統 一 性 が な く ， そ の 作 用 機 構 に つ い て も 不 明 な 点 が 多 い 。 本研 究は ，腐 植土 壌から分離した複数のBacil｜ us，Lactobacillus，Streptococ― cus， 甜os tr idi um，Saccharomyces，Candiぬで構成された複合系の生菌製剤を用 い て ， 腸 内 細 菌 叢 に 与え る影 響お よび 栄養 生理 作用 ， とく に脂 質代 謝に 与え る影 響に 対 す る 生 菌 製 剤 の 位置 づけ と， 生菌 製剤 の効 果発 現 の機 構を 解明 する 目的 で開 始し た 。 な お ， 本 研 究 は， ラッ トを 用い た生 菌製 剤の 栄 養学 に関 する 基礎 的研 究に 属す る も の で あ る 。 研 究の 進め 方は ，予 備試 験と して 乳 牛お よぴ 豚に 生菌 製剤 を投 与す る こ と に よ り 乳 お よぴ 肉中 のコ レス テロ ール の動 態 を検 討し ，次 いで ラッ トに 全栄 養 素 を 十 分 含 む 精 製基 本飼 料， バー ム油 およ ぴコ レ ステ ロー ルを 添加 した 高脂 肪・
高 コ レ ス テ ロ ー ル 飼 料 と ， こ れ ら に 複 合 系 の 生菌 製剤 およ ぴ単 一生 菌製 剤と し てE acidophilus，S．faecalisをそ れそ れ添 加し た飼 料 を給 与し ，こ のと きの 成長 応答 を はじ めと する 生理 的応 答を 比較 す る方 法で 研究 を進 めた 。
1．生菌製剤の微生物組成
生 菌製 剤の 構成 微生 物 はBacillus subtilis，ぢ ，natto， ぢ．mega terium，ぢ・
舶ermophfJus，Lactobacillus acidophilus，工．plantarum，工．br evis，E．casei, Streptococcus faecalis，S．1actis，ぷ． thermop由ゴJuS，ビJDS亡rfdfU皿6ut″jCU皿，
蝕c曲ar〇 皿ycescereレjsfaP，ビaロdj出Utjlfsである。これら複数の微生物を米ヌカ
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にそ れそれ10 −。cfu/gになるように発酵させて調製した。また， 比較実験のために，
ビ． bu tyr icumおよぴぢ．thermoph川usを除いた12種類の微生物を米ヌカ上で調製した 発 酵 系 生 菌 製 剤 は ， 微 生 物 を 米 ヌ カ に 吸 着 さ せ た の みの 非発 酵系 生菌 製 剤， 殺菌 し た発 酵系 生菌 製剤 ，Bacillus subとilis，Lactobacillus plantarum，工．acidophilus の3種類で構成された発 酵系生菌製剤と比較し，ビ． butyr゛icumおよびぢ．thermophilus を加 ．え て14種類 で構 成さ れた 発酵 系生 菌製 剤 は，Z． acidophilusおよ ぴnカecalね を そ れ そ れ 米 ヌ カ 上 で 発 酵 さ せ た 単 一 ． の 発 酵 系 生 菌 製 剤 と 比 較 し て 行 っ た 。
2．生菌製剤の腸内細菌叢正常化作用
生 菌 製 剤 の 腸 内 細 菌 叢 に 与 え る 影響 を 乳牛 およ びラ ット 糞便 性微 生物 叢を 用い て 検 討 し た 。 乳 牛 に お い て は ， 発 酵 系生 菌 製剤 を投 与す るこ とに より 対照 区お よぴ 非 発 酵系 生菌 製剤 と比 較し て， 有意 にE． coliの菌 数を 減少 させ ，Streptococcus,ぬー cillus, Bifiめ ぬcterium，Lactobacillusを 有意 に増 加さ せて いた 。ま た， 非発 酵 系 生 菌 製 剤 で も 対 照 区 と 比 較 し て ，ぬcillus，Bifidobacterium，Lactobacillusの 有 意 な 増 加 が み ら れ た 。Closteridiumに つい ては 発酵 系生 菌製 剤で 非発 酵系 生菌 製 剤 よ り 有 意 な 減 少 を 示 し た 。 ラ ッ トに お いて は， 基本 飼料 群お よぴ 高脂 肪・ 高コ レ ス テ ロ ー ル 飼 料 群 と も に 発 酵 系 生 菌 製 剤 がE． coliを 減 少 さ せ ，Streptococcus, Bif idobacterium，Eubac teriuru，Lactobacillusを有意に増加させることを確認した。
と くに ，高 脂肪 ・高 コレ ステ ロー ル 飼料 群に おい てそ の効 果は 顕著であった。また，
