博 士 論 文 概 要

博   士   論   文   概   要

論 文 題 目

Highly efficient gene expression based on chromatin engineering

クロマチン構造の人為的改変による 遺伝子の高効率発現

申 請 者

棚瀬 潤一 Junichi Tanase

生命理工学専攻 分子遺伝学研究

2009 年 12 月

Ｎｏ.

1

組 換 え D N A 技 術 が 登 場 し た 1 9 7 4 年 以 降 生 命 科 学 は 爆 発 的 に 発 展 し た 。こ の 過 程 で 、 遺 伝 子 操 作 技 術 も 長 足 の 進 歩 を 遂 げ 、 今 や 、 製 薬 、 農 林 水 産 、 医 療 な ど 生 物 ･ 生 命 に 関 連 し た 分 野 に 必 要 不 可 欠 の 基 盤 技 術 と な っ た 。 し か し 一 方 で 、 真 核 細 胞 遺 伝 子 の 発 現 を 思 い 通 り に 制 御 す る 技 術 は い ま だ に な く 、 生 命 科 学 に お け る 大 き な 技 術 的 課 題 と な っ て い る 。 こ の 問 題 が 解 決 で き れ ば 、 各 種 産 業 分 野 や 医 療 分 野 に 計 り 知 れ な い 恩 恵 を も た ら す と 予 想 さ れ る 。

遺 伝 子 発 現 の 最 初 の 段 階 は 遺 伝 子 の 転 写 で あ る 。 従 っ て 、 多 く の 場 合 、 転 写 の 開 始 効 率 は 遺 伝 子 発 現 全 体 の 効 率 に 大 き く 影 響 す る 。 真 核 生 物 で は 転 写 は ク ロ マ チ ン 内 で 行 わ れ る た め 、 転 写 制 御 領 域 に 転 写 開 始 に 適 し た ク ロ マ チ ン 構 造 が 構 築 さ れ る か ど う か が 転 写 の 開 始 効 率 を 決 め る 鍵 と な る 。 こ の 点 は 、 外 来 遺 伝 子 （ ト ラ ン ス ジ ー ン ） の 発 現 の 際 に 特 に 問 題 と な る 。 つ ま り 、 ト ラ ン ス ジ ー ン の 転 写 制 御 領 域 に 転 写 開 始 に 適 し た ク ロ マ チ ン 構 造 が で き な い か ぎ り 、 安 定 で 高 効 率 な 遺 伝 子 発 現 に は 至 ら な い 。

以 上 か ら 明 ら か な よ う に 、 真 核 細 胞 遺 伝 子 の 発 現 を 思 い 通 り に 制 御 す る た め に は 、 ク ロ マ チ ン 内 で の 遺 伝 子 収 納 機 構 を 理 解 し 、 そ れ を 応 用 す る こ と で 「 遺 伝 子 発 現 に 有 利 な ク ロ マ チ ン 構 造 を 人 為 的 に 構 築 す る 」 こ と が 必 要 と 考 え ら れ る 。 こ の 新 し い 技 術 の こ と を 、 申 請 者 の 研 究 室 で は 「 ク ロ マ チ ン 工 学 （ c h r o m a t i n e n g i n e e r i n g ）」 と 名 付 け た 。 ク ロ マ チ ン 工 学 は 、 従 来 の 生 体 の 各 レ ベ ル に お け る 操 作 技 術 、 す な わ ち 、 遺 伝 子 工 学 、 染 色 体 工 学 、 細 胞 工 学 、 生 体 工 学 な ど と の 関 連 で は 、 遺 伝 子 工 学 と 染 色 体 工 学 の 間 に 位 置 す る 技 術 で あ る 。 し か し 、 概 念 は 構 築 さ れ て い る も の の 、 研 究 自 体 は ま だ 緒 に 就 い た ば か り と い え る 。

