博 士 論 文 概 要

早稲田大学大学院 先進理工学研究科

博 士 論 文 概 要

論 文 題 目

シアノバクテリアの概日システムにおける 入力・出力機構の解析

Analyses on input and output mechanisms in the cyanobacterial circadian system

申 請 者

細川 徳宗 Norimune HOSOKAWA

電気・情報生命専攻 細胞分子ネットワーク研究

2012 年 12 月

（ 受 理 申 請 す る 部 科 主 任 会 開 催 年 月 を 記 入 ）

バ ク テ リ ア か ら 高 等 動 植 物 に 至 る ま で 、 多 く の 生 物 は 「 概 日 時 計 」 と い う 内 因 性 の 時 計 を 持 ち 、 昼 夜 交 替 や 季 節 変 動 と い っ た 周 期 的 な 環 境 変 化 を 積 極 的 に 予 測 し 、 効 率 的 な 生 命 活 動 を 実 現 さ せ て い る 。 た と え ば 、 ヒ ト の 睡 眠 ･ 覚 醒 、 植 物 の 開 花 、 動 物 の 季 節 性 繁 殖 、 昆 虫 の 休 眠 、 渡 り 鳥 の 方 位 決 定 な ど 多 様 な 生 命 現 象 と 密 接 に 関 わ っ て い る こ と が 知 ら れ て い る 。 こ の よ う な 概 日 時 計 は 、 生 物 の 環 境 適 応 機 構 を 理 解 す る 上 で 重 要 な 研 究 課 題 の 一 つ で あ る 。 さ ら に は 、 概 日 時 計 を 利 用 し た 植 物 の 生 産 率 向 上 や ヒ ト の 睡 眠 障 害 の 改 善 な ど 農 業 、 医 学 、 薬 学 の 応 用 分 野 へ の 広 が り も 見 せ て い る 。 概 日 時 計 は 、 以 下 の ３ つ の 生 理 学 的 特 性 を 持 つ も の と し て 定 義 さ れ て い る 。 第 一 に 、 周 期 が 連 続 明 期 や 連 続 暗 期 な ど 外 部 環 境 を 一 定 に し た 状 態 で も 約 2 4 時 間 に 維 持 さ れ る 「 自 由 継 続 性 」。 第 二 に 、 光 や 暗 パ ル ス な ど の 特 定 の 外 界 刺 激 に よ っ て 外 環 境 に 同 調 す る「 位 相 応 答 性 」。第 三 に 、生 理 的 な 温 度 の 範 囲 内 で 周 期 長 を 一 定 に 保 つ「 温 度 補 償 性 」。こ れ ら の 特 性 を 持 つ こ と に よ っ て 、 外 界 の 環 境 変 化 に 応 じ て 時 計 の 時 刻 を 調 節 し 、 夏 や 冬 な ど 様 々 な 温 度 環 境 下 で も 生 体 内 で 時 計 と し て 機 能 す る こ と が 可 能 と な っ て い る 。

マ ウ ス 、 シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ 、 シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ 、 ア カ パ ン カ ビ な ど 多 く の モ デ ル 生 物 に お い て 概 日 時 計 研 究 が 展 開 さ れ て い る が 、 高 等 動 植 物 の 概 日 シ ス テ ム は 非 常 に 複 雑 で あ る た め 、 概 日 シ ス テ ム の 基 盤 の 理 解 に は 、 よ り 単 純 な 生 物 を 用 い る こ と が 一 つ の ア プ ロ ー チ と し て 有 効 で あ る 。 そ こ で 、 申 請 者 の 所 属 す る グ ル ー プ で は 概 日 時 計 を 持 つ 最 も 単 純 な モ デ ル 生 物 と し て 知 ら れ る 単 細 胞 性 シ ア ノ バ ク テ リ ア S y n e c h o c o c c u s e l o n g a t u s P C C 7 9 4 2 （ 以 下 S . e l o n g a t u s） を 用 い て 研 究 を 展 開 し て き た 。

