71-1289-07
ECL
ウェスタンブロッティングガイドブック
ECL
WesternBlotting
Guidebook
発売以来
ECL
ウェスタンブロッティングシリーズは
世界中で多くの研究者にご使用いただいており、
また、多くの論文で引用されてまいりました。
その理由は、
10
年以上の年月をかけて証明されて
きた
ECL
ケミルミネッセンス試薬と
Hybond
メン
ブレンそして
ECL
ケミルミネッセンス二次抗体の
感度、早さ、そして汎用性の実績があるからです。
今日ではGEヘルスケア バイオサイエンスの
ECL
シ
リーズには
ECL Advance
、
ECL Plus
が加わり、
研究者の皆様からのより幅広いご要望にお応え
するための選択肢を拡げています。
They're
EXCELLENT.
Time after time.
Rainbow Marker
（有色分子量マーカー）
●電気泳動経過確認やブロッティングの転写確認に
●各バンドが異なる色素で着色済
ECL DualVue Western Blotting Ma
●7種類のS-tagged組換えマーカータンパク質をEC
●3種類の着色済みタンパク質によりブロッティング
ECL Western Blotting Molecular We
●HRP標識ストレプトアビジンとあわせて使用する
HRP
標識二次抗体ECL Acce
ECL
関連製品マップ
ECL
関連製品マップ
Electrophoresis
Blotting
Labelling
miniVE / SE 260
●ゲルサイズ8×9 cmで同時に2枚 の泳動が可能 ●miniVEは、ブロットモジュール （別売）でブロッティング装置と しても使用可能 ミニゲル用電気泳動装置SE 600 Ruby
●ゲルサイズ16x16 cmで同時に 4枚の泳動が可能（デバイダー プレート使用時） ●恒温循環装置との接続で、ゲル 全面を冷却しスマイリングを防止 スタンダードゲル用電気泳動装置miniVE
セミウェット式ブロッティング装置TE 70 / TE 77
●TE 70は最大14×16 cm, TE 77は 21×26 cmのゲルを転写可能 ●発熱によるゲルのゆがみやタンパク 質の変性を抑え、少量のバッファー で転写可能TE 22
●最大9×10 cmのミニゲルを同時に 4枚転写可能TE 42 / TE 62
●15×21 cmの ゲ ル は4枚 ま で 、 7×10 cmのゲルは16枚まで同時に 転写可能 ●TE 42はヒートエクスチェンジャー により、TE 62は恒温循環装置と接続 し冷却可能 タンク式ブロッティング装置Hybond-P
（PVDFメンブレン） ●ニトロセルロースメンブレンに比べ 高い物理的強度Hybond-ECL
（ニトロセルロースメンブレン）Membranes
MultiProcessor
●ゲルの染色およびメンブレンの検出用溶液 交換を自動化 ゲル・メンブレン自動検出処理装置Electrophoresis
Blotting
Labelling
●
ECL Advance
●
ECL Plus
●
ECL
●
ECL Phosphorylation
●
ECL Glycoprotein
ECL Detection Kit
ImageMaster
2D Platinum ●二次元電気泳動ゲルの画像解析システムDetection
Analysis
画像解析システムHyperfilm-ECL
●自動現像が可能 ●無 色 透 明 な フ ィ ル ム ベ ー ス 両 面 に エマルジョンが塗られているので裏表 区別なしECL Mini-Camera
●ECLをインスタントフィルムで検出、 暗室不要でその場で手軽に検出 ●ミニゲルサイズのメンブレン （93×74 mmまで）に対応 検出用X線フィルム/ カセットImageScanner
II ●可視サンプルのアプリケーション全般に 最適な高解像度スキャナーTyphoon 9400 / 9410 /
Trio ●蛍光をはじめ、RI、化学発光検出を1台 で行えるシステム 検出装置 にarkers
