博 士 論 文 概 要

早稲田大学大学院 先進理工学研究科

博   士   論   文   概   要

論 文 題 目

細胞接着因子カドへリン 6 によるマウス 大脳皮質境界形成機構の研究

Research on Mechanisms of Functional Areal Border Formation by Cadherin-6

in the Mouse Cerebral Cortex

申 請 者

寺川 洋平

Youhei Terakawa

電気・情報生命専攻

2012

年

10

月

（ 受 理 申 請 す る 部 科 主 任 会 開 催 年 月 を 記 入 ）

概 要 本 文 1 ペ ー ジ 目 （1 ペ ー ジ あ た り 明 朝 体 11 ポ イ ン ト ３ ６ 文 字 ３ ７ 行 で 3 ペ ー ジ 以 内 ）

本 論 文 は 全

4

章 か ら 構 成 さ れ て お り 、 以 下 に 各 章 の 概 要 を 述 べ る 。

序 章 で は 、 研 究 背 景 及 び 本 研 究 の 目 的 を 述 べ た 。 大 脳 皮 質 は そ れ ぞ れ が 独 自 の 細 胞 構 築 様 式 及 び 神 経 回 路 網 を 有 す る こ と で 固 有 の 情 報 処 理 を 担 う 機 能 領 野 と 呼 ば れ る 情 報 処 理 区 画 か ら な る 非 常 に 複 雑 な 脳 組 織 で あ る 。 大 脳 皮 質 組 織 構 築 過 程 に 関 し て 、 脳 室 帯 か ら 生 み 出 さ れ た 神 経 細 胞 群 が 放 射 状 グ リ ア 細 胞 の 突 起 に 沿 っ て

i n s i d e - o u t

方 式 に 移 動 す る こ と で

6

層 構 造 が 構 築 さ れ る 過 程 は 知 ら れ て い る も の の 、 発 生 過 程 の 皮 質 板 の 中 で 機 能 領 野 の 形 態 的 な 境 界 が 如 何 に し て 規 定 さ れ る の か に つ い て は 今 ま で 明 ら か で は な か っ た 。 ク ラ シ ッ ク カ ド へ リ ン は 細 胞 膜 貫 通 型 の 接 着 因 子 で 、 約

2 0

種 類 の サ ブ ク ラ ス が 存 在 し 、 そ れ ぞ れ が 独 自 の 接 着 特 異 性 を 細 胞 に 賦 与 す る こ と が 知 ら れ て い る 。 実 際 、 組 織 構 築 過 程 に お い て も 個 々 の ク ラ シ ッ ク カ ド へ リ ン は 領 域 特 異 的 な 発 現 様 式 を 示 し 、 細 胞 区 画 の 形 成 ・ 維 持 な ど 様 々 な 発 生 過 程 に 関 与 す る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 重 要 な こ と に 、 大 脳 皮 質 の 形 成 過 程 に お い て 、 カ ド へ リ ン ６ 、 カ ド へ リ ン ８ 、 カ ド へ リ ン

11

な ど が 領 野 及 び 層 に 対 応 し た 発 現 を 示 し て お り 、 既 知 の 機 能 を 合 わ せ て 考 え る と 、 こ れ ら の ク ラ シ ッ ク カ ド へ リ ン の 境 界 が 将 来 の 機 能 領 野 の 境 界 を 規 定 す る の で は な い か と い う 仮 説 が 提 唱 さ れ る 。 た だ 、 遺 伝 子 発 現 は 時 期 に 応 じ て 大 き く 変 化 す る こ と に 加 え て 、 蛍 光 ト レ ー サ ー

( D i I

、

D i O )

の よ う な 曖 昧 な 機 能 領 野 の 指 標 を 利 用 し た 研 究 し か こ れ ま で 行 な わ れ て い な い た め 、 ク ラ シ ッ ク カ ド へ リ ン の 遺 伝 子 発 現 の 変 化 と 機 能 領 野 の 構 築 過 程 の 関 係 性 を 厳 密 に 調 べ た 研 究 は な か っ た 。 こ の 問 題 に 取 り 組 む た め に は 、 複 雑 な 大 脳 皮 質 組 織 構 築 過 程 の 中 で 、 ク ラ シ ッ ク カ ド へ リ ン 遺 伝 子 発 現 細 胞 群 を 時 期 特 異 的 に 標 識 し 、 標 識 細 胞 群 の 挙 動

