博博博博 士士士士 論論論論 文文文文 概概概概 要要要要

早稲田大学大学院 先進理工学研究科

博 博 博

博 士 士 士 士 論 論 論 論 文 文 文 文 概 概 概 概 要 要 要 要

論 論 論

論 文 文 文 文 題 題 題 題 目 目 目 目

Studies of Oxidative Stress, Inflammation and Muscle/Renal Damage Following Endurance Exercise

持久性運動による酸化ストレス

炎症と筋

腎傷害の研究

申 請 者

Kaoru SUGAMA

菅間 薫

共同先進健康科学専攻 応用免疫学研究

2012 年 1 2 月

No.1

本 博 士 学 位 論 文 で は 、ト ラ イ ア ス ロ ン 選 手 の デ ュ ア ス ロ ン 競 技 ( ラ ン -5km、バ イ ク -40km、ラ ン -5km) に よ る 持 久 性 運 動 負 荷 に よ り 惹 き 起 こ さ れ る 筋 損 傷 と 急 性 腎 傷 害 に つ い て 、 発 症 に 関 与 す る 因 子 （ 炎 症 反 応 、 酸 化 ス ト レ ス 反 応 ） に つ い て 検 討 す る と と も に 、 関 連 因 子 の 血 中 レ ベ ル の 変 動 と 、 尿 中 排 泄 量 の 変 化 に つ い て も 検 討 を 行 い 、 そ れ ら 因 子 の メ カ ニ ズ ム へ の 関 与 や マ ー カ ー と し て の 有 用 性 に つ い て 評 価 す る こ と を 目 的 と し た 。

近 年 、 幅 広 い 年 齢 層 の 人 々 に よ り 健 康 増 進 の た め に 日 常 的 な ラ ン ニ ン グ が 行 わ れ て い る 。 適 度 な 運 動 は 健 康 の 維 持 や 増 進 、 さ ら に 順 化 の 効 果 も 加 わ り 、 有 用 で あ る こ と が 知 ら れ て い る 。 ま た 、 持 久 性 運 動 に お い て は 、 活 性 酸 素 の 産 生 亢 進 や 通 常 は 血 中 に 認 め ら れ な い 種 々 の サ イ ト カ イ ン の 上 昇 (cytokine storm)が 認 め ら れ る 一 方 で 、 抗 酸 化 シ ス テ ム や 抗 炎 症 機 構 の 上 昇 も 同 時 に 生 じ る た め 、 重 篤 な 組 織 傷 害 や 機 能 障 害 へ 進 行 す る こ と は ほ と ん ど な い 。 し か し 、 過 度 （ 高 強 度 、 長 時 間 、 休 養 不 足 ） な 持 久 性 運 動 は 健 康 を 害 す る 可 能 性 が あ る 。 さ ら に マ ラ ソ ン や ト ラ イ ア ス ロ ン の よ う な 長 距 離 の 持 久 性 レ ー ス に お い て は 、年 々 記 録 が 更 新 さ れ 、 選 手 は 益 々 自 分 自 身 に 厳 し い 練 習 を 課 す こ と に な る 。 こ の よ う な 状 況 か ら も 、 持 久 性 運 動 誘 導 性 の 疾 病 や 障 害 の メ カ ニ ズ ム の 解 明 、 マ ー カ ー の 探 索 評 価 な ど は 重 要 な 課 題 で あ る 。