高 脂 肪 ・ 高 コ レ ス テ ロ ー ル 飼 料 群 の生 菌 製剤 投与 区で ，田ostridiuru，Bacteroi― daceae，Megashaeraの 有 意 な 減 少 を明 ら かに した 。高 脂肪 ・高 コレ ステ ロー ル負 荷 は ， 腸 内 細 菌 叢 を 悪 化 さ せ る の に 対し て ，生 菌製 剤を 投与 する こと によ り有 用菌 の 増 加 ， 有 害 菌 の 減 少 が み ら れ ， 腸 内細 菌 叢全 体の バラ ンス が改 善さ れて いる こと が 示 唆さ れた 。生 菌製 剤中 に存 在し な いBif idobacterium，EubacteriuLrrhs腸内におい て 顕 著 に 増 加 し て い る こ と を 解 明 する こ とは ，腸 内細 菌叢 の相 互作 用が ，生 菌製 剤 を 介 し て ど の よ う な 機 構 で 作 用 し てい る かを 解き 明か す端 緒と なり ，今 後の 重要 な 研究テーマとなろ う。
3．生 菌製 剤の 脂質 代謝 改善 作用
生 菌製 剤 とし て今 回開 発し た複 合系 の発 酵系 生菌 製剤 と米 ヌカ に 吸着 させた非発 酵系 生菌 製 剤を 用い ，乳 牛お よび 豚に 投与 する こと によ り， それ そ れ乳 およびロイ
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ン部位の肉中のコレステロールへの影響について検討した。乳においては発酵系生 菌製剤を投与することにより，コレステロールは対照区より有意に減少することが 確認されたが，非発酵系生菌製剤と比較して有意な差は得られなかった。また，非 発酵系生菌製剤は対照区よりわずかに低下している程度であった。豚肉中のコレス テロールを比較すると，発酵系生菌製剤を投与することにより，対照区およぴ非発 酵系生菌製剤投与区より有意に低下していることが確認された。ラットを用いた試 験では，給与飼料はコレステロールを負荷した飼料および負荷しない飼料のニつの 実験系で行った。発酵系生菌製剤は，コレステロールを負荷したときに，血清脂質
（総コレステロール，VLDL+IDL+LDL−コレステロール，中性脂肪，遊離脂肪酸）の低 下作用 ，とくに総コレステロールについては3種類で構成された発酵系生菌製剤お よぴ殺菌された生菌製剤より有意に低下，肝臓へのコレステロール蓄積抑制作用お よび糞便中への中性ステロール，胆汁酸の排泄促進作用を有することを示した。し かし，本実験条件下ではこれまでコレステロール低下作用があるといわれている工・
acidophil us，nfaecalisに顕著な効果はみられなかった。また，発酵系生菌製剤
（以下生菌製剤）のその効果発現は，肝臓においてコレステロール合成の律速酵素 であるHMG―CoA reductase活性の低下と，Cholesterol 7a−hydroxylase活性には変 化がみられないことおよぴむvi troの実験でコレステロール，胆汁酸が生菌製剤菌 体との吸着作用によルミセル形成を阻害していることから，コレステロール合成阻 害および排泄促進が密接に関与していると示唆された。このことは血清コレステロ ール濃度と肝臓コレステロール濃度間の正の相関，血清コ．レステロール濃度と糞便 性コレステロール濃度間および肝臓コレステロール濃度と糞便性コレステロール濃 度間の負の相関関係からも支持された。また，血清中のVLDL+IDL+LDL―コレステロー ル濃度の低下は，アボリボプロテインB―100の合成阻害，HDLからVLDLへのコレステ ロールエステルの転換の抑制およぴLDLレセプターが増加している可能性が考えられ る。肝臓中の主なりン脂質であるホスファチジルコリンの脂肪酸組成で，生菌製剤 がりノール酸の減少，アラキドン酸の増加を促していることから，リノール酸から の不飽和化酵素であるA6―desaturase活性についてもその活性を上昇させている可能 性が示唆された。
以上の結果から，生菌製剤の脂質代謝改善作用が確認された。12種類の微生物を 混合させた生菌製剤と14種類の微生物を混合させた生菌製剤とでは同様に血清中の コレステロールを低下させる作用が認められ，その発現機構も肝臓におけるコレス
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テロール合成抑制および腸管からのステロールの排泄促進と類似しており，基本的 に同様の効果を持つ生菌製剤であると考えられる。また，複数の微生物を米ヌカ等 有機資材上で発酵させて用いた方が単一微生物を用いるよりもラット生体内におい て，より高いコレステロール低下作用を有することが明らかとなった。しかし，肝 臓におけるコレステロール合成酵素の阻害が生菌製剤によるものかもしくはバラン スが改善された腸内細菌叢によるものか，また，不飽和化酵素の活性化についてそ の発現機構を探求することは，今後の重要な課題である。
