博 士 論 文 概 要
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(2) DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 に つ い て 、 1 977 年 に ジ デ オ キ シ 法 が サ ン ガ ー ら に よ っ て 開 発 さ れ た 。 現 在 は 耐 熱 性 DNA Poly mera se を 用 い た サ イ ク ル シ ー ク エ ン ス （ CS ） 法がそ の主 流と なっ てお り、 学術 研究 にお ける 利用 のみ なら ず、 臨床 診断 分野 に も 広 く 利 用 さ れ て い る 。 し か し 、C S 法 に は 以 下 に 示 す よ う に 解 決 す べ き 問 題 点 が あ る 。 第 一 に 、 PC R 産 物 の D NA シ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 う 場 合 、 PC R 産 物 中 の deoxyr ibon ucle ic a cid t riph osph ate (dNT P)や PCR プ ラ イ マ ー の 不 活 性 化 が 必 要 である が、 この 操作 は処 理時 間の 増加 に加 え、 煩雑 かつ コス ト増 の要 因と なっ て い る 。ま た 、P C R 産 物 中 に は 未 反 応 の d N T P や P C R プ ラ イ マ ー が 残 存 し 、正 確 な シ ー ク エ ン ス 解 析 を 困 難 に す る 要 因 と な っ て い る 。 第 二 に 、C S 法 は 原 理 上 必 ず 専 用 機器に よる 温度 変化 を必 要と する ため 、温 度変 化に 伴う 時間 的ロ スが 大き く、 反 応 時 間 の 大 幅 な 短 縮 が 困 難 で あ る 。 第 三 に 、C S 法 を 利 用 し て D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 を 行 っ た 場 合 、 G C 含 量 が 多 い （ G C リ ッ チ な ）D N A 領 域 な ど は 解 読 不 能 と な る こ と が 多 い 。 以 上 を 背 景 と し て 、C S 法 と は 原 理 が 異 な る 新 規 な D N A シ ー ク エ ン ス 解 析の方 法と 技術 が求 めら れて いた 。 本 論 文 に お い て は 、 大 腸 菌 フ ァ ー ジ T7 由 来 の T7 RNA Poly mera se（ T7 R NAP ） を 用 い た i n vi tro 転 写 反 応 を ジ デ オ キ シ 法 へ 応 用 し 、 C S 法 の 持 つ 問 題 を 解 決 す る 新 規 な DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 法 と し て の 「 転 写 シ ー ク エ ン ス （ T S） 法 」 の 開 発 を 目 的 と し て 研 究 を 行 い 、 そ の 成 果 を ま と め た 。 具 体 的 に は 、 T7 RNA P に よ り ジ デ オ キ シ 反 応 を 行 う た め に 必 要 な 蛍 光 標 識 3' -deo xynu cleo side tr ipho spha te （蛍 光 ター ミ ネ ータ ー ） の開 発 と 蛍光 タ ー ミネ ー タ ーの 取 り 込み 活 性 が 上昇 した T7 R N A P 変 異 体 の 開 発 を 行 い 、T S 法 の 効 率 的 な 実 施 に 必 要 な 試 薬 類 の 開 発 に 成 功 し た 。 さ ら に 、未 精 製 P C R 産 物 が 解 析 で き る こ と 、C S 法 と 比 べ 反 応 時 間 の 大 幅 な 短 縮 が で き る こ と 、 GC リ ッ チ な DNA 領 域 の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 が 可 能 な こ と を 示 し 、 CS 法 を 凌 駕 す る 新 規 方 法 と し て の TS 法 の 特 長 を 示 し た 。 第 １ 章 で は 、C S 法 に よ る D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 法 の 原 理 を 概 説 す る こ と に よ り 、 解決す べき 問題 点を 明ら かに して 、本 研究 の意 義と 目的 を明 らか にし た。 第２ 章で は、 本研 究で 用い た主 な実 験方 法に つい て説 明し た。 すな わち 、プ ラ ス ミ ド D N A の 抽 出 、D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 方 法 、P C R な ど に よ る 遺 伝 子 増 幅 方 法 な どにつ いて 記述 した 。 第 ３ 章 で は 、 T7 R NAP の 基 質 と し て 認 識 可 能 な 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 開 発 を 行 っ た 。蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー は 、T 7 R N A P の 基 質 と し て 認 識 さ れ 、R N A 鎖 に 取 り 込 ま れ た 場 合 、 DNA Po lyme rase の 場 合 の ddNTP と 同 様 に 、 反 応 終 結 を 引 き 起 こ す も の で あ る 。 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー と し て 、 DNA シ ー ク エ ン サ ー に お い て 異 な る 蛍 光 と し て 検 出 可 能 で あ る 4 種 の 蛍 光 体 6 - c a r b o x y t e t r a m e t h y l r h o d a m i n e （ T M R ）、 6-carb oxy. X - r h o d a m i n e （ R O X ）、 5 - c a r b o x y. r h o d a m i n e 6 G （ R 6 G ）、 5 - c a r b o x y. r h o d a m i n e 1 1 0 ( R 1 1 0 ) を 3 ' - d U T P 、3 ' - d C T P 、3 ' - d A T P 、3 ' - d G T P に そ れ ぞ れ 付 加 し た TMR-3' -dUT P(Dy e-U) 、 RO X-3' -dCT P(Dy e-C) 、 R6G -3'- dATP (Dye -A), R11 0-3' -dGT P 1.