運 動 誘 発 性 筋 損 傷 は よ く 知 ら れ て い る 。 筋 損 傷 部 位 で は ミ オ グ ロ ビ ン （ M b） や ク レ ア チ ン キ ナ ー ゼ （ CK） が 逸 脱 し 、 血 中 濃 度 が 上 昇 す る 。 ま た 筋 損 傷 部 位 で は 好 中 球 や 単 球 な ど の 炎 症 細 胞 の 浸 潤 が 認 め ら れ て い る 。 ま た 、 持 久 性 運 動 に よ る イ ン タ ー ロ イ キ ン ( IL)-6 の 血 中 濃 度 の 上 昇 は 顕 著 で あ る 。さ ら に 好 中 球 が 含 有 す る ミ エ ロ ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ（ MPO）は 好 中 球 に よ る 活 性 酸 素 産 生 機 構 の 触 媒 酵 素 で あ る が 、 こ の MPO ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス に よ る 実 験 で は 、 wild-type の マ ウ ス に 比 べ て 筋 膜 の 溶 解 の 有 意 な 減 少 が 認 め ら れ て い る 。 こ れ ら の こ と よ り 、 持 久 性 運 動 後 の 筋 傷 害 を 促 進 す る MPO を 含 有 す る 好 中 球 や IL-6 の 増 加 に 伴 い 産 生 さ れ る 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン な ど の 好 中 球 活 性 化 因 子 の 存 在 が 示 唆 さ れ る が 、 活 性 化 因 子 や メ カ ニ ズ ム つ い て は 解 明 さ れ て い な い 。 さ ら に 、 持 久 性 運 動 に よ る 生 体 内 サ イ ト カ イ ン バ ラ ン ス の 側 面 か ら の 検 討 も 重 要 で あ る 。 持 久 性 運 動 で は 2 型 ヘ ル パ ー T

（ Th2）細 胞 が 優 位 で は な い か と さ れ て い る が 、い ま だ 不 明 な 点 が 多 い 。そ こ で 近 年 、 新 た な パ ラ ダ イ ム シ フ ト と し て 注 目 さ れ て い る ヘ ル パ ー T 細 胞 の サ ブ セ ッ ト で あ る Th17 の 産 生 サ イ ト カ イ ン に 着 目 し た 。 T h 1 7 は I L -6 の 存 在 下 で 誘 導 さ れ 、 産 生 さ れ た IL-17 は IL-23 に よ り 活 性 化 さ れ る 。 ま た 好 中 球 遊 走 能 を も つ 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン で あ る 。そ こ で 本 学 位 申 請 論 文 の 第 1 章 を 構 成 す る 研 究 課 題 ” IL-17, neutrophil activation and muscle damage following endurance exercise” で は 、 IL-17 の 筋 傷 害 へ の 関 与 を 仮 説 と し 、 検 討 を 行 っ た 。

公 式 の デ ュ ア ス ロ ン 競 技 に 参 加 し た 男 性 選 手 14 名 （ 平 均 28.7±7.9(SD)歳 ） を 被 験 者 と し 、 競 技 前 安 静 時 (pre)、 競 技 ゴ ー ル 直 後 (0h)、 ゴ ー ル よ り 1.5 時 間 後 (1.5h)お よ び ゴ ー ル よ り 3 時 間 後 (3h)の 4 ポ イ ン ト で 採 取 し た 血 液 と 尿 に つ い て 、 血 球 分 画 、 ス ト レ ス お よ び 炎 症 マ ー カ ー の 持 久 性 運 動 に と も な う 変 動 を 解 析 し 検 討 し た 。そ の 結 果 、血 中 の Mb、MPO、IL-17 お よ び IL-23 は 有 意 な 上 昇 を 示 し た 。 NFκ B の 活 性 化 か ら マ ク ロ フ ァ ー ジ を 介 す る 炎 症 の 惹 起 を 促 す 血 中 の soluble receptor activator of nuclear factor(NF)-κ B ligand (sRANKL)は 有 意 傾 向 の 変 化 に と ど ま っ た 。ま た 尿 中 で は MPO は 有 意 傾 向 に と ど ま っ た が 、Mb、IL-17、IL-23 お よ び sRANKL の 総 排 泄 量 は 有 意 な 変 動 を 示 し た 。さ ら に 尿 中 の Mb 、MPO、IL-17、