1 9 9 0 年 代 当 初 、 概 日 時 計 の 発 振 機 構 に つ い て は 哺 乳 類 、 植 物 、 バ ク テ リ ア と い っ た モ デ ル 生 物 間 で 時 計 遺 伝 子 に 類 似 性 が 見 ら れ な い こ と か ら 、 シ ス テ ム レ ベ ル で 共 通 の 仕 組 み を 保 持 し て い る こ と が 予 想 さ れ 、 概 日 時 計 の 発 振 機 構 を 説 明 す る 共 通 の 枠 組 み と し て 「 転 写 ・ 翻 訳 フ ィ ー ド バ ッ ク ル ー プ 」 モ デ ル が 有 力 視 さ れ て い た 。 こ の モ デ ル は 概 日 時 計 を 構 成 す る 、 時 計 遺 伝 子 の 転 写 を 活 性 化 す る 正 の 転 写 因 子 と 、 転 写 を 抑 制 す る 負 の 転 写 因 子 を 仮 定 し 、 正 の 転 写 因 子 が 負 の 転 写 因 子 を コ ー ド す る 遺 伝 子 の 転 写 を 促 進 し 、 そ の 翻 訳 産 物 に よ る 正 の 転 写 因 子 の 活 性 抑 制 が 交 互 に 繰 り 返 さ れ る こ と に よ っ て 周 期 的 な 振 動 が 発 生 す る と い う も の で あ る 。 当 初 は 全 て の モ デ ル 生 物 に お い て 時 計 遺 伝 子 の 転 写 ・ 翻 訳 リ ズ ム が 観 察 さ れ た た め 、 多 く の 支 持 を 集 め た モ デ ル で あ っ た 。 し か し な が ら 、S . e l o n g a t u s を 用 い た 研 究 に よ り 、 こ の 転 写 ・ 翻 訳 フ ィ ー ド バ ッ ク モ デ ル が 初 め て 反 証 さ れ 、 転 写 ・ 翻 訳 を 介 さ な い 翻 訳 後 修 飾 レ ベ ル で 基 本 振 動 を 生 じ る こ と が 明 ら か と な っ た 。S . e l o n g a t u s の 概 日 時 計 の 発 振 機 構 に は 時 計 遺 伝 子 群 k a i A、k a i B、k a i C が 必 須 で あ る が 、時 計 遺 伝 子 k a i A B C の 発 見 当 初 は 、時 計 遺 伝 子 k a i B C オ ペ ロ ン の 転 写 を k a i A 遺 伝 子 が 活 性 化 し 、k a i C 遺 伝 子 が 抑 制 す る こ と か ら 、シ ア ノ バ ク テ リ ア に お い て も 転 写 ・ 翻 訳 フ ィ ー ド バ ッ ク モ デ ル が 提 唱 さ れ た 。 し か し 、 シ ア ノ バ ク テ リ ア で

N O . 1

は 、暗 期 中 で k a i A B C 遺 伝 子 の 発 現 が ゼ ロ レ ベ ル に 低 下 す る に も か か わ ら ず 、K a i C 蛋 白 質 の リ ン 酸 化 リ ズ ム が 昼 夜 を 問 わ ず 継 続 す る こ と か ら 概 日 振 動 発 生 に 時 計 遺 伝 子 の 転 写 翻 訳 フ ィ ー ド バ ッ ク が 必 須 で な い こ と が 、 申 請 者 所 属 の 研 究 グ ル ー プ に よ り 明 ら か に さ れ た 。 さ ら に 時 計 遺 伝 子 の 翻 訳 産 物 で あ る K a i A 、 K a i B 、 K a i C の 組 換 え 蛋 白 質 と A T P を 試 験 管 内 で 混 合 す る だ け で 、 2 4 時 間 周 期 の K a i C の リ ン 酸 化 リ ズ ム を 再 構 成 で き る こ と が 示 さ れ た 。 現 在 で は 、 K a i A B C 蛋 白 質 を 基 盤 と し た 翻 訳 後 修 飾 レ ベ ル で 駆 動 す る 生 化 学 振 動 子 が 概 日 時 計 の 発 振 機 構 で あ る と さ れ て い る 。 詳 細 は 不 明 で あ る が 、 そ の 後 、 多 く の モ デ ル 生 物 で 酸 化 還 元 酵 素 の 状 態 変 化 が 時 計 遺 伝 子 の 転 写 ・ 翻 訳 に よ ら ず 2 4 時 間 周 期 で 起 こ る こ と が 報 告 さ れ 、シ ア ノ バ ク テ リ ア 以 外 の モ デ ル 生 物 に お い て も 転 写 ・ 翻 訳 フ ィ ー ド バ ッ ク の 役 割 に つ い て 見 直 し が 必 要 な 状 況 が 生 じ つ つ あ る 。