(3) (Dye-G )の 構 築 を 行 っ た 。 構 築 し た 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー が 、 T7 RN AP の 基 質 と な り う る の か ど う か に つ い て 、 T 7 R N A P を 用 い た in vi tro 転 写 反 応 へ 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー を 添 加 し 、 RNA 産 物 由 来 の 蛍 光 シ グ ナ ル を DNA シ ー ク エ ン サ ー で 検 出 す る こ と に よ り 検 討 し た 。 Dye- U お よ び Dye- G で は 、 シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル が 検 出 さ れ た が 、 Dye- A お よ び Dye- C で は 検 出 さ れ な か っ た 。 こ れ ら の 結 果 は 、 蛍 光 物 質 に 起 因 す る 何 ら か の 立 体 障 害 に よ っ て T7 R NAP の 転 写 反 応 の 阻 害 が 起 こ っ た こ と を 示 唆 し た 。 そ こ で 、 3' -dNTP と 蛍 光 物 質 間 の リ ン カ ー で あ る メ チ レ ン 鎖 (CH2 )長 を (CH2) 1 か ら (CH 2)4 に 変 更 し た と こ ろ 、 Dy e-A( n=4)と Dye- C(n= 4)の 両 者 に 、 分 離 し た シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル が 検 出 さ れ た 。 以 上 よ り 、T S 法 に 適 し た 蛍 光 タ ー ミ ネ ー ターの 開発 に成 功し た。 第 ４ 章 で は 、 3'-d NTP の 取 り 込 み に 関 与 す る T7 R NAP の ア ミ ノ 酸 残 基 を 特 定 す る こ と に よ り 、 各 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー の 取 り 込 み が 改 善 し た T7 RNAP 変 異 体 を 構 築した 。第 ３章 の検 討で は、 蛍光 ター ミネ ータ ー由 来の 蛍光 シグ ナル が弱 いこ と に よ る シ ー ク エ ン ス エ ラ ー が し ば し ば 認 め ら れ た 。 こ の 原 因 と し て 、 T 7 RN AP の 示 す 3'-d NTP と NTP に 対 す る 基 質 特 異 性 の 違 い に よ り 、 NTP と 比 較 し て 、 効 率 よ く 蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー が 取 り 込 ま れ て い な い こ と が 推 測 さ れ た 。そ こ で 、 T 7 R N A P の P o l y m e r a s e ド メ イ ン に お い て 、N T P 結 合 に 関 与 す る 部 位 と 考 え ら れ る 領 域 お よ び そ の 近 傍 に 位 置 す る 6 つ の フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン 残 基 を 選 択 し 、 3'- OH 基 と の 相 互 作用部 位の 候補 とし た。 つぎ に、 各フ ェニ ルア ラニ ン残 基の チロ シン 残基 への 置 換 に よ り 、 3'-d NTP と の 相 互 作 用 を 形 成 さ せ る 点 変 異 体 遺 伝 子 を 構 築 し 、 大 腸 菌 におけ るタ ンパ ク質 発現 系を 用い て、 酵素 標品 を得 た。 得ら れた 各酵 素標 品を 用 い 、 pB lues crip t ( p B S ) D N A 由 来 の 線 状 D N A を 鋳 型 と し た [ α - 3 2 P ] U T P 存 在 下 で の 3 ' - d A T P を 添 加 し た in vitro 転 写 反 応 を 行 っ た 。 