早稲田大学大学院 先進理工学研究科
博 士 論 文 概 要
論 文 題 目
分子標的治療薬 ZSTK474 の肉腫治療薬 としての有用性
Potential use of ZSTK474, a molecularly targeted drug, for sarcoma treatment
申 請 者
生田目 奈知 Nachi NAMATAME
2018 年 11 月
No. 1
肉 腫 は 、 骨 、 軟 骨 、 脂 肪 、 筋 肉 、 血 管 等 の 非 上 皮 性 細 胞 由 来 の 結 合 組 織 ・ 筋 組 織 ・ 神 経 組 織 細 胞 に 発 生 す る が ん で あ る 。 国 内 で の 軟 部 肉 腫 の 罹 患 率 は 十 万 人 に 3. 6 人 、 骨 肉 腫 は 1 人 と 稀 で あ る 一 方 、 そ の 組 織 型 は 5 0 以 上 に 分 類 さ れ て お り 、 こ の こ と が 治 療 法 開 発 の 遅 れ の 一 因 と な っ て い る 。 主 な 治 療 法 は 外 科 治 療 で 、 手 術 が 適 応 で き な い 場 合 や 転 移 を 有 す る 場 合 は 化 学 療 法 が 施 行 さ れ る が 、 が ん 腫 と 比 較 す る と 選 択 で き る 標 準 療 法 の 種 類 は 少 な い 。 近 年 に な り 、 パ ゾ パ ニ ブ や ト ラ ベ ク テ ジ ン な ど 、 肉 腫 に 対 す る 新 し い 治 療 薬 が 承 認 さ れ て い る ほ か 、 他 の が ん 腫 に お い て 使 用 さ れ て い る ド セ タ キ セ ル や エ ピ ル ビ シ ン の よ う な 化 学 療 法 の 肉 腫 へ の 適 応 拡 大 も 検 討 さ れ て い る が 、 ド キ ソ ル ビ シ ン と 比 較 す る と そ の 効 果 は 限 定 的 で あ る 。 そ こ で 新 し い 治 療 薬 の 開 発 の た め 、 組 織 型 の 分 類 だ け で な く 、 遺 伝 的 背 景 に よ る 肉 腫 の 分 類 か ら 治 療 標 的 の 探 索 が 試 み ら れ て い る 。
治 療 薬 の ス ク リ ー ニ ン グ 方 法 の 一 つ と し て 、 細 胞 株 パ ネ ル に よ る ス ク リ ー ニ ン グ 試 験 が あ る 。 複 数 の 肉 腫 細 胞 株 に 対 す る 化 合 物 の 抗 腫 瘍 活 性 を 同 時 に 検 討 す る こ と で 、 ど の 機 序 の 薬 剤 が ど の 種 類 の 肉 腫 に 有 効 か を 予 測 す る こ と が で き る と い う 利 点 が あ る 。 ま た 、 細 胞 株 の 遺 伝 子 変 異 や タ ン パ ク 質 発 現 量 の 情 報 と 併 せ て 検 討 す る こ と で 、 治 療 標 的 を 同 定 で き る 可 能 性 が あ る 。 そ こ で 本 研 究 で は 、 肉 腫 に 対 し て 有 効 な 作 用 機 序 の 薬 剤 の 探 索 を 目 的 と し て 、 ま ず 一 般 提 供 さ れ て い る 細 胞 株 1 4 株 を 用 い て 肉 腫 細 胞 株 パ ネ ル を 確 立 し 、 こ の パ ネ ル を 用 い て 分 子 標 的 薬 の 肉 腫 に 対 す る 有 効 性 を 検 討 し た 。 そ し て そ の 過 程 で 高 い 抗 腫 瘍 効 果 が 認 め ら れ た P I 3 キ ナ ー ゼ 阻 害 剤 Z S TK 4 7 4 に 焦 点 を 当 て 、 肉 腫 に 対 す る 有 効 性 に つ い て よ り 詳 細 な 検 討 を i n v i t ro お よ び i n v i vo で 行 っ た 。 さ ら に 、Z S TK 4 74 が 特 に 有 効 と 考 え ら れ た 肉 腫 の 特 徴 と し て 考 え ら れ た 融 合 遺 伝 子 に 注 目 し 、 そ の 機 能 に 対 す る 影 響 に つ い て 検 討 し た 。