そ の 一 方 で 、 シ ア ノ バ ク テ リ ア で も 時 計 遺 伝 子 k a i C を 一 過 的 に 過 剰 発 現 さ せ る と 概 日 時 計 の 位 相 が 変 化 す る こ と な ど か ら 、 時 計 遺 伝 子 の 転 写 ・ 翻 訳 フ ィ ー ド バ ッ ク が 概 日 時 計 の 同 調 系 （ 入 力 機 構 ・ 入 力 系 ） に 関 与 す る 可 能 性 が 指 摘 さ れ て お り 、 後 発 の 翻 訳 後 修 飾 振 動 モ デ ル と の 関 係 性 は 不 明 の ま ま で あ っ た 。 そ こ で 申 請 者 は 、 改 め て 概 日 時 計 シ ス テ ム の 入 力 系 に 対 す る 時 計 遺 伝 子 の 転 写 ・ 翻 訳 フ ィ ー ド バ ッ ク の 寄 与 の 可 能 性 に つ い て 検 討 し 、 明 暗 サ イ ク ル 下 の 概 日 時 計 の 状 態 を 詳 細 に 解 析 す る こ と で シ ア ノ バ ク テ リ ア の 蛋 白 質 振 動 子 の 新 た な 光 応 答 特 性 を 明 ら か に し た 。

細 胞 内 を 2 4 時 間 周 期 の 昼 夜 環 境 に 適 応 さ せ る た め に は 、概 日 時 計 の 発 振 機 構 か ら 時 刻 情 報 を 受 け 取 り 細 胞 全 体 に 伝 え る 出 力 機 構 （ 出 力 系 ） が 必 要 で あ る 。 シ ア ノ バ ク テ リ ア で は 転 写 活 性 に 概 日 リ ズ ム が 顕 著 に 見 ら れ る こ と か ら 、 転 写 を 標 的 と し て 出 力 系 の 解 析 が 進 め ら れ て き た 。 申 請 者 所 属 の 研 究 グ ル ー プ は 、 連 続 明 条 件 下 で は 全 遺 伝 子 の 約 三 分 の 一 の 遺 伝 子 が 概 日 リ ズ ム を 示 す こ と を 明 ら か に し て き た が 、 夜 間 で は ほ と ん ど の 遺 伝 子 の 発 現 が 強 く 抑 制 さ れ 、k a i 遺 伝 子 の 発 現 も 停 止 す る こ と か ら 概 日 転 写 出 力 は 機 能 し な い と さ れ て き た 。 申 請 者 は 、 一 部 の 暗 期 発 現 遺 伝 子 群 に つ い て 詳 細 な 解 析 を 行 い 、 夜 間 に お い て も 蛋 白 質 振 動 子 は 一 部 の 転 写 を 時 刻 依 存 的 に 調 節 し て い る こ と を 見 出 し た 。 こ れ は 、 時 計 遺 伝 子 の 発 現 フ ィ ー ド バ ッ ク に 依 存 す る こ と な く 概 日 時 計 が 転 写 リ ズ ム を 駆 動 し う る こ と を 示 し た 最 初 の 報 告 と な っ た 。