IL-23 お よ び sRANKL の area under the curve (AUC:pre+0h+1.5h+3h)に は 相 互 に 有 意 な 相 関 が 認 め ら れ 、筋 損 傷 マ ー カ ー で あ る Mb と 有 意 な 相 関 が 認 め ら れ た 。こ の 結 果 よ り IL-6 存 在 下 に 誘 導 さ れ 、IL -23 に よ り 活 性 化 さ れ た IL-17 は 持 久 性 運 動 に よ り 好 中 球 の 活 性 化 と 筋 損 傷 を 促 進 す る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。し か し 、IL-17 の 産 生 細 胞 の 解 明 お よ び 循 環 血 中 の 各 因 子 と 尿 排 泄 さ れ た 因 子 の 関 連 性 を 明 ら か に す る こ と が 今 後 の 課 題 と し て 残 さ れ た 。 本 研 究 は 9^{t h}International Symposium of Exercise Immunology (Tubingen, GERMANY). 21-23. Sep. 2009 (poster presentation)と 2010 International Conference of Exercise Physiology (Chngbuk, KOREA 26. Nov. 2010 (oral presentation)に て 発 表 し た 後 、 す で に 国 際 学 術 誌 Exercise Immunology Review. 18: 116-127, Sep. 2012.に 掲 載 さ れ て い る 。

次 に 、 血 中 と 尿 排 泄 の 関 連 性 の 解 明 の ひ と つ と し て 、 持 久 性 運 動 に よ る 腎 機 能 の 障 害 に つ い て 検 討 し た 。 持 久 性 運 動 に よ り 生 体 内 で は 酸 素 摂 取 量 の 増 加 や 虚 血 再 灌 流 な ど に よ る 活 性 酸 素 の 増 加 が 起 こ る 一 方 、 内 因 性 の 抗 酸 化 物 質 の 消 費 も 増 加 す る こ と に よ る ア ン バ ラ ン ス な 状 態 に よ り 酸 化 ス ト レ ス や 細 胞 組 織 傷 害 が 惹 起 さ れ る 。 ま た 、 持 久 性 運 動 に よ り 糸 球 体 濾 過 量 の 減 少 や 尿 排 泄 量 の 減 少 が 起 こ る こ と が よ く 知 ら れ て い る 。 近 年 急 性 腎 不 全 の 初 期 に 発 生 し 、 生 命 予 後 が 不 良 で あ る 急 性 腎 障 害 (acute kidney injury:AKI)が 注 目 さ れ て い る が 、 持 久 性 運 動 誘 発 性 の AKI と し て は 横 紋 筋 融 解 症 が 知 ら れ て い る 。 ま た 、 持 久 性 運 動 で は 血 液 の 再 分 配 に よ る 腎 で の 虚 血 や 運 動 後 の 再 灌 流 が 起 こ る が 、 虚 血 再 灌 流 に よ る AK I の 報 告 は 多 い 。 腎 で の 虚 血 再 灌 流 後 に 腎 中 で の 発 生 が 認 め ら れ て い る 因 子 と し て 、 チ オ レ ド キ シ ン （ TRX）、 monocyte chemoattractant protein (MCP)-1、 イ ン タ ー ロ イ キ ン (IL)-8、 補 体 成 分 (C5a)、 IL-10 が 報 告 さ れ て い る 。 TRX は レ ド ッ ク ス 制 御 、 抗 酸 化 作 用 や 炎 症 細 胞 遊 走 の 制 御 能 を 有 し 、 酸 化 ス ト レ ス 応 答 性 で 上 昇 を 示 す 。 MCP-1 は マ ク ロ フ ァ ー ジ （ M φ ）、 IL-8 は 好 中 球 の 遊 走 活 性 を も ち 、 い ず れ も 腎 実 質 細 胞 で 産 生 さ れ る 。 MCP-1 は Mφ か ら も 産 生 れ る 。 C5a は Mφ や 好 中 球 等 炎 症 細 胞 の 遊 走 活 性 を も ち 、 IL-10 は 抗 炎 症 サ イ ト カ イ ン で 、 腎 傷 害 の 修 復 へ の 関 与 が