以上のように，今回開発した複合系生菌製剤は，各種の生理的効果を有する生菌 製剤であることが示された。乳酸菌，枯草菌，納豆菌，酪酸菌，酵母等の混合物で ある複合系生菌製剤は，高コレステロール負荷条件下において従来からの乳酸菌を 中心とした生菌製剤と比べると，飼料効率の増加が認められ，腸内細菌叢全体のバ ランスを改善していることが明らかとなった。また，生菌製剤の脂質代謝改善作用 をみると，コレステロールの低下作用および脂肪酸の不飽和化作用が確認された。
その効果発現は，生菌製剤および活性化された腸内細菌叢の両方かまたはどちらか 一方によって，コレステロール合成阻害およぴ排泄促進の可能性が示唆された。し かし，腸内細菌叢は複雑な系をしており，今後，活性化された腸内細菌叢と脂質代 謝との関係を解明することは，重要な課題である。
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学位論文審査の要旨 主査
副査 副査 副査
教授 教授 教授 助教授
学 位 論 文 題 名
生菌製剤 投与に よるラッ トの脂質代謝に関する研究
本 論 文は ， 総 頁数121ぺ ージの 和文論 文で，表33，図13， 模式図1，引 用文献193を 含み，12章で構成 されて いる。別 に参考 論文16編が 添えら れている。
生 菌 製 剤は 抗 生 物質 に 代 わるもの として 関心が高 まって おり，数 多くの生 菌剤が 開発・生産されている。
本研究 は，腐植 土壌か ら分離し た複数のBacil lus，Lactobacillus，Streptococー cus， 引os tr idium，馳ccharoruyces，Candi出で構成された複合系の生菌製剤につい て 乳牛 ， 豚 ，ラ ッ ト を 用い た実験系 で，生 菌製剤と しての栄 養生理 的効果を 確認す ること を目的 としたも のであ る。また ，様々 ナょ角度 から生菌製剤の効果発現の解明 を試み ている 。
本研 究で得ら れた成果 を要約 すると以 下の通 りである 。
1． 生 菌 製剤 の 微 生物組成
生菌 製剤の 構成微生 物はBacillus subとilis，ぢ．naとto，占 ．megaterium，ぢ ・ thermophiJ us，Lactobacillus acidophilus，E．」olan tar um，E．brevis，E．casei， ざtrepとococcus faecalis，ざ， 1actis，S． the.rmophil us， Clostridium butyricum， 馳ccharoLrU′ces cerep risiae，Candi出uとilゴsである。これら複数の微生物を米ヌカ にそ れそれ10 ー8cfu/gに なるよう に発酵し て調製 した。ま た，比 較実験の ために ， ビ． butyricumおよび 口．thermophilusを除いた12種類の微生物を米ヌカ上で調製した 発 酵 系生 菌 製 剤は ， 微 生物 を 米 ヌ カに 吸 着 させ た の みの非発 酵系生 菌製剤， 殺菌し た 発 酵系 生 菌 製剤 ，Bacillus subtilis，Lactobacillus plantarum，E．acidophilus
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則
守
男
博
隆
房
西 間
田
葛 本
冨 原
の3種類で構成された発酵系生菌製剤と比較し，ビ．butyr icumおよびぢ．舶erlUophilus を加 えて14種類で構成された発酵系生菌製剤は，Z．acidophil usおよぴnfaecalis を そ れ そ れ 米 ヌ カ 上 で 発酵 さ せ た単 一 の 発酵 系 生菌 製 剤 と比 較 して 行 っ た。
2．生菌製 剤の腸内 細菌叢正 常化作用
