博 士 論 文 概 要

早稲田大学大学院 先進理工学研究科

博 士 論 文 概 要

論 文 題 目

配列特異的エンドリボヌクレアーゼの解析手 法の確立及び独立栄養細菌が有する RNA 切断

酵素への適用

A method toward the cleavage-sites identification of sequence-specific

endoribonucleases and its application to those in a chemolithotrophic bacterium

申 請 者

宮本 龍樹 Tatsuki MIYAMOTO

生命医科学専攻 環境生命科学研究

2017 年 12 月

2

微 生 物 は 自 然 界 の あ り と あ ら ゆ る 環 境 に 生 息 し ， 多 岐 に 渡 る 活 動 を 行 っ て い る 。 こ れ ら 微 生 物 が 生 息 す る 環 境 下 で は ，栄 養 塩 の 枯 渇 ，浸 透 圧 ，温 度 お よ び p H の 変 化 ， 乾 燥 ，重 金 属 汚 染 や 抗 生 物 質 投 与 等 ，様 々 な 環 境 変 化 が 目 ま ぐ る し く 起 こ っ て お り ， こ の 中 に は 微 生 物 の 増 殖 阻 害 を 惹 起 す る 環 境 ス ト レ ス 因 子 と し て 作 用 す る も の も 多 い 。 し た が っ て ， 微 生 物 は 長 き に 渡 る 進 化 の 過 程 で ， こ れ ら 環 境 ス ト レ ス に 対 応 す べ く ， 自 身 の 転 写 ・ 翻 訳 を 複 雑 精 緻 に 制 御 す る た め の 機 構 を 獲 得 し て き た 。

To x i n-A n t i t o x i n ( TA ) 機 構 は こ の よ う な ス ト レ ス 応 答 機 構 と し て 名 高 い 。 そ の 名 に 冠 さ れ る 通 り ， 本 機 構 は 毒 性 タ ン パ ク 質 で あ る To x i n と 抗 毒 性 分 子 で あ る A n t i t o x i n か ら 構 成 さ れ る 。 通 常 ，To x i n タ ン パ ク 質 の 毒 性 は A n t i t o x i n 分 子 に よ り 抑 制 さ れ て い る が ， 微 生 物 細 胞 が 環 境 ス ト レ ス に 曝 さ れ た 際 ，A n t i t o x i n が 優 先 的 に 分 解 さ れ ， 細 胞 内 で To x i n が 遊 離 す る 。To x i n 分 子 が 微 生 物 の 増 殖 を 抑 制 す る メ カ ニ ズ ム は 種 々 あ る が ， そ の 中 で 最 も 報 告 例 が 多 い も の は 細 胞 内 R N A の 切 断 ， お よ び そ れ に 続 く タ ン パ ク 質 の 合 成 阻 害 で あ る 。

M a z F は 大 腸 菌 に お い て 初 め て 同 定 さ れ た 代 表 的 な R N A 切 断 型 To x i n で あ り ，

A n t i t o x i n タ ン パ ク 質 M a z E と 共 に M a z E F 機 構 を 構 成 す る 。 既 往 研 究 に よ り ，M a z F

は A C A 配 列 特 異 的 な エ ン ド リ ボ ヌ ク レ ア ー ゼ で あ る こ と が 知 ら れ て い る 。 近 年 ， ス

ト レ ス 環 境 下 で は M a z F を 介 し た R N A の 切 断 に よ り ，大 腸 菌 の 翻 訳 プ ロ フ ァ イ ル が 包 括 的 に「 再 プ ロ グ ラ ミ ン グ 」 さ れ る こ と が 明 ら か と な り ，M a z F の 転 写 後 修 飾 因 子 と し て の 重 要 性 が 認 識 さ れ つ つ あ る 。

大 腸 菌 で の 研 究 が 最 も 進 め ら れ て い る M a z F は ， バ イ オ イ ン フ ォ マ テ ィ ッ ク ス 解 析 に よ り ， そ の ホ モ ロ グ が 古 細 菌 や 真 正 細 菌 に 広 く 散 在 す る こ と が 明 ら か と な っ て い る 。興 味 深 い こ と に ，こ れ ら の 微 生 物 か ら 単 離 さ れ た M a z F の 切 断 配 列 長 (三 〜 七 塩 基) や 切 断 配 列 は 微 生 物 種 ご と に 異 な る 。 し た が っ て ，一 口 に M a z F ホ モ ロ グ と い え ど も ， 細 胞 内 R N A の 選 択 的 分 解 を 介 し た 翻 訳 制 御 機 構 は 微 生 物 種 に 特 有 で あ り ， 種 々 の 微 生 物 に 保 存 さ れ た M a z F の 認 識 切 断 配 列 の 同 定 が 微 生 物 細 胞 に お け る 翻 訳 制 御 機 構 を 理 解 す る 上 で 重 要 で あ る 。