No.3

報 告 さ れ て お り 、M φ や 制 御 性 T 細 胞 か ら 産 生 さ れ る と の 報 告 が あ る 。そ こ で 本 学 位 申 請 論 文 の 第 2 章 を 構 成 す る 研 究 課 題 ” Thioredoxin, C5a, inflammation related substances and acute renal injury following endurance exercise”

で は 、研 究 目 的 を 1 ）持 久 性 運 動 に よ る AKI の 評 価 、2)尿 中 TRX、MCP-1、C5a、IL-8 お よ び IL-10 の 変 動 と 持 久 性 運 動 に よ る 急 性 腎 傷 害 で の 傷 害 の 程 度 や 炎 症 反 応 と の 関 連 性 の 評 価 、 3 )こ れ ら 尿 中 の 因 子 が 持 久 性 運 動 に お い て も 腎 傷 害 の 有 用 な マ ー カ ー と な り う る か に つ い て の 評 価 を 行 っ た 。

実 験 条 件 と サ ン プ ル 採 取 に つ い て は 第 1 章 で 述 べ た 。 そ れ ら の 血 液 サ ン プ ル で 腎 機 能 マ ー カ ー で あ る ク レ ア チ ニ ン ( Cr)を 測 定 し 、 尿 の サ ン プ ル で は 尿 沈 渣 、 尿 量 、ア ル ブ ミ ン (ALB)、ク レ ア チ ニ ン (Cr )、β -N-acetyl-D-glucosaminidase (NAG) 活 性 、TRX、MCP-1、C5a、 IL-8、お よ び IL-10 の 1 分 間 当 た り の 尿 中 排 泄 量 (尿 中 排 泄 率 ) を 測 定 し 解 析 し た 結 果 、 14 名 の 被 験 者 の レ ー ス タ イ ム 上 位 8 名 中 7 名 の 尿 沈 渣 に 尿 細 管 上 皮 細 胞 が 認 め ら れ 、 運 動 強 度 が 高 い ほ ど 尿 細 管 傷 害 が 発 生 し や す い 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。そ こ で 尿 細 管 上 皮 が 認 め ら れ た 7 名 を damage 群 、認 め ら れ な か っ た 群 を m inor-damage 群 と し て 検 討 し た 。持 久 性 運 動 後 の AKI の 評 価 は

“Risk, Injury, Failure, Loss, End Stage Kidney Disease ESKD (ESKD): RIFLE criteria”と“acute kidney network injury: AKIN”の基 準 に 従 い 血 中 Cr と 尿 量 で 行 っ た 結 果 、 血 中 Cr 増 加 と 乏 尿 が 認 め ら れ 、 一 過 性 に AKI の R isk ま た は Stage1 レ ベ ル に な る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。さ ら に レ ー ス 後 3h で の 炎 症 に お い て も 増 加 傾 向 の 被 験 者 が 確 認 さ れ た 。 尿 排 泄 率 は 持 久 性 運 動 に よ り NAG 活 性 、 TRX、 MCP-1、 C 5a、 IL-10 の damage 群 の み で 有 意 な 上 昇 が 認 め ら れ た こ と よ り 、 こ れ ら の 因 子 は 尿 細 管 傷 害 を よ り 鋭 敏 に 反 映 し て 上 昇 す る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 さ ら に 各 因 子 の 尿 排 泄 率 間 の 時 間 ご と の 相 関 で は 、 damage 群 に お い て TRX の 尿 排 泄 率 と C5a、 IL -8、 IL-10 の 尿 排 泄 率 間 に 有 意 な 負 の 相 関 が 認 め ら れ 、 TRX は 、 0h の IL-10 の 影 響 を 受 け る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 ま た TRX は 、 C5a、 IL-8 に 対 し て は 遊 走 活 性 や 炎 症 過 程 を 調 整 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。さ ら に damage 群 で は 、TRX は 7 名 中 6 名 の 被 験 者 で 尿 沈 渣 に 尿 細 管 上 皮 が 認 め ら れ た タ イ ム ポ イ ン ト で ピ ー ク 値 を 示 し 、 傷 害 の 原 因 と な る 酸 化 ス ト レ ス の 発 生 に 応 答 し た こ と が 示 唆 さ れ た 。 C5a、 IL-8、 IL-10 は 尿 細 管 上 皮 が 認 め ら れ た タ イ ム ポ イ ン ト よ り 急 激 に 上 昇 し 始 め 、 MCP-1 は 尿 細 管 上 皮 が 3h で も 確 認 さ れ 傷 害 の 遷 延 化 が 示 唆 さ れ る 場 合 、よ り 大 き な 増 加 が 認 め ら れ る た め 、 傷 害 の 発 生 と 程 度 を 反 映 し て 上 昇 し 、 マ ー カ ー と し て の 有 用 性 も 示 唆 さ れ た 。 さ ら に pre 値 の IL-8 と IL-10 レ ベ ル か ら 持 久 性 運 動 に よ る 傷 害 の 進 行 状 況 の 予 測 が で き る 可 能 性 も 示 唆 さ れ た が 、 レ ー ス 後 3h 以 降 の 確 認 が 課 題 と し て 残 さ れ た 。

