博 士 （ 薬 学 ） 岩 本 真 幸
学 位 論 文 題 名
光 受容 夕ン パ ク質 ファラオニスフォボ ロドプシンの光化 学反応 学 位 論 文 内 容 の 要 旨
ファ ラ オニ スフ ォボ 口ド プ シン(ppR)は古細菌Natronobacterium phariロomsの細胞 膜 に 存在 し 、レ チナ ール を発 色 団と して内包する光受容夕ン バク質（レチナールタンパ ク 質 ）の 一 種で ある 。ppRは この 細菌 の 光刺 激に 対す る走 性 （走光性）を司る光センサ ー と して 機 能し てい る。 古細 菌 のレ チナ ール タン パ ク質 には 大きく分けてppRの様に光 情 報 伝達 を 行な うも のと 、光 駆 動型 プ口卜ンポンプとして広 く知られているバクテリオ ロ ド プシ ン(bR)の様 に光 エネ ル ギー 変換 を行 なう も のが 存在 する が 、ア ミノ 酸配 列や 立 体 構造 の 相同 性が 非常 に高 い これ らのタンパク質が全く異 なる機能を持つことは、構 造 と 機能 の 観点 から 大変 興味 深 い事 実である。また、すぺて の古細菌型レチナールタン パ ク 質は 光 受容 後、 発色 団の 異 性化 に続き構造や吸収波長の 異なる複数の光中間体を経 て 基 底状 態 に戻 るサ イク リッ ク な光 化学反応（フォトサイク ル）を示し、この間に各機 能 を 発現 す る。bRに つい ては 、 プ口 トン輸送機構や光中間体 の立体構造などがこれまで に 詳 細に 研 究さ れて きた 。一 方 、光 センサーとして機能する レチナールタンパク質につ い て は、 菌 体で の発 現量 や安 定 性な どの問題から研究が比較 的遅れており、古細菌型レ チ ナ ール タ ンバ ク質 の機 能分 化 機構 を理解するには至ってい ない。本研究では、大腸菌 で の 発現 が 可能 で比 較的 安定 性 の高 いppRを 光セ ンサ ーの モ デルとして用い、機能発現 時 に 示す フ オ卜 サイ クル を、 分 光学 的、または電気化学的な 手法などにより詳細に解析 し た 。そ し て、 光セ ンサ ーに 特 徴的 な分子内現象、またはそ れに関与するアミノ酸残基 を 特定し 、古細菌型レチナールタンパ ク質の機能分化機構を推察 することを・目的とした。
具 体的 に 、光 セン サー はシ グ ナル 伝達に関与する中間体構 造を維持するために遅いフ オ 卜 サイ ク ルを 、光 駆動 型イ オ ンポ ンプは単位時間当たりの イオン輸送効率向上のため に 速 いフ ォ トサ イク ルを それ ぞ れ示 すが、両者のフォトサイ クル速度の違いはどの様な 分 子 機構 に よっ て生 み出 され て いる のか？そして、光センサ ーの機能発現時の構造変化 に は 、光 駆 動型 イオ ンポ ンプ と 比較 して どの 様な 特 徴が ある のか?という観点から解析 を 進めた 。
｀ppRとbRの ア ミ ノ 酸 配 列 を 比 較 す る と 、bRの フ ォ ト サ イ ク ル 中 の 分 子 内 プ ロ ト ン 移 動に 重要 なア ミ ノ酸 残基 のい くつ か が、ppRでは 保存 され てい な い。 そこ で、 これ ら 分 子内 プロ トン 移 動に 重要 なア ミノ 酸 残基 をppRに 導入 した 変異 体 を作 製し 、そ のフ オ 卜 サ イク ル 速度 に及ぽす 影響を解析した。その結果、 両者のフォトサイクル速度 の違いは、
MやOと 呼 ば れ る 光 中 間 体 崩 壊過 程で の分 子 内プ ロ卜 ン移 動速 度 の違 いに 由来 する こ と が 明ら か にな った 。そ し て、 各光 中間 体の 崩 壊過 程で は、 以下 に示す分子機 構により速 度の違いが生み出 されていると考え睦れる。ま―空L．OPR．の86番目の位置に、M崩壊過程―