本 論 文 は 、 主 に 4 つ の 内 容 で 構 成 さ れ て い る 。
第 1 章 で は 緒 言 と し て 、 本 研 究 を 行 う に あ た り 注 目 し た 肉 腫 の 治 療 と 新 た な 治 療 薬 の 開 発 研 究 の 現 状 か ら 、 ス ク リ ー ニ ン グ 試 験 、 治 療 の 標 的 と し て 注 目 さ れ る P I 3 キ ナ ー ゼ に つ い て 概 説 し 、 最 後 に 本 研 究 の 目 的 を 記 述 し た 。
第 2 章 は 肉 腫 細 胞 株 パ ネ ル に よ る 各 化 合 物 の 増 殖 阻 害 試 験 の 結 果 を 2 節 に 分 け て 記 し た 。
第 1 節 は 、2 章 の 検 討 で 実 施 し た 細 胞 や 試 験 の 方 法 に つ い て 記 述 し た 。 続 く 第 2 節 で は 検 討 し た 結 果 を 6 項 に 分 け て 記 載 し 、 そ れ ぞ れ の 考 察 を 最 後 に 記 し た 。
第 1 項 で は 、 構 築 し た 肉 腫 細 胞 株 パ ネ ル の 背 景 と な る B R A F（V 6 0 0 E） 等 の 変 異 遺 伝 子 情 報 と リ ン 酸 化 A K T 等 の シ グ ナ ル 関 連 タ ン パ ク 質 の 発 現 量 を 検 討 し 、 そ の 関 係 に つ い て 述 べ た 。第 2 項 で は 増 殖 阻 害 試 験 の た め の 播 種 細 胞 数 を 検 討 し 、 そ の 条 件 に よ る 2 回 の 増 殖 阻 害 試 験 の 結 果 を 第 3 項 で 示 し た 。 第 4 項 で は 、 試 験 結 果 を ク ラ ス タ ー 解 析 し 、2 回 の 試 験 の 精 度 に 問 題 が な い こ と を 確 認 し た 。 第 5
No. 2
項 お よ び 第 6 項 で は 、 肉 腫 細 胞 に 対 す る 各 化 合 物 の 感 受 性 と シ グ ナ ル 関 連 タ ン パ ク 質 の 発 現 量 の 関 係 、 お よ び 感 受 性 と 遺 伝 子 変 異 と の 関 係 に つ い て そ れ ぞ れ 解 析 し た 。そ の 結 果 、B R A F 変 異 の あ る 細 胞 株 で は B R A F 阻 害 剤 が 、R A S / R A F 変 異 を 有 す る 細 胞 株 で は M EK 阻 害 剤 が 特 に 有 効 で あ る こ と を 見 出 し た 。 一 方 、 ど の 細 胞 株 に お い て も 強 い 増 殖 抑 制 効 果 を 示 し た P I 3 キ ナ ー ゼ 阻 害 剤 に つ い て は 、 リ ン 酸 化 タ ン パ ク 質 や 遺 伝 子 変 異 と の 関 係 は 見 出 さ れ な か っ た 。
第 3 章 で は 、P I 3 キ ナ ー ゼ 阻 害 剤 の 肉 腫 に 対 す る 効 果 を 詳 細 に 検 討 す る た め 、 P I 3 キ ナ ー ゼ 阻 害 剤 Z S TK 4 7 4 を 用 い て i n v i tr o お よ び i n v i v o に お い て 検 討 を 実 施 し た 。
第 1 節 で は 、3 章 の 検 討 で 実 施 し た 細 胞 や 試 験 の 方 法 に つ い て 記 述 し た 。 第 2 節 で は 結 果 を 全 3 項 に 分 け て 記 述 し た 。