本 論 文 は 四 章 で 構 成 さ れ 、 各 章 の 要 約 を 以 下 に 記 す 。 ま ず 第 一 章 は 序 論 と し て 概 日 時 計 の 概 念 と 歴 史 、 そ れ か ら シ ア ノ バ ク テ リ ア の 概 日 時 計 に つ い て の こ れ ま で の 研 究 を ま と め た 。

第 二 章 で は 、 時 計 遺 伝 子 の 転 写 ・ 翻 訳 フ ィ ー ド バ ッ ク の 入 力 系 へ の 関 与 を 検 討 し 、 概 日 時 計 シ ス テ ム の 新 規 入 力 機 構 を 明 ら か に し た 。 初 め に 細 胞 内 の 概 日 時 計 の 位 相 を 発 光 で モ ニ タ リ ン グ す る こ と が 可 能 な S . e l o n g a t u s の 生 物 発 光 レ ポ ー タ

ー 株 を 用 い て 概 日 時 計 の 入 力 系 の 検 討 を 行 っ た 。 連 続 明 条 件 下 で 培 養 し て い る 細 胞 に 対 し て 様 々 な 長 さ の 暗 刺 激 （ リ セ ッ ト 刺 激 ） を 任 意 の 位 相 に 与 え 、 刺 激 前 後 の 位 相 変 化 を 観 察 し た と こ ろ 、 主 観 的 夜 明 け か ら 暗 刺 激 を 与 え る と 位 相 が 劇 的 に 変 化 す る こ と が 判 明 し た 。 こ の 際 、 連 続 暗 期 中 で K a i C リ ン 酸 化 振 動 が 短 周 期 化 、 低 振 幅 化 す る こ と を 発 見 し た 。 一 方 、 主 観 的 黄 昏 か ら 暗 刺 激 を 与 え た 場 合 に は 位 相 変 化 、 K a i C リ ン 酸 化 振 動 の 周 期 ・ 振 幅 変 化 は 殆 ど 起 こ ら な い こ と を 見 出 し た 。 連 続 明 期 中 で は K a i A と K a i C 蛋 白 質 の 量 比 が 経 時 的 に 変 化 す る こ と が 知 ら れ て い る が 、 こ の 量 的 変 化 が 暗 期 中 の 生 化 学 振 動 子 の 状 態 変 化 を 引 き 起 こ す こ と で 以 上 の 現 象 が あ る 程 度 説 明 で き る 可 能 性 が あ る 。 そ こ で 、 人 為 的 に K a i C / K a i A 量 比 を 主 観 的 夜 明 け に 相 当 す る よ う に 変 化 （ 減 少 ） さ せ た と こ ろ 、 K a i C リ ン 酸 化 リ ズ ム が 短 周 期 化 ・ 低 振 幅 化 す る と と も に 、 暗 刺 激 に よ る 位 相 変 化 が 増 大 す る こ と を 示 す こ と に 成 功 し た 。 以 上 の 結 果 か ら 、 連 続 明 期 に お け る 時 計 遺 伝 子 群 の 転 写 ・ 翻 訳 フ ィ ー ド バ ッ ク は 、 K a i A と K a i C の 量 比 を 経 時 的 に 変 化 さ せ る こ と に よ っ て 概 日 時 計 （ 生 化 学 振 動 子 ） の 状 態 を 変 化 さ せ 、 暗 刺 激 に 対 す る 感 受 性 を 調 節 す る こ と で 時 刻 依 存 的 な 光 位 相 応 答 に 関 与 す る こ と が 強 く 示 唆 さ れ た 。