以 上 を 踏 ま え ， 本 研 究 で は M a z F エ ン ド リ ボ ヌ ク レ ア ー ゼ の 解 析 に お い て 枢 要 と な る 切 断 配 列 を 高 感 度 ・ 高 精 度 ・ 高 効 率 に 同 定 す る 手 法 の 構 築 を 目 的 と し た 。ま た ， 構 築 し た 手 法 を ，環 境 微 生 物 が 有 す る M a z F に 用 い る こ と で そ の 切 断 配 列 の 同 定 を 行 っ た 。 本 論 文 は 全 四 章 よ り 構 成 さ れ る 。 以 下 に 各 章 の 概 要 を 述 べ る 。

第 一 章 で は ，To x i n-A n t i t o x i n 機 構 の 分 類 ，お よ び 今 日 ま で に 報 告 さ れ て き た TA 機 構 の 生 物 学 的 意 義 に つ い て 述 べ た 。ま た ，こ れ ま で 単 離 ・ 精 製 さ れ て き た M a z F の 基 質 特 異 性 や そ の 系 統 学 的 広 が り に 関 し て 記 載 し た 。

第 二 章 で は ，M a z F の 切 断 配 列 を 特 定 す る た め の 新 規 手 法 の 開 発 に 関 し て 記 載 し た 。 従 来 ，M a z F を 含 む 配 列 特 異 的 To x i n エ ン ド リ ボ ヌ ク レ ア ー ゼ の 切 断 配 列 の 同 定 に は プ ラ イ マ ー 伸 長 法 が 用 い ら れ て い た 。 し か し な が ら ， こ の 手 法 は ( 1 ) 手 順 が 煩 雑 で あ り ス ル ー プ ッ ト 性 に 乏 し い ，( 2 ) 基 質 R N A の 立 体 構 造 由 来 の ノ イ ズ が 切 断 配 列 と し て 検 出 さ れ る 恐 れ が あ る ，( 3 ) 基 質 中 に 含 ま れ る 配 列 多 様 性 が 低 く ，M a z F の 切 断 配 列 が 含 ま れ な い 可 能 性 が あ る ，( 4 ) 切 断 活 性 の 経 時 的 な 追 跡 が 困 難 で あ る ，( 5 ) 放

3

射 性 同 位 体 を 使 用 す る た め 特 別 な 施 設 を 必 要 と し ， 技 術 に 習 熟 を 要 す る ， 等 の 問 題 が あ る 。 そ こ で 本 研 究 で は ， 超 並 列 シ ー ケ ン シ ン グ 法 に よ り To x i n エ ン ド リ ボ ヌ ク レ ア ー ゼ の 切 断 配 列 を 同 定 す る 手 法 を 構 築 し ， さ ら に 蛍 光 消 光 現 象 を 利 用 し た R N A 切 断 活 性 検 出 法 と 組 み 合 わ せ る こ と で 上 記 の 問 題 の 解 決 を 図 っ た 。

理 論 上 ，M a z F で R N A を 断 片 化 し た 際 ， そ の 5′ 末 端 が M a z F に 切 断 さ れ た 箇 所 と 一 致 す る 。 し た が っ て ， サ ン プ ル を 逆 転 写 後 ， 超 並 列 シ ー ケ ン シ ン グ 法 を 用 い て 解 析 し た 際 ，冗 長 度 が 増 加 す る 塩 基 の 直 前 ・ 直 後 に 頻 出 す る 配 列 が M a z F の 切 断 配 列 で あ る と 考 え た 。ま ず ，認 識 切 断 配 列 が 既 知（A C A 配 列 ）の 大 腸 菌 由 来 M a z F（M a z F e c） を 用 い て 本 ア イ デ ア の 妥 当 性 を 評 価 し た 結 果 ，1 0 0 %の 割 合 で A C A 配 列 が 検 出 さ れ ， 超 並 列 シ ー ケ ン シ ン グ 法 が M a z F の 切 断 配 列 の 同 定 に 有 効 で あ る こ と が 示 さ れ た 。ま た ， 構 造 特 異 的 リ ボ ヌ ク レ ア ー ゼ で あ る R N a s e I I I を 用 い た 際 は ， 特 定 の 配 列 が 検 出 さ れ ず ， 構 築 し た 手 法 が 配 列 特 異 的 エ ン ド リ ボ ヌ ク レ ア ー ゼ で の み 機 能 す る こ と を 確 認 し た 。