生 成 し た R N A 産 物 中 の 放 射 活 性 を 測 定 し 、 3' -dATP の 取 り 込 み に つ い て 、 酵 素 種 間 の 違 い を 評 価 し た 。 T7 RNA P F644Y お よ び F6 67Y を 用 い た 場 合 、 野 生 型 T7 RNAP を 用 い た 場 合 と 比 較 し て 、 放 射 活 性 の 値 が 約 2 0 % に 減 少 す る こ と を 見 出 し た 。ま た 、こ の 事 実 は 、F 6 4 4 Y お よ び F667Y の 3' -dATP の 取 り 込 み 活 性 が 野 生 型 T7 RNAP と 比 較 し て 上 昇 し た こ と を 示 唆 し た 。 そ こ で 、 F6 44Y を 用 い て 環 状 pBS DNA を 鋳 型 と し 、 50 μ M. 3 '-dA TP を 添. 加 し て i n v itro 転 写 反 応 を 行 っ た と こ ろ 、 野 生 型 T 7 R N A P よ り も 優 位 に 転 写 終 結 し 、 取 り 込 み 効 率 の 顕 著 な 上 昇 を 示 し た 。 さ ら に T S 法 に お い て も 、F 6 4 4 Y お よ び F 6 6 7 Y の 使 用 に よ り 、蛍 光 タ ー ミ ネ ー タ ー 由 来 の シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル が 上 昇 し 、 シーク エン スエ ラー が減 少し 性能 的に 改善 され たこ とを 確認 した 。 第 ５ 章 で は 、T S 法 に よ る D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 に お い て 、 シ ー ク エ ン ス ピ ー ク の重な りに よる シー クエ ンス エラ ーが 確認 され たこ とを 受け て、 その 解消 を目 的 と し て 検 討 を 行 っ た 。シ ー ク エ ン ス エ ラ ー に つ い て は 、R N A 分 子 内 の 二 次 構 造 が 、 電気泳 動中 に形 成さ れる こと によ り、 分子 量に よる 分離 が困 難に なる ため と考 え ら れ た 。 そ こ で 、 核 酸 分 子 内 に お い て は 、 g uano sine t riph ospha te （ r GTP ） と 比 2.
(4) 較 し て 、 水 素 結 合 を 介 し た 二 重 鎖 形 成 能 が 弱 い in osin e t riph osph ate （ rIT P） や 7-deaz a-gu anos ine trip hosp hate （ c7 -rGTP ） を rGT P と 置 換 す る こ と で 、 二 次 構 造 の 解 消 を 試 み た 。λ フ ァ ー ジ ゲ ノ ム D N A 断 片 お よ び ほ 乳 類 由 来 の c D N A 断 片 を 有 するサ ブク ロー ンを 用い てそ の効 果を 調べ 、シ ーク エン スエ ラー の解 消を 確認 し た 。 さ ら に 、 c7 -rGTP を 使 用 し て 、 ヒ ト 大 腸 が ん 細 胞 株 HT29 の p 53 遺 伝 子 配 列 を 有 す る P CR 産 物 中 に 存 在 す る 点 変 異 (R 274H ) の 正 確 な 解 析 が 可 能 と な っ た 。 同 時 に 、 こ の 解 析 を 通 じ て 、 未 精 製 の PCR 産 物 の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 な こ と を 明 ら か に し た 。 ま た 、 TS 法 お よ び CS 法 に お い て 鋳 型 DNA 量 と シ ー ク エ ン ス 精 度 と の 関 係 を 調 べ 、 DNA 量 が わ ず か な 場 合 で も TS 法 に よ る 解 析 結 果 は CS 法 よ り も 優 れ た シ ー ク エ ン ス 精 度 を 示 す こ と を 明 ら か に し た 。