第 1 項 で は 、Z S TK 4 7 4 の 肉 腫 細 胞 株 に 対 す る i n v i tr o に お け る 効 果 を 検 討 し た 。 第 1 目 で は 、Z S TK 4 74 に よ る リ ン 酸 化 A K T な ど の シ グ ナ ル 関 連 タ ン パ ク 質 の 発 現 変 化 を ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト に よ り 検 討 し 、 第 2 目 で は 、P r o p i d i um I o d i d e 染 色 に よ る FA C S 解 析 か ら 、 細 胞 周 期 の 変 化 を 検 討 し た 。 す べ て の 肉 腫 細 胞 株 で Z S TK 4 74 は G 1 ア レ ス ト を 誘 導 し 、 一 部 の 細 胞 で S u b G 1 画 分 を 増 大 さ せ た 。 ア ポ ト ー シ ス の 誘 導 の 有 無 を 検 討 す る た め 第 3 目 で は ヘ キ ス ト 染 色 に よ る 観 察 と 、 ア ポ ト ー シ ス の マ ー カ ー タ ン パ ク 質 で あ る c l e a v e d - PA R P の 発 現 を ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト で 確 認 し た 。 結 果 、Z S T K 4 7 4 に よ り R D - E S（ ユ ー イ ン グ 肉 腫 ） お よ び S J C RH 3 0（ 胞 巣 型 横 紋 筋 肉 腫 ）で ア ポ ト ー シ ス が 強 く 誘 導 さ れ て い る こ と が 見 出 さ れ た 。 こ れ ら の 細 胞 株 に 対 し て 、P I 3 キ ナ ー ゼ の 阻 害 剤 は 特 に 有 効 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。
第 2 項 で は 、Z S T K 4 7 4 の 肉 腫 細 胞 株 に 対 す る i n vi v o に お け る 効 果 を 4 項 目 に 分 け て 検 討 し た 。
第 1 目 で は 、 ヌ ー ド マ ウ ス 皮 下 移 植 モ デ ル を S J C R H 3 0、S K - U T- 1（ 平 滑 筋 肉 腫 ）、M E S - S A（ 子 宮 肉 腫 ） お よ び H T- 1 0 8 0（ 線 維 肉 腫 ） の 4 細 胞 株 で 確 立 し 、 第 2 目 に お い て そ れ ら に 対 す る Z S T K 4 7 4 の 抗 腫 瘍 効 果 の 検 討 結 果 を 記 し た 。 い ず れ の 移 植 モ デ ル マ ウ ス に お い て も Z S TK 4 7 4 は 抗 腫 瘍 効 果 を 示 し 、 そ の 効 果 は Z S TK 4 7 4 の 投 与 量 依 存 的 で あ っ た 。 続 く 第 3 目 で は 、S J C RH 3 0、S K - U T- 1 の モ デ ル マ ウ ス を 用 い 、Z S TK 4 74 が 肉 腫 の 標 準 治 療 薬 で あ る ド キ ソ ル ビ シ ン お よ び パ ゾ パ ニ ブ と 同 程 度 の 強 い 抗 腫 瘍 効 果 を 示 し た こ と を 記 し た 。 ま た S J C R H 3 0 の 摘 出 腫 瘍 内 に お い て ア ポ ト ー シ ス の 誘 導 を 示 し た 。 第 4 目 で は 、 多 剤 耐 性 細 胞 株 に お け る Z S T K 4 7 4 の 効 果 を 検 討 し た 。P 糖 タ ン パ ク 質 を 高 発 現 す る 耐 性 株 M E S - S A/ D x 5 の 移 植 モ デ ル マ ウ ス を 用 い て 確 認 し た 結 果 、 ド キ ソ ル ビ シ ン の 抗 腫 瘍 効 果 が 耐 性 株 で 低 下 し た 一 方 で Z S T K 4 74 の 効 果 に 変 化 は な く 、 ま た パ ゾ パ ニ ブ よ り も 強 い 抗 腫 瘍 効 果 を 認 め た 。 つ ま り 、 化 学 療 法 剤 の 前 治 療 に よ り 多 剤 耐 性 と な