で 活 性 中 心 シ ッ フ 塩 基 へ の プ 口 ト ン ド ナ ー と な るbRのAsp96に 対応 する 様な 酸性 ア ミ
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/酸残基が無いこと、さらに、そこからシッフ塩基までのプロ卜ン移動経路となる水素 結合ネットワークがbRの様に存在しないため、細胞質側領域のプロトン移動速度が非常 に小さいことが、ppRの遅いM崩壊の原因となっている。また、ppRの細胞外側表面付 近の182、183、そして194番目の位置に解離性または極性アミノ酸残基が無いことによ って、Asp75からその領域へのプ口トン移動がbRより起こりにくく、O崩壊速度の低下 をきたす原因のーつとなっている。これらの結果は、光センサーppRのフオ卜サイクル においても、光駆動型プ口トンポンプbRと同様の分子内プロトン移動が起きている可能 性を示唆するものであった。そこで次に、ppRを膜に発現した大腸菌から反転膜ベシク ルを調製し、光照射に伴うppRのプロトン輸送能を検討した。その結果、ppRもフォト サイクル中に細胞質側から細胞外側へのプ口トン輸送活性を示すことが明らかになっ た。さらに、Sf102電極を用いたフォトサイクル中のプ口トン授受機構の解析や、夕ンバ ク質中心部のシッフ塩基と、そこから細胞外側方向へ約14A離れて位置するAsp193と の相互作用解析から、シッフ塩基から細胞外側領域へは分子内相互作用ネットワークが 存在し、bRと同様、このネッ卜ワークを介してフォトサイクル中に分子内環境変化が伝 播することが示唆された。
また、ppRがフォトサイクルで示す構造変化について、以下の検討を行なった。まず、
シッフ塩基と反応する水溶性試薬を用い、両者の反応性を解析した。その結果、基底状 態と比較してM中間体のシッフ塩基との反応性が著しく高かった。つまり、ppRのM中 間体では、夕ンパク質外部からタンパク質中心部のシッフ塩基まで水溶性試薬が到達可 能な状態に構造変化しており、bRで知られているフォトサイクル中のへりックス細胞質 側の開きに対応した動きが、ppRでも存在する可能性が示唆された。また、フーリエ変 換赤外分光法によって、光中間体の赤外吸収スペクトル解析を行なった。測定にはF86D、 E変異体を用い、野生型スベク卜ルとの比較を行なったところ、ppRの細胞質側領域の 特に86番目のアミノ酸残基周辺がフォトサイクル中に示す構造変化は、bRと類似して んゝることが示唆された。
以上の研究から、フォトサイクル中の分子内プ口トン移動は、古細菌型レチナールタ ンパク質に共通して備わった性質であることが明らかになった。また興味深いことに、
機能が全く異なる古細菌型レチナールタシパク質においても、それぞれの機能を発現す るために利用しているタンパク質構造変化は共通していることが示唆された。そしてこ の構造変化の制御には、分子内プロトン移動速度が重要な役割を果たしていると考えら れる。具体的にppRでは、本研究で着目した様な、細胞質側領域や細胞外側表面付近に おけるアミノ酸残基のbRとの違いが、光センサーに特徴的な遅いフォトサイクルを示す 主要因であり、シグナル伝達に関与する光中間体構造の維持に貢献しているものと考え られる。
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学 位 論 文 審 査 の 要 旨 主 査 教 授 加 茂 直 樹 副 査 教 授 稲 垣 冬 彦 副査 助 教授 森 岡弘 志 副査 助 教授 三 宅教 尚
学 位 論 文 題 名
光受容夕ンパク質ファラオニスフォボロドプシンの光化学反応