一 例 と し て 、1 , 8 - d i a m i n o o c t a n e の 使 用 に よ り 、 10 n g の 微 量 な DN A か ら も 高 い シ ー ク エ ン ス 精 度 に よ る 解 析 が 可 能とな った 。 第 ６ 章 で は 、 TS 法 と CS 法 の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 反 応 時 間 に つ い て 評 価 を 行 っ た 。T S 反 応 は 、3 7 ℃ の 等 温 反 応 の た め 、 温 調 機 器 が 必 要 な く 、 さ ら に 、 T 7 R N A P は 、 Ta q D N A P o l y m e r a s e と 比 較 し て 伸 長 速 度 が 約 4 倍 速 い こ と か ら 、 C S 反 応 と 比 較 し て 、 反 応 時 間 の 顕 著 な 短 縮 が 期 待 さ れ た 。 こ の 検 証 を 目 的 に p B S 、 pGEM お よ び p T S 1 の 各 プ ラ ス ミ ド D N A を 鋳 型 と し て 用 い 、T S 法 お よ び C S 法 に よ る 解 析 を 行 っ た 場 合 、 TS 法 で は 、 5 分 反 応 で 9 9.5 ％ 以 上 （ 解 読 鎖 長 400 bp ） の シ ー ク エ ン ス 精 度 で の 解 析 が 可 能 で あ っ た が 、C S 法 で は 解 読 可 能 な シ ー ク エ ン ス シ グ ナ ル が 得 る こ と は で き な か っ た 。 以 上 の 検 討 に よ り 、 TS 法 で は 、 DNA シ ー ク エ ン ス 反 応 時 間 を 、 CS 法 の DNA シ ー ク エ ン ス 反 応 時 間 の 約 8%に 短 縮 し た 。 第 ７ 章 で は 、C S 法 で は シ グ ナ ル の 急 激 な 減 衰 や 停 止 を 伴 い D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 が 困 難 な D N A 領 域 （ 難 解 読 領 域 ）に 関 し て 、T S 法 に よ る 解 析 と そ の 評 価 を 行 っ た 。難 解 読 領 域 で あ る G C リ ッ チ な D N A 領 域 は 、遺 伝 子 発 現 調 節 機 能 を 有 す る プ ロ モ ー タ ー や エ ン ハ ン サ ー 等 の 重 要 な DNA 領 域 お よ び そ の 近 傍 に 位 置 す る こ と が 多 い 。さ ら に 、抗 生 物 質 生 産 菌 で あ る 放 線 菌 の ゲ ノ ム D N A に は 極 め て G C リ ッ チ な 領 域 が あ る 。本 章 に お い て は 、C S 法 で 解 析 が 困 難 で あ っ た ヒ ト ゲ ノ ム D N A 由 来 の D N A 断 片 の D N A シ ー ク エ ン ス 解 析 を T S 法 に よ っ て 行 い 、G C 含 有 率 8 0 % 以 上 の D N A 領 域 や G T リ ピ ー ト 領 域 な ど に つ い て 、シ グ ナ ル 停 止 等 を 伴 わ ず 高 い シ ー ク エ ン ス 精 度 で の 解 析 が 可 能 で あ る こ と を 明 ら か に し て TS 法 の 優 位 性 を 示 し た 。 以 上 よ り 、 反 応 時 間 の 顕 著 な 短 縮 や 未 精 製 PCR 産 物 を 直 接 解 析 可 能 な こ と 、 さ ら に こ れ ま で 難 解 読 と さ れ て い た DNA 領 域 の DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 が 可 能 で あ る こ と な ど の 優 れ た 特 長 を 明 ら か に し て 、 新 規 な DNA シ ー ク エ ン ス 解 析 法 と し て の TS 法 の 開 発 に 成 功 し た 。 第８ 章で は、 本研 究の 総括 を行 った 。. 3.