第 三 章 で は 、 概 日 時 計 に よ る ゲ ノ ム ワ イ ド な 転 写 制 御 と そ の メ カ ニ ズ ム （ 出 力 系 ） を 検 討 し た 。k a i 遺 伝 子 欠 損 株 を 扱 っ て D N A マ イ ク ロ ア レ イ を 用 い た 網 羅 的 遺 伝 子 発 現 解 析 を 行 っ た 結 果 、 連 続 明 条 件 下 で は 全 遺 伝 子 の 約 三 分 の 一 、 連 続 暗 条 件 下 で は 全 遺 伝 子 の ７ ％ が 概 日 時 計 に よ っ て 何 ら か の 発 現 調 節 を 受 け て い る こ と を 明 ら か に し た 。 ま た 、 概 日 時 計 に よ り 転 写 調 節 を 受 け て い る 暗 誘 導 遺 伝 子 群 の 一 部 は 連 続 暗 条 件 下 に お い て も 約 2 4 時 間 周 期 の 発 現 振 動 を 示 す こ と を 明 ら か に し 、 振 動 の 温 度 補 償 性 も 確 認 し た 。k a i C 遺 伝 子 の 短 周 期 変 異 体 で は 、 時 計 の 周 期 に 合 わ せ て 暗 期 に 観 察 さ れ る 転 写 リ ズ ム が 短 周 期 化 す る こ と を 明 ら か に し た 。 以 上 の 結 果 か ら 、 時 計 遺 伝 子 の 転 写 ・ 翻 訳 が 完 全 に 停 止 す る 暗 期 に お い て も 、 概 日 特 性 を 有 す る 転 写 リ ズ ム が 見 ら れ た こ と か ら 、 あ ら ゆ る 生 物 で 初 め て 転 写 ・ 翻 訳 フ ィ ー ド バ ッ ク に 依 存 し な い 転 写 出 力 系 の 存 在 を 明 ら か に す る こ と が で き た 。

第 四 章 で は 、 第 二 、 三 章 で 示 し た 研 究 結 果 を 総 括 し て 、 シ ア ノ バ ク テ リ ア 概 日 時 計 の 入 力 ・ 出 力 機 構 に つ い て 考 察 を す る と と も に 、 今 後 の 展 望 に つ い て 記 述 し た 。

NO . 3

Ｎｏ.1

早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書

氏 名 細川 徳宗 印

（2012 年 11 月 現在）

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

論文

講演

○Hosokawa N, Hatakeyama TS, Kojima T, Kikuchi Y, Ito H, Iwasaki H.

Circadian transcriptional regulation by the posttranslational oscillator without de novo clock gene expression in Synechococcus.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2011 Sep 13;108(37):15396-401.

Hanaoka M, Takai N, Hosokawa N, Fujiwara M, Akimoto Y, Kobori N, Iwasaki H, Kondo T, Tanaka K.

RpaB, another response regulator operating circadian clock-dependent transcriptional regulation in Synechococcus elongatus PCC 7942.

The Journal of Biological Chemistry. 2012 Jul 27;287(31):26321-7.

Ito H, Mutsuda M, Murayama Y, Tomita J, Hosokawa N, Terauchi K, Sugita C, Sugita M, Kondo T, Iwasaki H.

Cyanobacterial daily life with Kai-based circadian and diurnal genome-wide transcriptional control in Synechococcus elongatus.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2009 Aug 18;106(33):14168-73.

＜学会発表＞

・国際学会（ポスター発表）

○Norimune Hosokawa,Tetsuhiro Hatakeyama, Hideo Iwasaki.

Circadian transcription in the dark without cyclic kai gene expression I:

Clock-gating of dark-induced transcription in Synechococcus

The 12 th Biennial Meeting of Society for Research on Biological Rhythms, Florida, USA, 2010 May.

・国際学会（ポスター発表）

○Norimune Hosokawa,Tetsuhiro Hatakeyama, Hideo Iwasaki.

Kai-based circadian transcriptional regulation in the dark without transcription-translation feedback loop of kai genes in cyanobacteria International Symposium on Biological Rhythm and Photonic Bioimaging, Sapporo, 2009 Aug.

Ｎｏ.2

早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

講演 ・国際学会（ポスター発表）

○Norimune Hosokawa,Tetsuhiro Hatakeyama, Hideo Iwasaki.