． 生菌製 剤の腸内細菌叢に与える影響を乳牛およびラット糞便性微生物叢を用いて 検討した。乳牛においては，発酵系生菌製剤を投与することにより対照区および非 発酵系生菌製剤と比較して，有意にビ．coliの菌数を減少させ，Streptococcus，Baー cil lus，Bif idobacterium，Lactobacil lusを有意に増加させていた。また，非発酵 系生菌製剤でも対照区と比較して，ぬcillus，Bifidobacterium，Lactobacil lusの 有意な増加がみられた。甜ostridiumについては発酵系生菌製剤で非発酵系生菌製剤 よ り有意な 減少を示した。ラットにおいては，基本飼料群およぴ高脂肪・高コレス テロール飼料群ともに発酵系生菌製剤がF，coliを減少させ，Streptococcus，Bi ido ‑ bac terium，Eubac terium，Lactobacillusを有意に増加させることを確認した。とく に ，高脂肪 ・高コレステロール飼料群においてその効果は顕著であった。また，高 脂肪・高コレステロール飼料群の生菌製剤投与区で，甜ostridium，Bacteroidaceae， Megashaeraの 有意な減少を明らかにした。高脂肪・高コレステロール負荷は，腸内 細 菌叢を悪 化させるのに対して，生菌製剤を投与することにより有用菌の増加，有 害菌の減少がみられ，腸内細菌叢全体のバランスが正常化されていることが示唆され た。
3．生菌製剤の脂質代謝改善作用
生菌製剤として今回開発した複合系の発酵系生菌製剤と米ヌカに吸着させた非発 酵系生菌製剤を用い，乳牛および豚に投与することにより，それそれ乳およぴ口イ ン部位の肉中のコレステロールへの影響について検討した。乳においては発酵系生 菌製剤を投与することにより，コレステロールは対照区より有意に減少することが 確認されたが，非発酵系生菌製剤と比較して有意な差は得られをかった。また，非 発酵系生菌製剤は対照区よりわずかに低下している程度であった。豚肉中のコレス テロールを比較すると，発酵系生菌製剤を投与することにより，対照区およぴ非発 酵系生菌製剤投与区より有意に低下していることが確認された。ラットを用いた試 験では，給与飼料にコレステロールを負荷した飼料および負荷しない飼料のニつの
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実験系で行った。発酵系生菌製剤は，コレステロールを負荷したときに，血清脂質
（総コレステロール，VLDL+IDL+LDL−コレステロ―ル，中性脂肪，遊離脂肪酸）の低 下作用，とくに総コレステロールについては3種類で構成された発酵系生菌製剤およ ぴ殺菌された生菌製剤より有意に低下，肝臓へのコレステロール蓄積抑制作用およ び糞便中への中性ステロール，胆汁酸の排泄促進作用を有することを示した。しか し，本実験条件下では，これまでコレステロール低下作用があるといわれている工・
acidophilus，nカecali釧こ顕著な効果はみられなかった。また，発酵系生菌製剤
（以下生菌製剤）のその効果発現は，肝臓においてコレステロール合成の律速酵素 であるHMG−CoA reductase活性の低下と，Cholesterol 7a−hydroxylase活性には変 化がみられないことおよぴin vitroの実験でコレステロール，胆汁酸が生菌製剤菌 体との吸着作用を有することから，コレステロール合成阻害およぴ糞便中への排泄 促進が密接に関与していることが示唆された。このことは血清コレステロール濃度 と肝臓コレステロール濃度間の正の相関，血清コレステロール濃度と糞便性コレス テロール濃度間および肝臓コレステロール濃度と糞便性コレステロール濃度間の負 の相関関係からも支持された。肝臓中の主要なりン脂質であるホスファチジルコリ ンの脂肪酸組成において，生菌製剤がりノール酸の減少，アラキドン酸の増加を促 していることから，リノール酸からの不飽和化酵素である△6−desaturase活性につ いても上昇させている可能性が示唆された。
以上の結果から，生菌製剤の脂質代謝改善作用が確認された。12種類の微生物を 混合させた生菌製剤と14種類の微生物を混合させた生菌製剤とでは同様に血清中の コレステロールを低下させる作用が認められ，その発現機構も肝臓におけるコレス テロール合成抑制および腸管からのステロールの排泄促進と類似しており，基本的 に同様の効果を持つ生菌製剤であると考えられる。また，複数の微生物を米ヌカ等 有機資材上で発酵させて用いた方が単一微生物を用いるよりもラット生体内におい て ， よ り 高 い コ レ ス テ ロ ー ル 低 下 作 用 を 有 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。
以上，今回開発した複合系の生菌製剤を用いたラット試験で，生菌製剤の新しい 現象を数多く見いだし，それらの効果発現の解明を進めたことは高く評価される。
よって，審査員一同は，別に行った学力確認試験の結果と合わせて，本論文の提出 者，福島道広は博士（農学）の学位を受けるのに十分な資格があるものと認定した。
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