(5) 研 究 業 績 種 類 別. 題名、. 発表・発行掲載誌名、. 発表・発行年月、. 連名者（申請者含む）. 1. 論文 ○（報文） 1 . M . I za w a , N . K i t a m ur a , N . O d a k e , F . M a k i , K. K a n e hi r a , H . N e m o t o, M . Y a ma g u c h i , A . Ya m a s h i t a , N. S a s a k i , M . H a t t o r i , S . K a n a y a m a , a nd Y . Y on e d a . A Ra p i d a n d S i m p l e Tr a n s c r i p t i on a l S e q u en c i n g M e t ho d f o r G C - r i c h D NA R e g i on s . J p n . J . V e t . R e s. , 5 3 ( 3 - 4 ) : 1 5 9 - 1 6 9 , 20 0 6 （報文） ２ . K . S h i b a t a , M . I z a w a , Y. H a y a s h i z ak i , a n d M . W a t a h i k i . P r a c ti c a l A p pl i c a t i o n o f T r an s c r i p t i o n al S e q u en c i n g f or G C - r i ch T e m p la t e s . J . S tr u c t . F u n c t. G e n o m i c s ., 4 ( 1 ) : 3 5 -3 9 , 2 0 0 3 （報文） ３ . Y . S h i b a t a , P . C a r ni n c i , K . S a t o , N H a y a t s u , T . S hi r a k i , Y . I s h i i, T A r a k a w a, A . H a r a , N . O h s a t o , M . I z a w a , K . A i z a w a, M . I t o h , K . S h i b at a , A . S h in a g a w a , J . K a w a i , Y . O t a , S . K i k u c h i , N. K i s h i m o t o, M . M ur a m a t s u , a nd Y . H a y a s hi z a k i . R e m o va l o f P o l y A T a i l s f r o m F u l l- L e n g t h c D N A L i br a r i e s f or H i g h -E f f i c i e n c y S e q u e n c i n g . B i o t ec h n i q u e s , 31 ( 5 ) : 1 0 4 2 -1 0 4 9 , 2 0 0 1 （報文） ４ . J . K a w a i , A . S h i n a ga w a , K . S h i b a ta , M . Y o s h i n o , M. I t o h , Y . I s h i i, T . A ra k a w a , A . H ar a , Y . F u k u ni s h i , H . K o nn o , J . A d a c hi , S . F u k u d a, K . A iz a w a , M . I za w a , ( 以 下 8 2 名 ) . F u n c ti o n a l A n n o ta t i o n o f a F u l l - L e n g t h M o u s e c D N A C o l l e c t i o n. N a t u re , 4 0 9 : 6 8 5- 6 9 0 , 2 0 0 1 ○（報文） ５ . M . I w a t a , M . I z a w a , N . S a s a k i , Y . N ag u m o , H . S a s a b e , a nd Y . H a y a sh i z a k i . T 7 R N A P o l y m e r a s e A c t i v at i o n an d I m pr o v e m e n t o f t h e T ra n s c r i p t i o n al S e q u en c i n g b y P ol y a m i n e s . B i o o rg . M e d . C h em . , 8 ( 8 ) : 2 1 8 5 - 2 1 9 4 , 2 0 0 0 （報文） ６ . K . S h ib a t a , M . I t o h , K . A i z a w a , S . N a g ao k a , N . S a s a k i , P. C a r n in c i , H . K on n o , J . Ak i y a m a , K . N i s h i , T . K i t s u n a i , H . T a s h i r o, M . I t oh , N . S u m i , Y . Is h i i , S . N a k a mu r a , M . H a z a m a, T . N i s h i n e , A. H a r a da , R . Y a m a m o t o , H . M a t s um o t o , S . S a k a g u c hi , T . Ik e g a m i , K. K a s h iw a g i , S . F u j i w a ke , K . I n o u e , Y . T o g a wa , M . I z a w a , E . O h a r a, M . W a t a hi k i , Y . Y o n ed a , T . I s h i ka w a , K . O z a wa , T . T a n a k a, S . M a t s u u r a, J . K a wa i , Y . O k a z a ki , M . M u r a m a ts u , Y . I n o u e , A . K i r a , a n d Y. H a y a sh i z a k i . RIKEN I n te g r a t e d S e q u e n ce Analysis (RISA) S y s te m - 3 8 4 - F o r m at S e q u en c i n g P i p e li n e w i t h 3 84 M u l t i C a pi l l a r y S e q ue n c e r . G e n o me R e s . , 1 0 ( 1 1 ) : 1 7 5 7 -1 7 7 1 , 2 0 0 0. 4.