No. 3
っ た 肉 腫 に 対 し て も Z S TK 4 7 4 は 有 効 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。
第 3 項 で は 、 強 く ア ポ ト ー シ ス が 誘 導 さ れ た 、 融 合 遺 伝 子 を 持 つ 肉 腫 細 胞 と Z S TK 4 74 の 抗 腫 瘍 効 果 と の 関 係 に つ い て 4 項 目 に 分 け て 検 討 し た 。
第 1 目 で は 、 ユ ー イ ン グ 肉 腫 由 来 細 胞 株 A 6 7 3 を 用 い て Z S T K 47 4 が ア ポ ト ー シ ス を 誘 導 す る こ と を i n v i tr o の 試 験 に て 示 し た 。 第 2 目 で は 、 異 常 な 転 写 因 子 と し て 機 能 す る ユ ー イ ン グ 肉 腫 の 原 因 融 合 遺 伝 子 E W S R 1- F L I 1 に 注 目 し 、 Z S TK 4 7 4 の 影 響 に つ い て レ ポ ー タ ー ア ッ セ イ に よ り 検 討 し た 。E W S R 1 - F L I 1 の 転 写 活 性 は Z S T K 4 7 4 の 処 理 濃 度 依 存 的 に 抑 制 さ れ た 。ま た E W S R 1 - F L I 1 の 標 的 遺 伝 子 で あ る I d 2 の 発 現 も 低 下 し た こ と か ら 、Z S T K 4 7 4 が E W S R 1 - F L I 1 の 転 写 活 性 を 抑 制 し た こ と が 示 さ れ た 。 第 3 目 で は 、A 6 7 3 に よ る 移 植 モ デ ル マ ウ ス を 作 製 し 、Z S T K 4 74 の 抗 腫 瘍 効 果 と 腫 瘍 内 で の ア ポ ト ー シ ス 誘 導 の 有 無 を 確 認 し た 。 そ の 結 果 、A 6 7 3 に お い て も Z S T K 4 7 4 は 強 い 抗 腫 瘍 効 果 を 示 し 、 摘 出 腫 瘍 の ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト お よ び 免 疫 染 色 の 結 果 か ら 腫 瘍 内 で の ア ポ ト ー シ ス の 誘 導 を 認 め た 。 最 後 に 第 4 目 で 、 融 合 遺 伝 子 S S 1 8- S SX を 持 つ 滑 膜 肉 腫 細 胞 株 S Y O - 1、 As k a - S S お よ び Ya m a t o - S S に 対 す る Z S TK 4 7 4 の 効 果 を i n v it r o お よ び i n v i v o で 検 討 し た 。Z S T K 4 7 4 は i n v it r o に お い て 上 記 3 細 胞 で ア ポ ト ー シ ス を 強 く 誘 導 し 、S Y O - 1 移 植 モ デ ル マ ウ ス に て 強 い 抗 腫 瘍 効 果 と 腫 瘍 内 の ア ポ ト ー シ ス 誘 導 を 示 し た 。 そ こ で S S 18 - S S X の 発 現 量 の 変 化 を ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト に よ り 検 討 し た と こ ろ 、S Y O - 1 お よ び A s k a - S S で は 発 現 が 低 下 し た が 、Ya m a t o - S S で は 変 化 が な く 、 ア ポ ト ー シ ス の 誘 導 は 必 ず し も S S 1 8 - S S X の 機 能 抑 制 が 原 因 で は な い こ と が 示 唆 さ れ た 。 