次 に 認 識 切 断 配 列 が 未 知 の P s e u d o m o n a s p u t i d a 由 来 の M a z F に 本 手 法 を 適 用 し ，そ の 切 断 配 列 が 同 定 可 能 で あ る か を 検 証 し た 。P. p u t i d a の ゲ ノ ム 上 に 保 存 さ れ た m a z F 遺 伝 子 (m a z Fp p ) を P C R で 増 幅 し ，p E T ベ ク タ ー へ の ク ロ ー ニ ン グ を 行 っ た 。 大 腸 菌 を 宿 主 と し て 本 酵 素 の 発 現 を 行 い ， ア フ ィ ニ テ ィ ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー を 用 い て

M a z F p p を 精 製 し た 。超 並 列 シ ー ケ ン シ ン グ 法 を 用 い て そ の 切 断 配 列 を 探 索 し た 結 果 ，

本 酵 素 が U A C 配 列 特 異 的 な R N A 切 断 酵 素 で あ る と 考 え ら れ た 。 そ こ で 次 に 蛍 光 消 光 現 象 を 利 用 し た R N A 切 断 活 性 検 出 法 に よ り ，超 並 列 シ ー ケ ン シ ン グ 法 の 結 果 を 裏 付 け る こ と と し た 。 本 研 究 で 開 発 し た R N A 切 断 ア ッ セ イ は ， 内 部 に 切 断 候 補 配 列 を 含 み ，5′ 末 端 に レ ポ ー タ ー ，3′ 末 端 に ク エ ン チ ャ ー を 修 飾 し た オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ

ド と M a z F を 混 合 し て イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン を 行 う 。 通 常 ， 蛍 光 共 鳴 エ ネ ル ギ ー 移 動

（F R E T） に よ り ，5′ 末 端 の レ ポ ー タ ー が 消 光 状 態 に あ る が ， オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド

内 部 に 含 ま れ る 配 列 が M a z F の 切 断 配 列 と 一 致 し た 場 合 ，オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド が 切 断 さ れ ，F R E T の 解 消 に よ っ て レ ポ ー タ ー の 蛍 光 が 回 復 す る 。 様 々 な 配 列 の オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド と M a z F p p を 混 合 し た と こ ろ ， 内 部 に U A C が 含 ま れ る オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド に お い て の み ， 蛍 光 強 度 の 迅 速 な 上 昇 が 確 認 さ れ た 。 以 上 の 結 果 か ら ，M a z F p p が

U A C 特 異 的 な R N A 切 断 型 To x i n 分 子 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 ま た U A C 配 列

を 含 ま な い 転 写 産 物 が M a z F p pに よ る 分 解 を 受 け な い こ と を ゲ ル 電 気 泳 動 で ，M a z F p p が R N A を U / A C 間( /は R N A 切 断 箇 所 を 示 す) で 切 断 す る こ と を 5′R A C E 解 析 に よ っ て 確 認 し ， 超 並 列 シ ー ケ ン シ ン グ 法 と 蛍 光 消 光 現 象 を 利 用 し た R N A 切 断 活 性 検 出 法 の 組 み 合 わ せ に よ り ，M a z F の 切 断 配 列 を 高 感 度 ・ 高 精 度 ・ 高 効 率 に 特 定 可 能 で あ る こ と を 明 ら か と し た 。

第 三 章 で は 第 二 章 で 構 築 し た 一 連 の 手 法 を 用 い て ， 化 学 独 立 栄 養 細 菌 N i t ro s o m o n a s e u ro p a e a が 有 す る M a z F の 解 析 を 行 っ た 。通 常 ，微 生 物 ゲ ノ ム 上 に は 零 も し く は 一 組 の m a z E F 遺 伝 子 が 存 在 す る の み で あ る が ， 驚 く べ き こ と に ， 本 微 生 物 の ゲ ノ ム 上 に は 5 組 も の m a z E F 機 構 の 存 在 が 予 見 さ れ て い る 。 ま た 本 微 生 物 は 多 種 多 様 な 環 境 変 化 に 反 応 し ， そ の 増 殖 速 度 や 遺 伝 子 発 現 を 変 化 さ せ る こ と が 知 ら れ て

