博 士 （ 農 学 ） 萩 原 優 香
学 位 論 文 題 名
Tobacc0 7nosaz,c t)zrr/ts の製に関与する宿主およびウイルス タ ンパ ク 質の 細胞 内 局在 性に 関 する 研究
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
ウ イルス は，限ら れた遺 伝情報の みをコ ードする 核酸(DNAあ るいはRNA)と それを 保 護する外殻としてのタンパク質，一部のものはさらにエンベロープをもつ感染因子である．
ウイルスは，自らがコードするタンパク質に加え，宿主細胞内の様々な因子を利用し，細 胞の機能に依存して巧みに自己増殖する，宿主因子に関する詳細な情報は，ウイルスの感 染・増殖機構を知り，それに対抗する手段を見出す上で非常に重要である，現在宿主因子 の解析は徐々に進んでいるが．，ウイルス増殖機構の解明には，その情報量はまだ十分とい うにはほど遠い，
多数あるウイルス種をそのゲノムの特徴により分類すると，大半を占めるのは，メッセ ン ジ ャ ーRNAと して 機 能 する 極性のRNAをゲ ノムとし てもっ プラス鎖RNAウイ ルスで あ る ，プラ ス鎖RNAウイル スは，自 身のゲノ ムを複 製する際 に，ゲ ノムRNAの相補 鎖とな る マイナ ス鎖RNAを合成 し，それ を鋳型に ゲノムRNAを合 成する ．ニの過 程には 宿主細 胞内の膜構造が関わっていることが知られている，
タ バコモ ザイクウ イルス(TMV)は， プラス 鎖RNAウ イルス の一種で あり，ウ イルス 粒 子 は 一 種類 の 外 被 タン パ ク質 と一本鎖 ゲノムRNAから なる．TMVのRNAゲノム は，130K タンパク質とその終止コドンのりードスルーにより合成される180Kタンパク質，ウイルス 細 胞問移 行に関与 する30Kタンパ ク質，そして外被タンパク質の4つのタンパク質をコー ド する． TMV RNAの 複製も他 のプラス鎖RNAウイルス同様，細胞内膜上で行なわれると 考えられる．しかしながら，複製に関わる2つのウイルスタンパク質（130K/180K複製タン パク質）は，そのアミノ酸配列から膜タンパク質ではないと推定され，したがってTMV RNA 複 製 複 合 体 が ど の よ う に 膜 ヘ 結 合 し て い る の か は 明 ら か で な か っ た ， 本 研究室では，TMVの増殖が低く抑えられるシロイヌナズナ突然変異株を用いた遺伝学 的 手法に よりこれ までに ，TMV RNAの 複製に 関与する と考え られる3つの膜 タンパ ク質 (TOM1，TOM2A，TOM3)が 同 定 さ れた ． こ れら は い ず れも ， 細 胞内 に お いてTMV RNA の複製を助けるような機能をもつ宿主因子であると考えられる．また，タバコやトマトに も ，TOMI，TOM2A，TOM3の ホモ ログが 存在する ことが明 らかに なり，そ れぞれ クロー ン 化され ている． 予測さ れるアミ ノ酸配列 から，TOM1とTOM3は非 常に類似 性が高 く，
ど ちらも7回膜 貫通型， そしてTOM2Aは4回膜 貫通型の タンパク質であると考えられる，
こ れまで に，酵母 を用い た解析により，TOM1およびTOM3は，TMVがコードする130K/180K 複 製タン パク質のRNAヘ リケース 様ドメインと相互作用すること，そしてTOM1と1、OM2A −1262―