(6) 研 究 業 績 種 類 別. 題名、. 発表・発行掲載誌名、. 発表・発行年月、. 連名者（申請者含む）. （報文） ７ . M . I t o h , T . K i t s u na i , J . A ki y a m a , K . S h i b a t a , M . I z a w a , J . K a w a i, Y . T o m a r u , P . C a r n i n c i, Y . S h i b a ta , Y . O z a w a, M . M u r a m at s u , Y. O k a z ak i , a n d H a ya s h i z a k i Y . A u t o ma t e d F i l t r a t i on - B a s e d H i g h - Th r o u g h p u t P l a sm i d P r e p a r a t i on S y s t em . G e n o me R e s . , 9 (5 ) : 4 6 3 - 4 7 0, 1 9 9 9 ○（報文） ８ . N . S a s a k i , M . I z a w a , Y . Su g a h a r a , T . T an a k a , M . W a t ah i k i , K. O z a w a, E . O ha r a , H . F u n a k i , Y. Y o n e d a , S . M a ts u u r a , M . M u r a m a t s u, Y . O ka z a k i , a n d Y . H a y a s h i za k i . I d e n ti f i c a t i o n o f S t a bl e R N A H a i r p i n s C a u s i n g B a n d C o m pr e s s i o n in T r a n sc r i p t i o n a l S e q u e n c in g a n d T h e i r E l i m i n a t io n b y U s e of I n o s i ne T r i p ho s p h a t e . G e n e , 2 2 2 ( 1 ) : 17 - 2 3 , 1 9 9 8 ○（報文） ９ . M . I z aw a , N . Sa s a k i , M . W a t a h i k i, E . O ha r a , Y . Y o n e d a , M. M u r a ma t s u , Y . O ka z a k i , a n d Y . H a y a s h i za k i . R e c o gn i t i o n S i t e s o f 3 ' - O H G r o u p b y T 7 R N A P o l y m e r as e a n d I t s A p p l ic a t i o n t o Tr a n s c r i p t i on a l S e q u e n ci n g . J . B io l . C h e m . , 2 7 3 ( 2 3 ) : 14 2 4 2 - 1 4 2 4 6 , 1 9 9 8 ○（報文） １ ０ . N . S a s a k i , M . I z a w a , M . W a t a h i ki , K . O z a w a , T . T a n a k a, Y . Y o n e da , S . M a t su u r a , P . C a r n i n c i , M. M u r a m a t su , Y . O k a za k i , a n d Y. H a y a sh i z a k i . T r a n sc r i p t i o n a l S e q u e n c i ng : A Me t h o d f o r D N A Se q u e n c i n g U s i n g R NA P o l y me r a s e . P r o c . N a t l . A c a d. S c i . , U S A . 9 5 ( 7 ) : 3 4 5 5 - 3 4 6 0 , 1 9 9 8 （報文） １ １ . N . S a s a k i , S . N a ga o k a , M . I t o h , M . I z a w a , H . K o nn o , P . C a r n i n c i, A . Y o sh i k i , M . K u sa k a b e , T . M or i u c h i , M . Mu r a m a t s u , Y. O k a z a k i , a nd Y . H ay a s h i z a k i . C h a r ac t e r i z a t i o n o f G e n e E x p r e s s io n i n M ou s e B l a s to c y s t U s i ng S i n g le - P a s s S e q ue n c i n g o f 39 9 5 C l o n e s . G e n o mi c s , 4 9 ( 2 ): 1 6 7 - 1 7 9 , 1 9 9 8 （報文） １ ２ . N . S a s ak i , M . I z a w a , M . S h i m o j o , K . S h i b at a , J . A k i y a m a , M. I t o h , S . N ag a o k a , P . C a r n i n ci , Y . O k a z a k i , T . M o r i uc h i , M . M u r a m a t s u, S . W at a n a b e , a n d Y . H a y a s h iz a k i . A N ov e l C o n t r o l S y s t e m fo r P o l y m e r as e C h a i n R e a c t i o n U si n g a R I K EN G S 3 8 4 T h e r m a l C yc l e r . D N A Re s . , 4 ( 6 ) : 3 8 7 - 3 9 1 , 19 9 7 （報文） １ ３ . P . C a r n i n c i, C . K v a m , A. K i t a m u r a , T . O h s u m i , Y. O k a z a k i , M. I t o h , M . K a m i y a , K . S h i b a t a , N . S a s a k i , M. I z a w a , M . M u r a m a t s u , Y. H a y a sh i z a k i , a n d C . S c h n e i d er . H i g h- E f f i c i e n c y F u l l - L en g t h c D NA C l o n in g b y B i o t in y l a t e d C A P T r a p p e r . G e n o mi c s , 3 7 ( 3 ): 3 2 7 - 3 3 6 , 1 9 9 6. 5.