4

い る 。 こ の よ う に ゲ ノ ム 情 報 ， 生 理 学 的 知 見 ， お よ び 分 子 生 物 学 的 知 見 が 蓄 積 さ れ た 本 微 生 物 は ， 構 築 し た 手 法 を 適 用 す る 魅 力 的 な モ デ ル で あ る と 考 え ら れ た 。

N . e u ro p a e a の 染 色 体 上 に お け る 遺 伝 子 座 N E 0 9 2 1 お よ び N E 11 8 1 に コ ー ド さ れ た m a z F 遺 伝 子 (m a z Fn e 1 お よ び m a z Fn e 3 ) を 取 得 し ， 大 腸 菌 を 宿 主 と し て こ れ ら 異 種 タ ン パ ク 質 を 発 現 さ せ た 。 こ れ ら の 酵 素 の 単 離 ・ 精 製 を 行 っ た 後 ， 超 並 列 シ ー ケ ン シ ン グ 法 お よ び R N A 切 断 活 性 検 出 法 を 用 い て 両 酵 素 の 基 質 特 異 性 を 検 討 し た 結 果 ， M a z F n e 1 お よ び M a z F n e 3 が そ れ ぞ れ U G G お よ び A A U を 切 断 す る こ と が 判 明 し た 。

そ こ で N . e u ro p a e a の ゲ ノ ム 配 列 を 参 照 し ，M a z F n e 1 お よ び M a z F n e 3 の 細 胞 内 主 要 標 的 を 推 定 す る こ と と し た 。 こ れ ら 遺 伝 子 は 細 胞 内 で 優 先 的 に ノ ッ ク ダ ウ ン さ れ る と 考 え ら れ る 。 各 遺 伝 子 に 含 ま れ る 塩 基 配 列 の 割 合 ， 各 遺 伝 子 の 長 さ を 考 慮 し ， そ の 遺 伝 子 に 含 ま れ る 切 断 配 列 含 有 数 が 多 い も の を 抽 出 し た 。 そ の 結 果 ，M a z F n e 1 の 切 断 配 列 で あ る U G G 配 列 は ヒ ド ロ キ シ ア ミ ン オ キ シ ド レ ダ ク タ ー ゼ や リ ブ ロ ー ス

-1 , 5-ビ ス リ ン 酸 カ ル ボ キ シ ラ ー ゼ/オ キ シ ゲ ナ ー ゼ と い っ た ア ン モ ニ ア 酸 化 細 菌 に

特 有 な 酵 素 を コ ー ド す る 遺 伝 子 に 非 常 に 多 く 保 存 さ れ て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。 こ れ ら 酵 素 は ア ン モ ニ ア 酸 化 や 炭 酸 固 定 に 重 要 と な る 。 し た が っ て ，M a z F n e 1 が 細 胞 内 で 遊 離 す る よ う な 環 境 ス ト レ ス 下 で は ， 本 微 生 物 の エ ネ ル ギ ー ・ 還 元 力 獲 得 系 や 生 合 成 系 が 停 止 す る こ と が 予 測 さ れ ， 本 酵 素 が 遅 増 殖 性 の 一 因 で あ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 一 方 ，M a z F n e 3 の 切 断 配 列 で あ る A A U の 含 有 率 が 高 い 遺 伝 子 群 を 同 様 に 抽 出 し た 際 に は ， 独 立 栄 養 細 菌 特 異 的 な 遺 伝 子 や 共 通 し た 特 徴 は 見 ら れ な か っ た 。

次 に 各 遺 伝 子 よ り ， 切 断 配 列 が 含 ま れ な い 遺 伝 子 群 の 抽 出 を 行 っ た 。 こ れ ら 遺 伝 子 群 は 各 M a z F が 細 胞 内 で 遊 離 し た 際 に 優 先 的 に 翻 訳 さ れ る こ と が 予 測 さ れ る 。 M a z F n e 1 の 切 断 配 列 で あ る U G G を 含 ま な い 遺 伝 子 を 抽 出 し た 際 は 特 に 共 通 し た 性 質 を 発 見 す る こ と は で き な か っ た が ，M a z F n e 3 の 切 断 配 列 で あ る A A U 配 列 を 含 ま な い 遺 伝 子 群 を 抽 出 し た 際 は ，水 銀 耐 性 に 関 わ る 遺 伝 子 群(m e r E, m e r P, m e r T) を 発 見 す る こ と が で き た 。こ れ ら 三 遺 伝 子 は 水 銀 分 子 の 輸 送 に 関 わ る こ と が 知 ら れ て お り ， こ の こ と か ら M a z F n e 3 が 遊 離 し た 細 胞 内 で は ， 水 銀 の 輸 送 能 が 向 上 し ， 水 銀 の 無 毒 化 を 促 す 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。こ の よ う に M a z F の 切 断 配 列 を 同 定 す る こ と で ，そ の 酵 素 学 的 特 性 と 微 生 物 生 理 学 的 な 知 見 を 結 び つ け て 考 え る こ と が 容 易 と な っ た 。