ま た 、S J C R H 3 0 の 融 合 遺 伝 子 PA X 3 - F O X O 1 の 発 現 量 を 確 認 し た が Z S T K 47 4 処 理 に よ る 変 化 は な く 、PA X 3 - FO X O 1 の 脱 リ ン 酸 化 の 誘 導 が 認 め ら れ た 。こ の 結 果 か ら 、脱 リ ン 酸 化 に よ る PA X 3 - FO X O 1 の 機 能 の 不 安 定 化 が 、強 い 抗 腫 瘍 効 果 を 示 し た 原 因 の 一 つ と 考 え ら れ た 。
第 4 章 で は 結 語 と し て 、P I 3 キ ナ ー ゼ 阻 害 剤 Z S T K 4 74 が 上 記 の 融 合 遺 伝 子 を 持 つ 肉 腫 に 対 し て ア ポ ト ー シ ス を 誘 導 し 、 特 に 有 効 で あ る と 結 論 し た 。
本 研 究 か ら 、ま ず B R A F な ど の 遺 伝 子 に 変 異 を 持 つ 肉 腫 に は そ の 阻 害 剤 が 有 効 で あ る こ と が 示 さ れ た 。 今 後 、 本 研 究 で 確 立 し た 肉 腫 パ ネ ル に 遺 伝 子 発 現 量 や m i R N A な ど の 情 報 を 併 せ て 検 討 す る こ と で 、 治 療 標 的 に 合 わ せ た 薬 剤 の 開 発 に 繋 が る こ と が 期 待 で き る 。 ま た 、 増 殖 阻 害 作 用 の 強 か っ た P I 3 キ ナ ー ゼ 阻 害 剤 Z S TK 4 74 が 特 に 融 合 遺 伝 子 を 持 つ 肉 腫 で ア ポ ト ー シ ス を 誘 導 し 高 い 効 果 を 示 し た 。E W S R 1 - F L I 1 や PA X 3 - FO X O 1 に 対 す る 影 響 の 検 討 か ら 、 転 写 因 子 に 対 す る Z S TK 4 74 の 作 用 が 一 因 と し て 考 え ら れ た 。融 合 遺 伝 子 に 対 す る 詳 細 な 効 果 は 本 検 討 で は 明 ら か で は な い が 、P I 3 キ ナ ー ゼ 阻 害 剤 が P I P3 の 産 生 阻 害 だ け で な く 転 写 因 子 の 活 性 を 抑 制 し た こ と は 初 め て の 報 告 で あ り 、 新 し い 肉 腫 治 療 薬 の 候 補 と し て P I 3 キ ナ ー ゼ 阻 害 剤 の 可 能 性 を 示 し た こ と は 本 研 究 の 成 果 で あ る と 言 え る 。
Ｎｏ.1
早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書
氏 名 生田目 奈知 印
（2019年2月1日現在）
種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）
論文 ○N. Namatame, N. Tamaki, Y. Yoshizawa, M. Okamura, Y. Nishimura, K. Yamazaki, M. Tanaka, T. Nakamura, K. Semba, T. Yamori, S. Yaguchi and S. Dan, “Antitumor profile of the PI3K inhibitor ZSTK474 in human sarcoma cell lines”, Oncotarget, 2018, 9 (80), 35141-61