本 論 文 は 、 ク ロ マ チ ン 工 学 に 必 要 な “ 道 具 ” と そ の “ 働 き ” に つ い て 行 っ た 研 究 の 報 告 で あ る 。 ま ず 道 具 で あ る が 、 研 究 に は 負 の 超 ら せ ん を 擬 態 し た 人 工 ベ ン ト D N A を 用 い た 。 な お 、 ベ ン ト D N A と は ら せ ん 軸 の 軌 道 が 曲 が っ た 構 造 の D N A の こ と を い い 、 超 ら せ ん を 擬 態 し た ベ ン ト D N A と は 、 D N A ト ポ ロ ジ ー の ひ と つ で あ る 超 ら せ ん 構 造 に 似 た 構 造 を と っ た ベ ン ト D N A を 意 味 す る 。 以 下 、 こ の よ う な ベ ン ト D N A を “ 超 ら せ ん 様 ベ ン ト D N A ” と 略 す 。 超 ら せ ん 様 ベ ン ト D N A を 真 核 生 物 遺 伝 子 の プ ロ モ ー タ ー の 上 流 に 配 置 す る と プ ロ モ ー タ ー が 活 性 化 す る こ と は 既 に 解 明 さ れ て い た（ N i s h i k a w a e t a l. , 2 0 0 3 ）。こ の 現 象 は は じ め 、C O S - 7 細 胞（ サ ル 由 来 細 胞 ） を 用 い た 一 過 的 遺 伝 子 発 現 系 に よ り 明 ら か に さ れ た も の で あ る が 、 後 に H e L a 細 胞 （ ヒ ト 由 来 細 胞 ） の ゲ ノ ム に レ ポ ー タ ー を 導 入 し て 構 築 し た 、 安 定 的 遺 伝 子 発 現 系 を 用 い た 解 析 で も 確 認 さ れ た （ S u m i d a e t a l. , 2 0 0 6 ）。 こ れ ら の 先 行 研 究 が あ る な か で 、 今 回 、 大 き く 分 け て ふ た つ の 研 究 を 行 っ た 。 本 論 文 で は こ れ ら の 結 果 に つ い て 、 そ れ ぞ れ 第 1 部 と 第 2 部 に 分 け て 述 べ る 。

第 1 部 の 研 究 で は 、「 マ ウ ス E S 細 胞 に お け る 超 ら せ ん 様 ベ ン ト D N A の 転 写 活 性 化 能 」 に つ い て 調 べ た 。 こ の 研 究 の 目 的 は 主 と し て 次 の ふ た つ で あ っ た 。（ i ） 未 分 化 細 胞 に お け る 超 ら せ ん 様 ベ ン ト D N A の 転 写 活 性 化 能 に つ い て 解 析 す る 。（ i i ） 細 胞 分 化 に 伴 う 超 ら せ ん 様 ベ ン ト D N A の 機 能 変 化 に つ い て 検 討 す る 。 超 ら せ ん 様 ベ ン ト D N A は 、 5 ʼ - T T T T T - 3 ʼ 配 列 （ 以 後 、 T₅ト ラ ク ト と よ ぶ ） を 9 塩 基 対 ご と に 2 0 回 反 復 さ せ て 構 築 し た 。 ま た 、 プ ロ モ ー タ ー と レ ポ ー タ ー 遺 伝 子 に は 、 ニ

ワ ト リ b - ア ク チ ン プ ロ モ ー タ ー と G F P 遺 伝 子 を そ れ ぞ れ 用 い 、レ ポ ー タ ー コ ン ス ト ラ ク ト を 構 築 し た 。 解 析 に は 安 定 的 遺 伝 子 発 現 系 を 用 い る こ と に し 、 対 照 株 の 樹 立 に は C r e -l o x P シ ス テ ム を 用 い た 。 約 2 , 0 0 0 株 の な か か ら レ ポ ー タ ー が 1 コ ピ ー だ け 導 入 さ れ た 1 0 組（ T 2 0 を 持 つ 試 験 株 と 持 た な い 対 照 株 で 1 組 ）の 細 胞 株 を 樹 立 し た 。 1 コ ピ ー だ け の 遺 伝 子 導 入 株 を ス ク リ ー ニ ン グ し た 理 由 は 、 遺 伝 子 発 現 解 析 の 結 果 と ク ロ マ チ ン 構 造 解 析 の 結 果 を 1 対 1 で 対 応 さ せ る た め で あ る 。 得 ら れ た 細 胞 株 は 、 レ ポ ー タ ー が 何 ら か の 遺 伝 子 の 上 流 に 挿 入 さ れ も の が 3 組 、 遺 伝 子 間 領 域 に 挿 入 さ れ も の が 5 組 、遺 伝 子 内 部 に 挿 入 さ れ も の が 2 組 で あ っ た 。 な お 、 最 初 の グ ル ー プ （ グ ル ー プ A と よ ぶ ） に お け る 近 傍 遺 伝 子 は 、 T g f b r 3