(

運 命

)

を 機 能 領 野 構 築 様 式 と 対 応 さ せ て 長 期 に 渡 っ て 追 跡 す る 必 要 が あ る も の の 、 ク ラ シ ッ ク カ ド へ リ ン 遺 伝 子 座 が 非 常 に 巨 大 な た め 遺 伝 子 工 学 的 に 取 り 扱 う こ と が 難 し い こ と に 加 え 、 組 み 換 え タ ン パ ク

C r e E R T 2

な ど を 利 用 し た 誘 導 性 遺 伝 的 標 識 系 が 今 ま で 存 在 し な か っ た た め こ の 戦 略 を 実 現 す る こ と が で き な か っ た 。 そ こ で 、 本 研 究 で は 広 大 な ゲ ノ ム 領 域 の 遺 伝 子 操 作 を 可 能 と す る 細 菌 人 工 染 色 体

B a c t e r i a l A r t i f i c i a l C h r o m o s o m e s ( B A C )

を 利 用 し た ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス

( T g )

の 作 出 技 術 を 駆 使 す る こ と で 、 バ レ ル 構 造 と 呼 ば れ る 特 徴 的 な 細 胞 構 築 様 式 を 有 す る 体 性 感 覚 野 に お い て 発 現 を 示 す カ ド へ リ ン

6

遺 伝 子 発 現 細 胞 群 を 特 定 の 時 期 に 標 識 で き る シ ス テ ム を 初 め て 作 出 し 、 カ ド へ リ ン

6

に よ る 体 性 感 覚 野 の 境 界 形 成 機 構 の 詳 細 を 調 べ た 。

第

2

章 で は 、 大 脳 皮 質 組 織 構 築 過 程 に お け る カ ド へ リ ン

6

遺 伝 子 発 現 細 胞 群 の 標 識 系 を 作 出 す る た め に 、異 な る カ ド へ リ ン

6

遺 伝 子 座 を 包 括 す る

B A C

に 対 し て レ ポ ー タ ー 遺 伝 子 修 飾 を 施 し 、そ れ ら の 修 飾 済 み

B A C

に 基 づ い て ト ラ ン ス ジ ェ ニ

N o . 1

概 要 本 文 2 ペ ー ジ 目 （ ３ ６ 文 字 ３ ７ 行 ）

ッ ク マ ウ ス を そ れ ぞ れ 作 出 し た 。 そ の 結 果 、 各 々 の カ ド へ リ ン

6

遺 伝 子 座 を 有 す

る

B A C - T g

は そ れ ぞ れ 大 脳 皮 質 領 野 ・ 層 の 異 な る 部 位 の カ ド へ リ ン

6

遺 伝 子 発 現

を 再 現 す る よ う な レ ポ ー タ ー 遺 伝 子 発 現 を 示 す こ と が 判 明 し 、 特 に カ ド へ リ ン

6

遺 伝 子 座 の

3 ’

側 の ゲ ノ ム 区 画 を 包 括 す る

B A C - T g

の な か で 、 体 性 感 覚 野 に お け る カ ド へ リ ン

6

遺 伝 子 発 現 は 再 現 さ れ る こ と が 明 ら か に な っ た 。 ま た 、 こ の 結 果 か ら 大 脳 皮 質 組 織 構 築 過 程 に お い て 複 雑 な 発 現 様 式 を 示 す カ ド へ リ ン

6

遺 伝 子 は 広 範 囲 に 渡 る 遺 伝 子 座 に 散 在 す る 複 数 の ゲ ノ ム 区 画 か ら 転 写 調 節 制 御 を 受 け る こ と も 明 ら か と な っ た 。本 章 で は 体 性 感 覚 野