(7) 研 究 業 績 種 類 別. 題名、. 発表・発行掲載誌名、. 発表・発行年月、. 連名者（申請者含む）. 2. 講演 １ . 転写シークエンス用クローニングベクターを用いた転写シークエンス法による Dual End Sequencing 日 本 農 芸 化 学 会 、仙台（講 演 要 旨 集 p . 1 3 8 ）、2 0 0 2 年 3 月 伊 澤 真 樹 、小 竹 七 々 恵 、北 村 暢 夫 、大 原 英 治 、山 口 光 代 、長 谷 川 千 巳 、石 井 克 典 、糸 岡 利 行 、米 田 祐 康 、綿 引 正 則 ２. 転 写 シ ー クエ ン ス 法 の 改良 と そ の 有用 性 日 本 分 子 生 物 学 会 、 福 岡 （ 講 演 要 旨 集 p . 5 0 2 ）、 1 9 9 9 年 1 2 月 伊澤真樹、石川友一、柴田一浩、伊藤昌可、綿引正則、大原英治、船木 弘 子 、 米 田 祐 康 、田 中 巧 、 小 澤 香 織 、 松 浦 修 治 、 村 松 正 実 、 林 崎 良 英 ３ . T7 RNAP の 伸 長 反 応 機 構 の 解 析 及 び 活 性 化 因 子 の 探 索 日 本 分 子 生 物 学 会 、 横 浜 ( 講 演 要 旨 集 p. 322)、 1998 年 1 2 月 伊 澤 真 樹 、 佐 々 木 宣 哉 ， 綿 引 正 則 、 大 原 英 治 、 米 田 祐 康 、岩 田 正 彰 、 南 雲 葉子、雀部博之，田中巧、小澤香織、松浦修治、村松正実、岡崎康司、 林 崎良 英 他 20 件 3. その他 （報文） １ . S . O s a d a , M . I z a w a , R . Sa i t o , K . M i zu n o , A . S u z uk i , S . H i r a i, a n d S. O h n o Y S K 1 , a N o v e l M a m m a l i an P r o t e i n K i n a s e S t r u c t u r a l ly R e l a t e d t o S t e 20 a n d SP S 1 , B u t I s N o t I n v o l ve d i n t h e Kn o w n M A P K Pa t h w a y s . O n c o ge n e , 1 4 ( 1 7) : 2 0 4 7 - 2 0 57 , 1 9 9 7 （報文） ２ . S . O s a d a , M. I z a w a , T . K o y a m a , S . H i r a i , a n d S O h n o . A D o m a i n C o n t a i n in g t h e C d c 4 2 /R a c I nt e r a c t i v e B i n d i n g ( C R I B) R e g i on of p 6 5P A K I n h i b i ts T r a n s c r i p ti o n a l A c t i va t i o n and C e ll T r a n sf o r m a t i o n Me d i a t e d b y t h e R a s - R a c P a t h w a y . F E B S L e t t . , 4 0 4 ( 2 - 3 ) : 2 2 7 -2 3 3 , 1 9 9 7 （報文） ３ . S . H i r a i , M. I z a w a , S . O s a d a , G . S p y r o u , a n d S O h n o . A c t i va t i o n o f t h e J N K P a t h w a y b y D i s t an t l y R e l at e d P r o t ei n K i n a s e s, MEKK and MUK. O n c o ge n e , 1 2 ( 3 ): 6 4 1 - 6 5 0 , 1 9 9 6. （特許） ４ .. 牧 文 典 、 平野 久 夫 、 米 田祐 康 、 金 山晋 治 、 廣 世 志津 子 、 伊 澤真 樹. イ ン ・ ビ ト ロ 転 写 反 応 を 利 用 し た 機 能 性 RNA 分 子 の 製 造 方 法 特 開 2005-006578. 6.
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