（ t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r b r e c e p t o r I I I ） 遺 伝 子 、A l o x 5 a p（ a r a c h i d o n a t e 5 - l i p o x y g e n a s e - a c t i v a t i n g protein ） 遺 伝 子 、 お よ び C d k 3（ c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e 3 ） 遺 伝 子 で あ っ た 。

G F P の 発 現 解 析 を 行 っ た 結 果 、4 組 の 株 で T 2 0 を 持 つ 試 験 株 の 方 が T 2 0 を 持 た な い 対 照 株 よ り も G F P を 高 発 現 し て い る こ と が 明 ら か に な っ た が 、そ の 他 の 組 で は 、 両 者 に 差 が み ら れ な い か 、 逆 に 対 照 株 の 方 が G F P の 発 現 量 が 高 い と い う 結 果 で あ っ た 。 こ れ は 、 試 験 株 が 常 に 対 照 株 よ り も レ ポ ー タ ー 遺 伝 子 を 高 発 現 す る と い う 先 行 研 究 の 結 果 と は 異 な る も の で あ っ た 。 な お 、 上 記 の 4 組 の 細 胞 株 の う ち 3 組 が グ ル ー プ A に 属 し 、こ れ ら の 近 傍 に 存 在 す る 各 遺 伝 子（T g f b r 3、A l o x 5 a p、C d k 3） は 、 胚 ま た は 胚 盤 胞 で 発 現 し て い る こ と が 既 に 報 告 さ れ て い た 。 一 方 、 こ れ ら グ ル ー プ A の 3 組 の 細 胞 を 肝 細 胞 に 分 化 さ せ た 後 に は 、 試 験 株 と 対 照 株 の 関 係 を 維 持 で き た も の は 2 組 で 、A l o x 5 a p を 近 傍 に 持 つ 1 組 で は 試 験 株 の 方 が 対 照 株 よ り も 低 い G F P 発 現 に 終 わ っ た 。 な お 、A l o x 5 a p を 含 め て 近 傍 の 各 遺 伝 子 は 肝 細 胞 で も 発 現 し て い る こ と が 分 か っ た 。 以 上 か ら 、 T 2 0 が 活 性 遺 伝 子 領 域 に 導 入 さ れ た 場 合 、 E S 細 胞 内 で は そ の 効 果 を 発 揮 で き る が 、 分 化 後 は そ の 限 り で は な い こ と が 明 ら か に な っ た 。

次 に レ ポ ー タ ー 遺 伝 子 を T g f b r 3 の 近 傍 に 持 つ 細 胞 株 1 組（ M E S 3 2 / T 2 0 と M E S 3 2 ） と 遺 伝 子 間 領 域 に 持 つ 細 胞 株 1 組（ M E S A 2 / T 2 0 と M E S A 2 ）を 用 い て 、ク ロ マ チ ン 構 造 の 解 析 を 行 っ た 。M E S 3 2 / T 2 0 は 、分 化 前 も 分 化 後 も 、T 2 0 の 効 果 が 最 も 高 く 現 れ た 細 胞 株 で （ 対 照 株 に 比 べ て プ ロ モ ー タ ー を 分 化 前 に 2 . 7 倍 、 分 化 後 に 2 . 5 倍 活 性 化 し た ）、 M E S A 2 / T 2 0 は 、 分 化 前 後 で T 2 0 の 効 果 が 逆 転 し た 株 で あ る （ 分 化 前 に は プ ロ モ ー タ ー を 1 . 9 倍 活 性 化 し た も の の 、 肝 細 胞 に 分 化 し た 後 に は 1 . 7 倍 抑 制 し た ）。C h I P ア ッ セ イ と D N a s e I フ ッ ト プ リ ン ト ア ッ セ イ を 用 い て ク ロ マ チ ン 構 造 解 析 を 行 っ た 結 果 、 M E S 3 2 / T 2 0 の 場 合 に は 、 細 胞 分 化 前 も 分 化 後 も 、 そ の 対 照 株 で あ る M E S 3 2 と ほ ぼ 同 じ ク ロ マ チ ン 構 造 を と る が 、 M E S A 2 / T 2 0 の 場 合 、 ど ち ら の 状 態 に お い て も 、 対 照 株 と は ヌ ク レ オ ソ ー ム の 沈 着 量 が 大 き く 異 な っ て お り 、 ク ロ マ チ ン 構 造 も 大 き く 異 な っ て い る こ と が 明 ら か に な っ た 。 M E S 3 2 / T 2 0 で は レ ポ ー タ ー 遺 伝 子 が 活 性 遺 伝 子 領 域 に 、 M E S A 2 / T 2 0 で は 遺 伝 子 間 領 域 に 導 入 さ れ て い る 。 し た が っ て 活 性 遺 伝 子 領 域 の 場 合 、 ク ロ マ チ ン 構 造 の 質 的 違 い が 遺 伝 子 発 現 の 違 い に 反 映 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 一 方 、 遺 伝 子 間 領 域 の 場 合 に は 、 ク ロ マ チ ン 構 造 が 厳 密 に 管 理 さ れ て い な い 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。