第 四 章 で は 本 論 文 の 総 括 お よ び 今 後 の 展 望 を 述 べ た 。

以 上 ，本 研 究 で は M a z F の 切 断 配 列 特 定 手 法 を 構 築 し ，硝 化 細 菌 に 保 存 さ れ た M a z F に 適 用 し ，そ の 基 質 特 異 性 を 明 ら か と し た 。本 研 究 で 構 築 し た 一 連 の ス キ ー ム は ，「 特 定 環 境 ス ト レ ス 下 で の 翻 訳 プ ロ フ ァ イ ル の 変 化 が ど の よ う な 生 物 学 的 メ カ ニ ズ ム の も と 調 整 さ れ て い る か に 関 す る 知 見 の 獲 得 」， お よ び 「 ど の よ う な タ ン パ ク 質 が ス ト レ ス 耐 性 に 重 要 で あ る か の 推 定 」 に 有 用 で あ る 。 今 後 ， 本 研 究 で 開 発 し た 手 法 を 真 正 細 菌 や 古 細 菌 に 保 存 さ れ た 種 々 の M a z F に 適 用 し て い く こ と で ， 微 生 物 細 胞 に お け る M a z E F 機 構 へ の 理 解 が さ ら に 深 ま る こ と が 期 待 さ れ る 。

Ｎｏ.

早稲田大学 博士（工学） 学位申請 研究業績書

氏 名 宮本 龍樹 印

（2018年2月9日 現在）

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

論文

○

○

その他

1. Miyamoto T, Yokota A, Tsuneda S, Noda N. AAU-Specific RNA Cleavage Mediated by MazF Toxin Endoribonuclease Conserved in Nitrosomonas europaea. Toxins (Basel). 2016;

8(6). doi:10.3390/toxins8060174.

2. Miyamoto T, Kato Y, Sekiguchi Y, Tsuneda S, Noda N. Characterization of MazF-Mediated Sequence-Specific RNA Cleavage in Pseudomonas putida Using Massive Parallel

Sequencing. PLoS One. 2016; 11(2): e0149494. doi:10.1371/journal.pone.0149494.

1. Miyamoto T, Ota Y, Yokota A, Suyama T, Tsuneda S, Noda N. Characterization of a Deinococcus radiodurans MazF: A UACA-specific RNA endoribonuclease.

MicrobiologyOpen. 2017. Epub 2017/07/05. doi: 10.1002/mbo3.501.

2. Furuta A, Tsubuki M, Endoh M, Miyamoto T, Tanaka J, Salam KA, et al. Identification of Hydroxyanthraquinones as Novel Inhibitors of Hepatitis C Virus NS3 Helicase. Int J Mol Sci. 2015;16(8):18439-53. doi: 10.3390/ijms160818439.

Ｎｏ.

早稲田大学 博士（工学） 学位申請 研究業績書

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

講演

1. Miyamoto T, Yokota A, Ota Y, Tsuneda S, Noda N. Characterization of a chromosomal toxin-antitoxin module conserved in Nitrosomonas europaea, How Dead Is Dead V, Vienna, Austria, September 2017

2. 宮本 龍樹，横田 亜紀子，大田 悠里，常田 聡，野田 尚宏，硝化細菌におけるスト

レス応答機構の解明: Toxin-antitoxin機構はなぜ必要なのか？，第二回環境微生物系学 会合同大会2017，仙台，2017年8月

3. Miyamoto T, Yokota A, Tsuneda S, Noda N. Characterization of a sequence-specific cutter conserved in the Nitrosomonas europaea chromosome, The 7th Congress of European Microbiologists (FEMS 2017), València, Spain, July 2017

4. Miyamoto T, Tsuneda S, Ysekiguchi Y, Noda N. The identification method for the sequence pattern at the cleavage sites of MazF family endoribonucleases using massive parallel sequencing, The 6th Congress of European Microbiologists (FEMS 2015), Maastricht, The Netherlands, June 2015