I V

層 に お け る カ ド へ リ ン

6

遺 伝 子 発 現 領 域 を 担 う 責 任 領 域 を さ ら に 絞 り 込 む た め に 、

3 ’

側 の ゲ ノ ム 区 画 の 一 部 を 取 り 除 い た

3

種 類 の レ ポ ー タ ー 修 飾 済 み

B A C

ク ロ ー ン を 新 た に 作 成 し 、そ れ ぞ れ に 基 づ い て 作 出 さ れ た ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス の レ ポ ー タ ー 遺 伝 子 発 現 様 式 を 比 較 し た 。 そ の 結 果 、 体 性 感 覚 野

I V

層 の カ ド へ リ ン

6

遺 伝 子 発 現 を 担 う 責 任 領 域 を カ ド へ リ ン

6

遺 伝 子 座 の

3 ’

側 の ゲ ノ ム 区 画 の 中 の 約

5 . 9 k b p

に 絞 れ た 。 以 上 か ら 、 カ ド へ リ ン

6

遺 伝 子 座 を 包 括 す る

B A C - T g

の 作 出 技 術 を 利 用 す る こ と で 、 大 脳 皮 質 組 織 構 築 過 程 に お け る カ ド へ リ ン

6

遺 伝 子 発 現 細 胞 群 の 標 識 系 を 作 出 で き る こ と が 示 さ れ た 。 加 え て 、 大 脳 皮 質 構 築 過 程 に お け る 緻 密 な カ ド へ リ ン

6

遺 伝 子 転 写 調 節 機 構 の 詳 細 も 解 明 さ れ た 。

第

3

章 で は 、

2

章 で 確 立 し た

B A C - T g

の 作 出 技 術 を 駆 使 し て 、 大 脳 皮 質 構 築 過 程 に お け る カ ド へ リ ン

6

に よ る 機 能 領 野 の 境 界 形 成 機 構 の 詳 細 を 調 べ た 。 ま ず 、 生 後 に お け る カ ド へ リ ン

6

の 遺 伝 子 発 現 の 変 化 の 詳 細 を 調 べ る た め に

I n s i t u h y b r i d i z a t i o n ( I S H )

法 や 体 性 感 覚 野 の

I V

層 に お け る カ ド へ リ ン

6

遺 伝 子 発 現 を 再 現 す る

B A C - T g

の レ ポ ー タ ー 遺 伝 子 発 現 の 変 化 を 解 析 し た と こ ろ 、

P 5

ま で に

I V

層 の 中 で カ ド へ リ ン

6

遺 伝 子 発 現 の 境 界 が 形 成 さ れ る こ と が 明 ら か に な っ た 。 次 に 、 カ ド へ リ ン

6

遺 伝 子 発 現 細 胞 群 を 時 期 特 異 的 に 標 識 す る こ と の 可 能 な

C d h 6 - B A C - C r e E R T 2

系 統 の

B A C - T g

を 新 規 に 作 出 し て 、 異 な る 時 期 に 標 識 し た カ ド へ リ ン

6

遺 伝 子 発 現 細 胞 群 の 挙 動

(

運 命

)

を 体 性 感 覚 野 の 構 築 過 程 と 共 に 追 跡 し 比 較 し た 結 果 、 こ の

P 5

ま で に 形 成 さ れ る カ ド へ リ ン ６ 遺 伝 子 発 現 の 境 界 が 将

来 の

B a r r e l

野 と

L i m b

野 の 機 能 領 野 間 の 形 態 的 な 境 界 を 規 定 す る こ と が 示 さ れ た 。

さ ら に 、 ペ レ ッ ト 培 養 系 を 用 い て 、 主 に

I V

層 の カ ド へ リ ン

6

遺 伝 子 発 現 を 再 現 す る

C d h 6 - B A C - n L a c Z

系 統 の 新 生 仔

( P 6 )