Ｎｏ.

3

第 2 部 で は 、「 超 ら せ ん 様 ベ ン ト D N A に よ る 転 写 活 性 化 機 構 」に 的 を 絞 っ て 解 析 を 行 っ た 。 解 析 に は 、 出 芽 酵 母 （S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e） の ミ ニ 染 色 体 の 系 を 用 い た 。 こ れ ま で の 哺 乳 動 物 細 胞 を 用 い た 解 析 で は 、 ゲ ノ ム サ イ ズ の 大 き さ が 問 題 と な っ て 高 分 解 能 の 解 析 を 行 う こ と が で き な か っ た 。 酵 母 の 系 を 用 い た 第 1 の 理 由 は 、 こ の 問 題 を 解 決 す る こ と に あ っ た 。 解 析 に は T 2 0 の 他 に 、 T 1 2（ T₅ ト ラ ク ト が 9 塩 基 対 ご と に 1 2 回 反 復 し た 構 造 ）と T 2 8（ 同 じ く 2 8 回 反 復 ）を 用 い た 。 最 初 に U A S 配 列（ 上 流 活 性 化 配 列 ）を 欠 失 さ せ た C Y C 1 プ ロ モ ー タ ー を 用 い て 、各 超 ら せ ん 様 ベ ン ト D N A の 効 果 を レ ポ ー タ ー 遺 伝 子（l a c Z を 用 い た ）の 発 現 変 化（ b - ガ ラ ク ト シ ダ ー ゼ ア ッ セ イ ） に よ り 調 べ た 。 な お 、C Y C 1 プ ロ モ ー タ ー は チ ト ク ロ ー ム c ア イ ソ フ ォ ー ム 1 遺 伝 子 の プ ロ モ ー タ ー で 、 上 流 に ふ た つ 存 在 す る U A S 配 列 を 欠 失 さ せ る と 、 プ ロ モ ー タ ー 上 の ヌ ク レ オ ソ ー ム に よ り 転 写 が 抑 制 さ れ る こ と が 知 ら れ て い る 。 ま た 、 こ の プ ロ モ ー タ ー に は 、 T A T A 1 ˜ T A T A 5 と よ ば れ る 5 個 の T A T A 配 列 が あ り 、転 写 に は 上 流 側 に 存 在 す る T A T A 1 と T A T A 2 が 関 与 し て い る こ と が 知 ら れ て い る 。こ の U A S 欠 失 C Y C 1 プ ロ モ ー タ ー の 上 流 に 各 ベ ン ト D N A を 挿 入 し た 結 果 、 転 写 量 が 5 1 . 4 （ T 1 2 ）、 6 3 . 4 （ T 2 0 ）、 5 6 . 4 （ T 2 8 ） 倍 、 そ れ ぞ れ 増 大 す る こ と が 判 明 し た 。次 に 間 接 末 端 標 識 法 、ヌ ク レ オ ソ ー ム リ ピ − ト ア ッ セ イ 、C h I P ア ッ セ イ 、お よ び D N a s e I フ ッ ト プ リ ン ト ア ッ セ イ に よ り ク ロ マ チ ン 構 造 の 解 析 を 詳 細 に 行 っ た 。 そ の 結 果 、（ i ） 上 流 に 超 ら せ ん 様 ベ ン ト D N A が 存 在 す る と 、 プ ロ モ ー タ ー 上 の ヌ ク レ オ ソ ー ム の 並 進 位 相 の 自 由 度 が 増 す （ つ ま り ヒ ス ト ン コ ア が ス ラ イ デ ィ ン グ し 易 く な る ）、（ i i ） ベ ン ト D N A 領 域 に も ヌ ク レ オ ソ ー ム は 形 成 さ れ る が 、 並 進 位 相 の 自 由 度 は 極 め て 高 い 、（ i i i ） 上 流 に 超 ら せ ん 様 ベ ン ト D N A が 存 在 す る と i i と i の 機 構 で プ ロ モ ー タ ー 内 の T A T A 3 配 列 が 環 境 側 に 露 出 し 易 く な る 、（ i v ） 超 ら せ ん 様 ベ ン ト D N A が 存 在 し て も 、 T A T A 1 お よ び T A T A 2 配 列 は ヌ ク レ オ ソ ー ム 内 に 位 置 し た ま ま で 、 し か も そ の 副 溝 は ヒ ス ト ン コ ア 側 に 向 け ら れ て お り 、 転 写 に 寄 与 し な い こ と が 明 ら か に な っ た 。 そ し て 以 上 か ら 、 超 ら せ ん 様 ベ ン ト D N A は 、 ヌ ク レ オ ソ ー ム ス ラ イ デ ィ ン グ を 促 進 す る 機 能 を 持 つ こ と で ク ロ マ チ ン 内 の 転 写 を 活 性 化 で き る こ と が ほ ぼ 明 ら か に な っ た 。