が相 互作 用す るこ とが 示唆 され ている．以上のことを踏まえると，TOM1，TOM2A，TOM3 宿主 因子 は，TMVの 増殖 過程 にお いて ，TMV RNA複製 複合 体構成因子を複製の場である 膜 上 に っ な ぎ 止 め る ア ン カ ー と し て 機 能 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ る ． 本 研 究 は ， 宿 主 因 子TOM1，TOM2A，TOM3の 細 胞 内 局 在 性 ， そ し てTMV 130K/180K 複製タンパク質の局在との関連性を解明することにより，TOMタンノくク質の機能を探るこ とを目的とする．そのためにまず，オワンクラゲ由来のgreen fluorescent proteinあるいはそ の変異体をレポーターとして用いることにより ，植物細胞内でのTOMタンパク質の局在を 解析した．これは生細胞を用いた方法であるため，細胞が本来の膜構造を保持した状態で 局在を解析できるという利点をもつ一方で，TOMタンパク質とレポーターとを融合させる ことによる局在への影響を否定できない．この問題をのり越えるために，イオディキサノ ール を媒 体と して 細胞 内の 膜を 浮遊密度の違いにより分画し，抗TOMI，抗TOM2A抗体な どの 各種 抗体 を用 いて ，TOMタン パク 質やTMVに コー ドさ れる130K/180K複製 タン パク 質の 分画 パタ ーン を解 析し た． さらに，それぞれの画分が含むTMV RNA合成活性を解析 した．これにより，タンパク質が本来の構造を保ったままで細胞内のどの膜に局在するの か ， そ し てTMV RNA複 製 複 合 体 の 局 往 とTOMタ ン パ ク 質 の 関 係 を 明 ら か に で き る ． TOMとレポーター の融合タンパク質を植物細胞内で一過的に発現させ，共焦点レーザー スキャン顕微鏡により解析した結果，TOM1およ びTOM2Aは液胞膜と思われる膜構造体に，
そし てTOM3はゴルジ体に局在した．また，タバコBY‑2培養細胞を形質転換することによ り，これら融合タンパク質をBY‑2細胞内で恒常 的に発現させた結果，TOM1，TOM2A，TOM3 はい ずれ も液 胞膜 と思 われ る膜 構造体に局在した．TOM1およびTOM2Aは，液胞膜を染色 する螢光マーカーと共局在したことから，どちらも液胞膜に局在する膜タンパク質である ことが示された，すなわち，一過的発現系および形質転換BY‑2細胞を用いた解析のどちら に お い て も ，TOM1と TOM2Aが 液 胞 膜 タ ン パ ク 質 で あ る 可 能 性 が 示 さ れ た ． イオディキサノール密度勾配遠心法を用いて植物細胞内の膜を分画し，各種抗体を用い て 解 析 し た 結 果 ，TOM1，TOM2A， そ し て タ バ コTOMホ モ ロ グ(NtTOMl，NtTOM2A)は いず れも 液胞 膜に 富む 画分 に多 く存 在 した ．さ らにTOM1およびNtTOMlは，小胞体やゴ ルジ 体を 多く 含む 画分 にも 比較 的多く検出された．また，TMV感染BY‑2細胞を同様に解 析し た結果，TMVの130K/180K複製タンパク質は， 可溶性タンパク質に富む画分に最も多 く検出されたものの，膜画分内に存在するものに関しては，液胞膜画分と小胞体などを含 む画分に多く検出された，っまり，膜画分内に おける130K/180K複製タンパク質の分画パ タ ー ン は ，NtTOMlの パ タ ーン と似 て いた ．さ らに ，各 画分 に含 まれ るTMVのRNA依 存 RNAポリ メ レー ス活 性を 調べ た結果，活性の分布 パターンはNtTOMlのものと似ていた，
130K/180K複製タンパ ク質が最も多く含まれた可溶性タンパク質画分には，RNAポリメレ ース活性は検出されなかった．
レポーターとの融合タンパク質を用いた顕微鏡解析，そして細胞分画法を用いた解析に よ り ，1）TOM1お よ びTOM2Aは 主 に 液 胞 膜 に 局 在 す る タ ン パ ク 質 で あ り ， ま たTOM1 は液 胞膜 とは 異な る膜 にも 局在 すること，2）少 なくともTOM1が存在する画分に，活性 を有 するTMV RNA複 製複 合体 も存在すること，の 二点が示された，これは，少なくとも TOM1が，TMV RNA複 製複 合体 を膜にっなぎ止める アンカーとしての役割をもつ，という 可能性を強く示唆するものである．
―1263ー