L化学発光検出 グ状態のモニタリング可能ight Markers
ることでECL検出時に同一メンブレン上で検出可能essories
Detection
Analysis
CONTENTS
CONTENTS
ECL
関連製品マップ
2
第
1
章
ECL
の原理と特徴
5
1.1
反応の概略6
1.2
原理と特徴7
第
2
章 実験プロトコール
9
2.1
ウェスタンブロッティングの操作の流れ10
2.2 ECL Advance
ウェスタンブロッティング検出プロトコール11
2.3 ECL Plus
ウェスタンブロッティング検出プロトコール14
2.4 ECL
ウェスタンブロッティング検出プロトコール17
第
3
章 検出条件の至適化
21
3.1
最適抗体濃度の決定22
3.2
時間短縮のためのプロトコールガイド24
3.3 ECL Plus
検出法からECL Advance
検出法へ移行するためのアドバイス24
3.4 ECL
検出法からECL Plus
検出法へ移行するためのアドバイス26
3.5
発色法（DAB
検出法）からECL Plus
検出法へ移行するためのアドバイス26
3.6 ECL Mini-Camera
とHyperfilm
の感度比較27
3.7
ブロッキング条件の至適化28
3.8
過酸化水素によるホースラディッシュペルオキシダーゼの不活性化30
第
4
章 検出方法
33
4.1
検出方法の種類と特徴34
4.2 ECL Mini-Camera
による検出35
4.3 Hyperfilm
による化学発光検出（露光から現像まで）37
4.4
バリアブルイメージアナライザーTyphoon
による検出39
付録：冷却式CCD
カメラシステムによるタンパク質の定量化40
第
5
章 ケミフローレッセンスによる
ECL Plus
の検出
41
5.1
プロトコール42
5.2
バリアブルイメージアナライザーTyphoon
による検出43
第
6
章 関連製品プロトコール
45
6.1 miniVE
ミニゲル用電気泳動装置／ブロッティング装置46
6.2 TE70 / TE77
セミドライブロッティング装置48
6.3 MultiProcessor
ゲル・メンブレン用自動検出処理装置50
第
7
章 アプリケーション例
53
7.1
二次元電気泳動およびECL Western Blotting
を用いた培養生殖細胞上清からのmetallopeptidase
の同定54
7.2 2D DIGE / ECL Plus Western Blotting
を使用したチロシンリン酸化タンパク質の検出57
第
8
章 トラブルシューティング
65
8.1
トラブルシューティングガイド66
8.2
トラブルシューティング参考例73
付録 各種溶液の調製
75
References
85
ECL
ウェスタンブロッティングシリーズ製品一覧表
86
ECL
ウェスタンブロッティングシリーズ関連製品一覧表
88
1
2
3
4
5
6
7
8
第
1
章
ECL
の原理と特徴
実験操作を行う際にその手法の原理・特徴を知っておくことはそ
の実験を成功させるための有効な手だての一つです。この章では、
ECL
による化学発光の原理について解説します。
1.1 •
反応の概略
1.2 •
原理と特徴
1
― 6 ―
ECL
（Enhanced ChemiLuminescence
）ウェスタンブロッティング検出システムは、メンブレンに固定（ブロット）したタンパク質を
Horseradish peroxidase
（HRP
）標識抗体と反応させて化学発光により検出するシステムです。検 出原理の概略を下図に示しました。 一次抗体 タンパク質 光 HRP標識二次抗体 Hybond-P PVDFメンブレン Hyperfilm ECL O 2-2 H2O ECL Plus基質 ECL Advance基質 またはECL Advance /ECL Plus
ECL
一次抗体 過酸化塩 タンパク質 光 HRP標識二次抗体 Hybond-ECL ニトロセルロースメンブレン Hyperfilm ECL O + 2H2O 2- 2 ルミノール + エンハンサー N2 + 3-アミノフタレイト1.1