以 上 の 研 究 か ら 、① 超 ら せ ん 様 ベ ン ト D N A の 転 写 活 性 化 は 、マ ウ ス E S 細 胞 で は ゲ ノ ム 上 の 活 性 遺 伝 子 領 域 に 限 定 的 に 起 こ る 、 ② 超 ら せ ん 様 ベ ン ト D N A を 介 し た 転 写 活 性 化 は 、 こ れ ら の 構 造 が ヌ ク レ オ ソ ー ム の ス ラ イ デ ィ ン グ を 容 易 に す る こ と で 起 こ る こ と が ほ ぼ 解 明 さ れ た 。 細 胞 分 化 に 伴 う 超 ら せ ん 様 ベ ン ト D N A の 機 能 変 化 に つ い て は 今 後 の 研 究 課 題 で あ る が 、 当 該 構 造 の 機 能 発 現 機 構 と 有 効 範 囲 を 明 確 に し た こ と は 、 ク ロ マ チ ン 工 学 に お け る 大 き な 第 一 歩 と 考 え ら れ る 。

早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書

氏 名 棚瀬 潤一 印

（２００９年 １１月 現在）

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

論文 ○

○

講演 ○

1. Tanase J., Morohashi N., Fujita M., Nishikawa J., Shimizu M., Ohyama T. Highly efficient chromatin transcription induced by superhelically curved DNA segments: the underlying mechanism revealed by a yeast system (2009)

投稿中

2. Tanase J., Mitani T., Udagawa K., Nishikawa J., Ohyama T. Competence of an artificial bent DNA as a transcriptional activator in mouse ES cells (2009)

投稿中

3. Fukue Y., Sumida N., Tanase J., Ohyama T. A highly distinctive mechanical property found in the majority of human promoters and its transcriptional relevance. (2005) Nucl. Acids. Res. 33, 3821-3827.