の 体 性 感 覚 野 か ら 分 離 し た 細 胞 群 を 培 養 し た と こ ろ 、カ ド へ リ ン ６ を 強 く 発 現 す る

n L a c Z

陽 性 の 細 胞 群 が カ ル シ ウ ム 依 存 的 に 大 き な 凝 集 塊 を 形 成 す る こ と が 明 ら か に な っ た 。 ま た 、 機 能 領 野 構 築 過 程 に お け る カ ド へ リ ン

6

の 役 割 を 調 べ る た め に 、

Te t O n - To l 2

ベ ク タ ー を 利 用 し た 子 宮 内 エ レ ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン 法 を 用 い て カ ド へ リ ン

6

を 皮 質 板 特 異 的 に 過 剰 発 現 し た 際 に

B a r r e l

野 の 構 築 様 式 に 異 常 が 見 ら れ た 。こ れ ら の 結 果 は 、皮 質 板 構 築 過

N o . 2

概 要 本 文 3 ペ ー ジ 目 （ ３ ６ 文 字 ３ ７ 行 ）

程 に お い て 巧 妙 な 発 現 様 式 を 示 す カ ド へ リ ン

6

が

B a r r e l

野 の 境 界 形 成 や 維 持 に 重 要 で あ る こ と を 示 し て い る 。 以 上 の 結 果 は 、 大 脳 皮 質 構 築 過 程 に お い て 、 生 後 に 皮 質 板 の 中 で 形 成 さ れ る ク ラ シ ッ ク カ ド へ リ ン の 遺 伝 子 発 現 の 境 界 が 機 能 領 野 間 の 形 態 的 な 境 界 を 規 定 す る こ と を 初 め て 示 し た 成 果 で あ る 。

第

4

章 で は 第

2

章 と 第

3

章 で 記 述 し た カ ド へ リ ン

6

に よ る 大 脳 皮 質 境 界 形 成 機 構 に 関 し て 本 研 究 で 新 た に 解 明 さ れ た 知 見 を ま と め 、 本 研 究 の 重 要 性 や 今 後 の 研 究 展 望 に つ い て 述 べ た 。 本 研 究 で は 巨 大 な カ ド へ リ ン

6

遺 伝 子 座 を 包 括 で き る

B A C

を 組 み 込 ん だ ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス 作 出 技 術 を 用 い て 、複 雑 な 大 脳 皮 質

組 織 構 築 過 程 の 中 で 特 定 の カ ド へ リ ン

6

遺 伝 子 発 現 細 胞 群 を 時 期 特 異 的 に 標 識 す る こ と の で き る 系 を 新 規 に 作 出 し た 。 そ し て 、 こ の カ ド へ リ ン

6

の 誘 導 性 遺 伝 的 標 識 系 を 利 用 す る こ と で 、 異 な る 時 期 に 標 識 し た カ ド へ リ ン

6

遺 伝 子 発 現 細 胞 群 の 挙 動

(

運 命

)

と 明 確 な 形 態 的 な 特 徴 を 有 す る バ レ ル 構 造 を 有 す る 体 性 感 覚 野 の 発 達 過 程 を 追 跡 し 比 較 す る こ と で 、 カ ド へ リ ン

6

遺 伝 子 発 現 の 境 界 に よ っ て 将 来 の 機 能 領 野 の 境 界 が 規 定 さ れ る こ と を 示 し た 。ま た 、

Te t O n - To l 2

ベ ク タ ー を 利 用 し た 子 宮 内 エ レ ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン 法 に よ り 皮 質 板 に お け る カ ド へ リ ン

6

の 過 剰 発 現 の 領 野 構 築 へ の 影 響 を 調 べ る こ と で 、 カ ド へ リ ン

6

が 細 胞 の 接 着 特 異 性 を 制 御 す る こ と で 機 能 領 野 の 境 界 形 成 や 維 持 に 関 与 す る こ と を 示 し た 。 ク ラ シ ッ ク カ ド へ リ ン 群 は カ ド へ リ ン