反応の概略
▲
推奨アプリケーション 感度 抗体使用量 一次抗体 二次抗体 ブロッキング剤 リプロービング 推奨メンブレン 発光の持続時間 検出方法＊ 発光は、励起状態にある基質が基底状態に戻る際に光を放出する現象またはその光を指します。化学発光は、化学反 応により生じたエネルギーが光に変換されて起こるもので、ルミノールのような
cyclic diacylhydrazides
の化学発光 は、化学分析で幅広く利用されており(
文献1, 2)
、またその研究も進められています。そのなかでも特に、アルカリ条 件下におけるHRP
と過酸化水素（H
2O
2）によって触媒されるルミノール酸化反応について詳しく解析が進められてい ます(
文献3,4)
。ルミノールは酸化されると直ちに励起状態となり、基底状態へと減衰する過程で光を放ちます。ECL
反応(
文献2)
は、フェノール環を持つ化合物などのエンハンサーの存在下でHRP
によってルミノールが酸化された ときに起こります。これにより、光の放出が約1,000
倍高まり放出時間も長くなります。 一方、ECL Plus
では、基質がHRP
により酸化されると、アクリジニウムエステルを生成します。このエステルは、ア ルカリ条件下、過酸化物と反応して化学発光を生じます。光の放出は酵素によりアクリジニウムエステルが生成される 限り続きます。さらに、
ECL Advance
は、新規の基質を用いることで、ECL Plus
と同様の発光原理をもちながら、より高感度の検出 を実現します。以下に
ECL Advance
、ECL Plus
およびECL
ウェスタンブロッティング検出システムの主な特徴を示します。1.2
原理と特徴
ECL Advance
ECL Plus
ECL
最高感度の化学発光検出 ターゲットタンパク質や一次抗体の量が 少ない場合に ECL Plusに対して最高10倍の高感度 非常に少量 1 : 100,000 1 : 500,000
ECL Advance 専用Blocking Agent（キッ トに含まれます） ◎ Hybond-P / Hybond-ECL 4∼6時間 X線フィルム (Hyperfilm ECL) インスタントフィルム (ECL Mini-Camera) CCDカメラ 化学発光用スキャナー 一般的化学発光検出 10-12 gまで検出可 普通 1 : 10,000 1 : 15,000 ◎ Hybond-ECL 1∼2時間 X線フィルム (Hyperfilm ECL) インスタントフィルム (ECL Mini-Camera) CCDカメラ 化学発光用スキャナー 高感度化学発光検出 - 化学発光だけでなく、化学蛍光 でも検出できるので、蛍光スキ ャナーによる解析可能 - 発光持続時間が長いので多検体 処理でも余裕を持って実験可能 ECLに対して20倍の高感度 少量 1 : 20,000 1 : 200,000 ◎ Hybond-P 24∼48時間 X線フィルム (Hyperfilm ECL) インスタントフィルム (ECL Mini-Camera) CCDカメラ 化学発光用スキャナー 蛍光Scanner
(
Typhoon 9400, Trio,)
Storm860ウェスタンブロッティング化学発光検出試薬
ECL
シリーズ選択ガイド
一般的な試薬（5 %スキムミルク、0.1 % PBS-Tなど） ＊ 最良の結果を得るためにはサンプルごとに条件検討を行って至適抗体濃度を決定する必要があります。（第3章 参照）▲
― 8 ―
DAB
（diaminobenzidine tetrahydrochloride
）やラジオアイソトープを使用しませんので、通常の実験室で容易に 取り扱えます。■ 安全性
■ 簡単な操作
■ ブロットの再利用
■ 結果の保存性
フィルムに結果が得られるので、発色に見られるようなメンブレン上での時間経過による退色がなく、保存性に優れて います。スライド、写真の作成も容易になると共に、デンシトメーターによる定量化も可能です。 異なる動物種で作製した一次抗体を用いる場合は、初めに使用した抗体をはがさずに他の抗体を反応（リプロービン グ）できます。それ以外は、メンブレン上のタンパク質の抗原性を失活させずに、抗体のみを除去しリプロービングが 可能です。■ 低バックグラウンド