本 博 士 学 位 論 文 で 示 さ れ た 競 技 選 手 の 筋 ・ 腎 傷 害 に 関 す る デ ー タ は メ カ ニ ズ ム の 一 端 の 解 明 と 競 技 前 後 の 傷 害 の 回 復 状 況 の モ ニ タ リ ン グ の 基 礎 的 知 見 と な り 、 幅 広 い 年 代 層 の 運 動 傷 害 を 予 防 す る た め に 応 用 で き る 可 能 性 が あ る 。

No.1

早稲田大学 早稲田大学 早稲田大学

早稲田大学 博士（生命科学） 博士（生命科学） 博士（生命科学） 博士（生命科学） 学位申請 学位申請 学位申請 学位申請 研究業績書 研究業績書 研究業績書 研究業績書

氏 名 菅間 薫 印

（2013年 2月 現在）

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

a:論文

e: その他

（論文）

e: 研究報 告書

○IL-17, neutrophil activation and muscle damage following endurance exercise.

Exerc Immunol Rev. 18: 116-127, Sep. 2012. KaoKaoKaoKaoru Sugamaru Sugamaru Sugamaru Sugama, Katsuhiko Suzuki,Kayo Yoshitani, Koso Shiraishi, Takashi Kometani.

新規好中球機能検査法を応用した植物抽出物の機能性評価.日本補完代替医療学会誌.

9(2): 89-95, 2012 年 9 月. 鈴木克彦, 駒場優太, 泊美樹, 鈴木洋子, 菅間薫菅間薫菅間薫菅間薫, 高橋将記, 三浦茂樹, 吉岡浩, 森有一.

新規好中球機能検査法によるオリゴノールの機能解析. 日本補完代替医療学会誌.10(1):

印刷中, 2013 年 3 月. 鈴木克彦, 泊美樹, 菅間薫菅間薫菅間薫菅間薫, 北舘健太郎, 三浦茂樹, 吉岡浩, 森 有一.

新規好中球機能検査法によるクルクミンの抗酸化・抗炎症作用の評価. 臨床化学. 41 (4):

343-348, 2012 年 10 月. 鈴木克彦, 泊美樹, 高橋将記, 菅間薫菅間薫菅間薫菅間薫, 大塚喜彦, 今泉厚, 三 浦茂樹, 吉岡浩, 森有一.

運動による自覚的疲労度とストレスホルモン・サイトカインとの関連性. 日本補完代替 医療学会誌. 8 (2): 67-73. 2011 年 9 月. 石渡智子, 森藤雅史，石島寿道, 青山友子，

菅間薫菅間薫

菅間薫菅間薫，神田和江，鈴木克彦，樋口満.