バ ク テ リ ア の ロ ド プ シ ン （ 古 細 菌 型 レ チ ナ ー ル タ ン パ ク 質 と 称 せ ら れ る ） は 大 き く4種 類 が 知 ら れ て い る ， そ れ ら は バ ク テ リ オ ロ ド プ シ ン(bR)， ハ ロ ロ ド プ シ ン(hR)， セ ン ソ リ ー ロ ド プ シ ン(sR)， お よ び フ ォ ボ ロ ド プ シ ン(pR) で あ る ． こ れ ら は 全 て 一 次 構 造 が明 ら か にさ れ て おり ， お 互い に 相 同 性が 高 い ． ま た ， 立 体 構 造 も よ く 似 て お り ，7本 の 膜 貫 通 ヘ リ ッ ク ス （A〜G） か ら 成 り ， Gヘ リ ッ ク ス の 膜 の 真 中 あ た り に 位 置 す る り ジ ン 残 基 に ， レ チ ナ ー ル が シ ッ フ 塩 基 を 介 し て 結 合 し て い る ． し か し な が ら ， こ れ ら4種 の レ チ ナ ー ル タ ン パ ク 質 は 機 能 分 化 が 起 こ っ て い る ， す な わ ち ，bRは 光 駆 動 プ ロ ト ン ポ ン プ ，hRは 光 駆 動 塩 化 物 イ オ ン ポ ン プ ，sRとpRは 菌 の 光 に 対 す る 行 動 （ 走 光 性 ） の 光 セ ン サ ー で あ る ． bRの1残 基 を 変 異 さ せ る と 塩 化 物 イ オ ン ポ ン プ ， っ ま りhRに な る こ と が 知 ら れ て い る ． し か し ， そ れ 以 外 の 「 変 換 」 は 知 ら れ て い な い ． 残 基 置 換 に よ る 機 能 変 換 も 興 味 あ る 実 験 で あ る が ， 申 請 者 が 着 目 し た の は ， こ れ ら タ ン パ ク 質 の 光 化 学 反 応 の 類 似性 で あ る． こ こ で光 化 学 反応 と ． は ，レ チ ナ ー ル タ ン パ ク 質 が 光 を 吸 収 し た 時 に 示 す 反 応 で ， 光 照 射 前 （ 基 底 状 態 ） と は 構 造 や 吸 収 波 長 が 異 な る い く っ か の 中 間 体 を 経 由 し ， 基 底 状 態 に 戻 る と い う も の で あ る ． こ の 間 に ， 各 タ ン パ ク 質 の 機 能 が 発 揮 さ れ る ． 申 請 者 は ， 光 化 学 反 応 の 類 似 性 か ら ， 光 照 射 に 伴 っ て タ ン パ ク 質 分 子 内 で プ ロ ト ン の 移 動 が あ る の で は な い か ， そ し て ， こ の プ ロ ト ン 移 動 がbRで は 直 接 的 に 輸 送 さ れ 、hRで は 塩 化 物 イ オ ン 輸 送 に 変 換 さ れ （ 機 構 は よ く 分 か っ て い な い ） ， セ ン サ ー で は 構 造 変 化 に 変 換 さ れ て い る の で は な い か， と い う発 想 か ら研 究 を 進め て い る ．っ ま り ， 少 数 の キ ー ア ミ ノ 酸 残 基 が あ り ， こ の 変 異 に よ っ て ， 光 照 射 に よ る プ ロ ト ン 化 シ ッ フ 塩 基 か ら プ ロ ト ン が 移 動 す る 反 応 を ， 巧 み に 使 い 分 け て い る の で は な い か と い う ア イ デ ア の 検 証 で あ る ． 申 請 者 は 研 究 材 料 と し て ，pRと 同 じ 機 能 を 持 っ が ， よ り 安 定 で ， か つ 大 腸 菌 で 大 量 発 現 が 可 能 で あ る フ ァ ラ オ ニ ス フ ォ ボ ロ ド プ シ ン(ppR)を 選 び ， こ れ ま で に よ く 分 か っ て い るbRの 光 化 学 反 応 と の 類 似 点 ， 相 違 点 を 明 ら か に し よ う と し た ．
本 学 位 論 文 は ，3つ の パ ー ト に 分 け る こ と が で き る ． ま ず ，bRとppRの 光 化 学 反 応 を 比 較 し た 時 ， 生 成 す る 中 間 体 は 類 似 し て い る も の の ， そ の 速 度 は 大
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