6

以 外 に も 大 脳 皮 質 に お い て 領 野 お よ び 層 特 異 的 な 発 現 様 式 を 示 す こ と を 考 慮 す る と 、 本 研 究 で 得 ら れ た 成 果 は 、 発 生 過 程 の 皮 質 板 の 中 に お け る 個 々 の ク ラ シ ッ ク カ ド へ リ ン 群 の 組 み 合 わ せ が 個 々 の 機 能 領 野 の 区 画 を 規 定 す る と い う 仮 説 を 強 く 支 持 す る 。 ま た 、 進 化 的 に も フ ェ レ ッ ト 、 サ ル 、 ヒ ト な ど の 高 等 生 物 に お い て も 、 個 々 の ク ラ シ ッ ク カ ド へ リ ン は 領 野 特 異 的 な 発 現 様 式 を 示 す こ と が 報 告 さ れ て お り 、 本 研 究 結 果 に よ り 提 示 さ れ た ク ラ シ ッ ク カ ド へ リ ン に よ る 機 能 領 野 の 境 界 形 成 機 構 は 進 化 的 に 保 存 さ れ た 重 要 な も の で あ る こ と が 期 待 さ れ る 。 さ ら に 、 近 年 大 脳 皮 質 構 築 過 程 に お け る カ ド へ リ ン

9

と カ ド へ リ ン

1 0

が 自 閉 症 な ど の 病 態 に 関 与 し う る こ と が 報 告 さ れ て お り 、 ク ラ シ ッ ク カ ド へ リ ン の 役 割 の 解 明 は そ う し た 病 態 の 詳 細 な 原 因 を 明 ら か に す る た め の 手 が か り と な る こ と が 大 い に 期 待 さ れ る 。 以 上 に 述 べ た よ う に 、 本 研 究 で 得 ら れ た 大 脳 皮 質 機 能 領 野 構 築 過 程 に お け る ク ラ シ ッ ク カ ド へ リ ン の 境 界 形 成 機 構 や 転 写 調 節 機 構 の 解 明 の 研 究 は 高 次 脳 機 能 疾 患 の 病 態 解 明 お よ び 脳 構 築 様 式 の 進 化 原 理 の 解 明 の 基 盤 と な る と い う 点 で 非 常 に 重 要 で あ る 。

N o . 3

Ｎｏ.1

早稲田大学 博士 （理学） 学位申請 研究業績書

氏 名 寺川 洋平 印

（2012 年 10 月 現在）

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

筆頭論文 (査読有)

共著論文 (査読有)

著書

学会発表

学会発表

学会発表

◯ A sharp cadherin-6 gene expression boundary in the developing mouse cortical plate demarcates the future functional areal border

Youhei W. Terakawa, Yukiko U. Inoue, Junko Asami, Mikio Hoshino, Takayoshi Inoue 2012 August. Cerebral Cortex. Online Published

Bacterial artificial chromosomes as analytical basis for gene transcriptional machineries Junko Asami, Yukiko U. Inoue, Youhei W. Terakawa, Saki F. Egusa, Takayoshi Inoue 2011 August. Transgenic Research. 20: 913-924

◯ Bacterial artificial chromosomes

(chapter7) Bacterial Artifitial Chromosome-Based Experimental Strategies in the Field of

Developmental Neuroscience

Youhei W. Terakawa, Yukiko U. Inoue, Junko Asami, Takayoshi Inoue 2011. InTech. 103-118 (Bacterial artificial chromosomes Chapter7)

細菌人工染色体(BAC)を基盤としたカドへリン６遺伝子転写調節機構の解析 寺川洋平、井上由紀子、浅見淳子、星野幹雄、井上高良

2009年1月 遺伝情報DECODE冬のワークショップ

Genetic trace of mouse neocortical arealization Inoue T, Terakawa YW, Asami J, InoueYU 2009年9月. 第３２回日本神経科学大会

A cortical areal boundary is restricted by cadherin6 expression in the barrel field at the postnatal stages

Terakawa YW, Inoue YU, Asami J, Hoshino M,Sota T, Inoue T 2010年9月. 第３３回日本神経科学大会