S. Isoyama, G. Kajiwara, N. Tamaki, M. Okamura, H. Yoshimi, N. Nakamura, K.
Kawamura, Y. Nishimura, N. Namatame, T. Yamori, S. Dan, “Basal expression of insulin-like growth factor 1 receptor determines intrinsic resistance of cancer cells to a phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor ZSTK474”, Cancer Sci., 2015, 106 (2), 171-8 F. Takeshita, Y. Minakuchi, S. Nagahara, K. Honma, H. Sasaki, K. Hirai, T. Teratani, N. Namatame, Y. Yamamoto, K. Hanai, T. Kato, A. Sano, T. Ochiya, “Efficient delivery of small interfering RNA to bone-metastatic tumors by using atelocollagen in vivo”, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2005, 102 (34), 12177-82
講演 「PI3K阻害剤ZSTK474の滑膜肉腫に対する抗がん効果の検討」、第77回日本癌学会学 術総会、2018年9月、大阪府大阪市、玉城尚美、生田目奈知、岡村睦美、矢口信一、旦 慎吾
「ZSTK474, a pan PI3K inhibitor, exerts an antitumor efficacy against Ewing's sarcoma cell lines in vitro and in vivo」、第75回日本癌学会学術総会、2016年10月、
神奈川県横浜市、吉澤雄也、玉城尚美、生田目奈知、西村由美子、山崎佳波、岡村睦美、
矢守隆夫、矢口信一、旦慎吾
「Induction of cell cycle arrest and apoptosis by a PI3K inhibitor ZSTK474 in a panel of sarcoma cell lines」、第74回日本癌学会学術総会、2015年10月、愛知県名古屋市、
生田目奈知、西村由美子、山崎佳波、玉城尚美、吉澤雄也、岡村睦美、矢守隆夫、矢口信 一、旦慎吾
「In vivo antitumor efficacy of a PI3K inhibitor ZSTK474 against human sarcoma
xenograft」、第74回日本癌学会学術総会、2015年10月、愛知県名古屋市、吉澤雄也、
玉城尚美、岡村睦美、生田目奈知、矢守隆夫、矢口信一、旦慎吾
「肉腫細胞株パネルに対するPI3K阻害剤ZSTK474の抗がん効果」、第19 回日本がん 分子標的治療学会学術集会、2015年6月、愛媛県松山市、生田目奈知、玉城尚美、岡村 睦美、矢守隆夫、矢口信一、旦慎吾
「肉腫細胞ゼノグラフトモデルマウスに対するPI3K阻害剤ZSTK474の抗がん効果」、
第19回日本がん分子標的治療学会学術集会、2015年6月、愛媛県松山市、玉城尚美、
岡村睦美、生田目奈知、矢守隆夫、矢口信一、旦慎吾
「Efficacy of ZSTK474, a PI3K inhibitor, in a sarcoma cell line panel」、第73回日本癌 学会学術総会、2014年9月、神奈川県横浜市、生田目奈知、西村由美子、山崎佳波、玉 城尚美、岡村睦美、矢守隆夫、矢口信一、旦慎吾
Ｎｏ.2
早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書
種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）
その他
（講演）
「Involvement of c-Met activation for acquisition of resistance to PI3K inhibitors」、 第73回日本癌学会学術総会、2014年9月、神奈川県横浜市、川村健人、礒山翔、西村 由美子、生田目奈知、矢守隆夫、旦慎吾
「Inhibition of RPN2 restores drug sensibility in cisplatin-resisted lung cancer cell
line」第66回日本癌学会学術総会、2007年10月、神奈川県横浜市、川又理樹、山本雄
介、生田目奈知、本間紀美、竹下文隆、西尾和人、落谷孝広
「Cyclin D1-induced alterations in gene expression associated with skin tumor
formation」、第20回国際生化学・分子生物学会議、2006年6月、京都府京都市、生田
目奈知、竹下文隆、加藤尚志、落谷孝広
「Atelocollagen-mediated systemic small interfering RNA delivery for effective gene
silencing」、第20回国際生化学・分子生物学会議、2006年6月、京都府京都市、竹下文
隆、生田目奈知、本間紀美、水口佳子、落谷孝広
「siRNA/アテロコラーゲン複合体の全身性投与における臓器・腫瘍組織特異性の検討」、
第28回日本分子生物学会年会、2005年12月、福岡県福岡市、竹下文隆、生田目奈知、
水口佳子、本間紀美、加藤尚志、落谷孝広
「アテロコラーゲンによるsiRNAの全身投与とその有効性の検討」、第27回日本分子生 物学会年会、2004年12 月、兵庫県神戸市、竹下文隆、生田目奈知、水口佳子、本間紀 美、加藤尚志、落谷孝広
「サイクリンD1過剰発現によるケラチノサイトでのVEGFの発現上昇」、第27回日本 分子生物学会年会、2004 年12 月、兵庫県神戸市、生田目奈知、竹下文隆、加藤尚志、
落谷孝広 その他
（業界誌）
「癌領域におけるPI3キナーゼ阻害剤の開発」、Medical Science Digest、2009年、第35 巻5号、30-35、矢口信一、生田目奈知、矢守隆夫