1. Tanase J., Udagawa K., Ohyama T. Stable transgene expression based on chromatin engineering. The Wilhelm Bernhard Workshop 21^st International Workshop on the cell Nucleus 2009 Sep. Ustron, Poland

2. Ohyama T., Kimura H., Shimooka Y., Kageyama D., Furuya M., Udagawa K., Tanase J.

How genomic DNA is functionally folded in a nucleus. The Wilhelm Bernhard Workshop 21^st International Workshop on the cell Nucleus 2009 Sep. Ustron, Poland 3. Ohyama T., Tanase J., Kimura H. Genetic information carried in DNA conformation

and properties. EMBO Conference Series on Nuclear Structure and Dynamics 2007 Aug. Montpelier

4. Ohyama T., Sumida N., Tanase J. How promoters are recognized. 7th EMBL Transcription Meeting. 2006 Aug. Heidelberg

5. Fukue Y., Sumida N., Tanase J., Ohyama T. Mechanical properties of DNA: how eukaryotic promoters are recognized. International Symposium on Ran and Cell Cycle 2005 Oct. Awaji

6.

宇田川紘司、山本拓弥、棚瀬潤一、深川竜郎、大山隆．マウス

細胞における 高発現トランスジーンの核内配置．第

回染色体ワークショップ

年

月 姫路

7.

伊藤美月、棚瀬潤一、山内恵里、清水光弘、大山隆．遺伝子発現に有利なクロ マチン構造の人為的構築．第

回日本分子生物学会年会 第

回日本生化学会 年会合同大会 2008 年

月 神戸

8.

藤田仁、諸橋伸行、棚瀬潤一、大山隆、清水光弘．

構造によるクロマチン

の改変と人為的遺伝子発現制御：出芽酵母レポータープラスミドによる解析．第

回日本分子生物学会年会 第

回日本生化学会年会合同大会

年

月

神戸

Ｎｏ.

早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

○

○

著書

9.

棚瀬潤一、宇田川紘司、山本拓弥、伊藤美月、藤井俊輔、三谷匡、大山隆. ク ロマチン工学による外来遺伝子の安定的発現. 第30回日本分子生物学会年会 第

80回日本生化学会年会合同大会 2007年12月

横浜

10.

大山隆、棚瀬潤一、伊藤美月、三谷匡、清水光弘. クロマチン工学のストラテ ジー. 第

回日本分子生物学会年会 第

回日本生化学会年会合同大会

年

月 横浜

11.

三谷匡、川村紘子、笹栗弘貴、横田隆徳、棚瀬潤一、大山隆、田口善智. マウ ス ES 細胞における非 B-型 DNA による shRNA 発現活性化に対する効果. 第

回 日本分子生物学会年会 第

回日本生化学会年会合同大会

年

月 横浜

大山隆、棚瀬潤一、宇田川紘司、木村元、景山大、古屋美香、藤井俊輔、三谷

匡. ゲノム DNA の特性解析と高次遺伝情報の解読. 第

回核ダイナミクス研究 会

年

月 北海道

13. Ohyama T., Sumida N., Fukue Y., Tanase J., Inoue S. Genetic information written in DNA conformation and properties.

第

回日本分子生物学会年会 第

回日本生 化学会年会合同大会

年

月 京都

14.

大山隆、 隅田周志、 棚瀬潤一

クロマチン工学の開拓

第

回細胞核ダイナ ミクス研究会 2006 年

月 熊本

15.

棚瀬潤一、 隅田周志、大山 隆. クロマチン基盤構造の局所的改変とその遺 伝子発現への影響

第

回日本分子生物学会年会

年

月 福岡

16. Fukue Y., Sumida N., Tanase J., Motoyama T., Inoue S., Ohyama T. A highly distinctive mechanical property common to human promoters and its transcriptional relevance.

第

回日本分子生物学会年会

年

月 福岡

17.

大山隆、 福江善朗、 井上正太郎、 隅田周志、 棚瀬潤一. DNA に印された配 列以外の情報を読む. 生理研研究会 2005 年

月 岡崎

18.

隅田周志、 棚瀬潤一、 古屋貴代、 大山 隆

クロマチン内

の回転的ポ ジショニングと遺伝子発現. 第

回日本分子生物学会年会 2004 年

月 神戸

1. Ohyama T., Sumida N., Tanase J., Inoue S., Okabe T. (2006) Genetic information carried in DNA conformation and properties. DNA STRUCTUERE, CHROMATIN AND EXPRESSION pp.71-84 Transworld Research Network (Kerala)