月経周期と持久性運動による唾液の酸化ストレス指標の変動. 日本補完代替医療学会誌.

7 (2): 125-128, 2010 年 9 月. 林田はるみ, 志村まゆら, 菅間薫菅間薫菅間薫菅間薫, 神田和江, 鈴木克彦.

Haplotype-based case-control study of receptor (calcitonin) activity-modifying protein-1 gene in cerebral infarction. J Hum Hypertens. 24(5):351-358, May. 2010.

Nakazato Tatsuo, Tomohiro Nakayama, Takahiro Naganuma, Naoyuki Sato, Zhenyan Fu, Zhao Xia Wang, Masayoshi Soma, Kaoru Kaoru Kaoru Kaoru SugamaSugamaSugama, Shigeaki Hinohara, Nobutaka Doba. Sugama

好中球機能・サイトカイン産生能からみた各種人工血小板素材の in vitro 評価. H12(ADP) リポゾームの人工血小板としての前臨床評価(効力と安全性). 平成 21 年度 厚生労働科 学研究費補助金(創薬基盤推進研究事業: 政策創薬総合研究事業)分担研究報告書. 鈴木 克彦, 鈴木 洋子, 菅間菅間菅間菅間 薫薫薫薫, 神田 和江, 沢田 秀司, 勝野 俊介, 武岡 真司.

好中球機能を用いた血小板減少・外傷性出血における人工血小板投与の in vivo 評価.

H12(ADP)リポゾームの人工血小板としての前臨床評価(効力と安全性). 平成 22 年度 厚 生労働科学研究費補助金(創薬基盤推進研究事業: 政策創薬総合研究事業)分担研究報告 書. 鈴木 克彦, 木下 学, 西川 可穂子, 宮崎 裕美, 齊藤 大蔵, 神田 和江, 沢田 秀 司, 溝上 翼, 菅間菅間菅間 薫菅間 薫薫薫, 勝野 俊介, 武岡 真司.

No.2

早稲田大学 早稲田大学 早稲田大学

早稲田大学 博士（生命科学） 博士（生命科学） 博士（生命科学） 博士（生命科学） 学位申請 学位申請 学位申請 学位申請 研究業績書 研究業績書 研究業績書 研究業績書

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

e: 学会発

表 Kaoru SugamaKaoru SugamaKaoru SugamaKaoru Sugama, Katsuhiko Suzuki,Kayo Yoshitani, Koso Shiraishi, Takashi Kometani.

IL-17, neutrophil activation and muscle damage following endurance exercise. 2010 International Conference of Exercise Physiology (Chngbuk, KOREA). 26. Nov. 2010 (oral presentation).

Kaoru Sugama Kaoru Sugama Kaoru Sugama

Kaoru Sugama, Katsuhiko Suzuki,Kayo Yoshitani, Koso Shiraishi, Takashi Kometani.

IL-17, neutrophil activation and muscle damage following endurance exercise. 9^th International Symposium of Exercise Immunology (Tubingen, GERMANY). 21-23. Sep.

2009 (poster presentation).

菅間 菅間 菅間

菅間 薫薫薫, 中山 智祥, 羽毛田 公, 小菅 琴子, 青井 則子, 佐藤 三佳乃, 道場 信孝, 日薫 野原 重明, 相馬 正義. 健常高齢者の身体的健康評価と 17α水酸化酵素遺伝子(CYP17A1) 多型の関連. 第 31 回日本分子生物学会念会(神戸ポートアイランド). 2008 年 12 月 9-12 日(ポスター発表).

菅間 菅間 菅間

菅間 薫薫薫, 鈴木 克彦, 内藤 博章, 三浦 茂樹, 吉岡 浩, 森 有一. ハイドロゲルを用い薫 た新規好中球機能測定法を応用した各種物質の抗酸化作用と抗炎症作用の解析・評価. 第 11 回日本補完代替医療学学術集会 (横浜市開港記念会館). 2008 年 11 月 7-9 日(口頭発 表).