Circadian transcriptional regulation in the dark without cyclic kai gene expression in Synechococcus

13 th International Symposium on Phototrophic Prokaryotes，Canada, 2009 Aug.

・国内ワークショップ（口頭発表）

○細川徳宗，畠山哲央，岩崎秀雄

時計遺伝子の転写が行われない暗期中での単細胞性シアノバクテリアの概日転写制御 時間生物フォーラム東京，東京，2009 年 2 月

・国内学会（ポスター発表）

○細川徳宗，岩崎秀雄

シアノバクテリアにおける様々な日長条件下での概日時計の位相応答 第 18 回日本時間生物学会，名古屋，2011 年 11 月

・国内学会（ポスター発表）

〇細川徳宗，畠山哲央，小島崇，伊藤浩史，岩崎秀雄

絶対光要求性シアノバクテリアにおけるシグマ因子を介したエネルギー飢餓条件での概 日転写リズム: 夜間の遺伝子発現制御メカニズムの解析

第 5 回日本ゲノム微生物学会, 宮城，2011 年 3 月

・国内学会（ポスター発表）

○細川徳宗，畠山哲央，岩崎秀雄

原核生物の光周的遺伝子発現誘導の発見：kai遺伝子の転写翻訳フィードバックを欠く暗 期中でのシアノバクテリアの概日転写制御

第 16 回日本時間生物学会，大阪，2009 年 10 月

・国内学会（ポスター発表）

○細川徳宗，菊池欣之，畠山哲央，岩崎秀雄

暗期におけるシアノバクテリアの遺伝子発現制御解析 第 15 回日本時間生物学会，岡山，2008 年 11 月

・国内学会（ポスター発表）

○細川徳宗，菊池欣之，冨田淳，寺内一姫，近藤孝男，岩崎秀雄

ゲノムワイドな発現プロファイルから見たシアノバクテリアの生活リズム 第 14 回日本時間生物学会，東京，2007 年 11 月

Ｎｏ.3

早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

・国際学会（ポスター発表）

Tetsuhiro Hatakeyama, Norimune Hosokawa, Hideo Iwasaki.

Circadian transcription in the dark without cyclic kai gene expression II: Damping oscillation in expression of a dark-induced gene

The 12 th Biennial Meeting of Society for Research on Biological Rhythms, Florida, USA, 2010 May.

・国内学会（口頭発表）

梅谷実樹，細川徳宗，岩崎秀雄

シアノバクテリアの KaiC リン酸化振動停止時の転写振動 第 19 回日本時間生物学会，北海道，2012 年 8 月

・国内学会（ポスター発表）

高野壮太郎，細川徳宗，小島崇，梅谷実樹，村山依子，岩崎秀雄

単細胞性シアノバクテリアのゲノムワイドな概日発現に対する高振幅シグマ因子の影響 第 19 回日本時間生物学会，北海道，2012 年 8 月

・国内学会（ポスター発表）

梅谷実樹，細川徳宗，岩崎秀雄

KaiC リン酸化振動を伴わない単細胞性シアノバクテリアの転写振動の解析 第 53 回日本植物生理学会，京都，2012 年 3 月

・国内学会（ポスター発表）

小島崇，細川徳宗，青野大輔，岩崎秀雄

単細胞性シアノバクテリアにおけるシグマ因子の概日発現に関する解析 第 17 回日本時間生物学会，東京，2010 年 11 月

・国内学会（ポスター発表）

畠山哲央，細川徳宗，岩崎秀雄

バクテリアの光周的遺伝子発現：時計遺伝子の転写翻訳フィードバックを欠く暗期中で のSynechococcusの概日転写制御

ラン藻の分子生物学会 2009，千葉, 2009 年 12 月

・国内学会（口頭発表）

畠山哲央，細川徳宗，岩崎秀雄

「単細胞性シアノバクテリアSynechococcus elongatusにおける暗誘導遺伝子群の解析」

第３回日本ゲノム微生物学会，東京， 2009 年 3 月 他３件