検出試薬中のエンハンサーは、HRP
の働きによって生じる化学発光のみを強く増強し、バックグラウンドの原因となる 他の光の反射を抑えます。したがって、シグナルとバックグラウンドとの比が高まり、より良い結果が得られます。■ 経済性
1 pg
以下のタンパク質を短時間で検出できるこのシステムでは、従来の発色法による検出系よりも一次抗体またはHRP
標識二次抗体を希釈して使用することができます。したがって、貴重な抗体を有効に利用できます。2
種類の検出試薬を混ぜ合わせ、その混合液にメンブレンを浸して室温でインキュベートします。後はフィルムと一緒 にカセットに入れて露光するだけでシグナルが得られます。■ 高感度
ECL
ウェスタンブロッティングシステムは、発色検出系に比べ、10
倍以上も高感度です。このため、抗リン酸化チロシ ン抗体を用いたECL
ウェスタンブロッティング（文献7-9
）や、ビオチン化試薬で修飾した膜タンパク質を免疫沈降後、ECL
ウェスタンブロッティングにより検出（文献10,11
）した例など、多くの実験例が報告されています。1
2
3
4
5
6
7
8
第
2
章
実験プロトコール
この章では、
3
種類の
ECL
製品（
ECL Advance, ECL Plus, ECL
）に
ついて、それぞれ詳しい実験操作法をご紹介します。
2.1 •
ウェスタンブロッティングの操作の流れ
2.2 • ECL Advance
ウェスタンブロッティング検出プロトコール
2.3 • ECL Plus
ウェスタンブロッティング検出プロトコール
2.4 • ECL
ウェスタンブロッティング検出プロトコール
2
― 10 ― 電気泳動によりタンパク質を分子量の差によって分離 ミニゲル用電気泳動装置：
miniVE
、SE260
分離したタンパク質を検出（CBB
染色・銀染色)
ゲル・メンブレン用自動検出処理装置：MultiProcessor
（ゲル染色モードで使用） 染色用試薬：PhastGel Blue R
PlusOne Silver Staining
Kit, Protein
分離されたタンパク質をゲルからメンブレンへトランスファー
セミドライブロッティング装置：
TE 70 / 77
非特異的な吸着を防ぐ
ブロッキング剤：
ECL Blocking agent
ゲル・メンブレン用自動検出処理装置：
MultiProcessor
（ブロットモードで使用）目的タンパク質を特異的に検出
目的タンパク質を化学発光で検出
X
線フィルム：Hyperfilm ECL, Hyperfilm MP
ECL Mini-Camera/
インスタントフィルム、CCD
カメラなどHRP
標識二次抗体
との反応
ビオチン化二次抗体
との反応
HRP-
ストレプト
アビジンとの反応
ECL Advance、ECL Plus、
ECL検出試薬との反応
一次抗体との反応
SDS-PAGE
ブロッティング
ゲルバンド検出
メンブレンのブロッキング、洗浄
抗体反応
フィルムへの露光、機器による検出
2.1
ウェスタンブロッティング操作の流れ
▲
3．ブロッキング
Note：
・ブロッキングバッファーの調製方法は、付録を参照してください。 ・メンブレン1 cm2あたり0.2 mlのブロッキング剤を使用します。 ・PBS-T or TBS-T のTween 20濃度およびブロッキング時間、 温度は実験ごとに至適条件が異なるので、必要に応じて検討し てください。※3-1 ・洗浄には十分量のバッファーを使用してください（メンブレン 1 cm2あたり4 mlのバッファー量を目安にしてください）。 ブロット↓＋2％ ブロッキング剤（ECL Advance Blocking Agent） in PBS-T or TBS-T ↓室温、1時間（振とう）または4℃、一晩 ↓PBS-T or TBS-Tで洗浄 （2分間×2、5分間×1）
1．電気泳動
Note：
・ミニゲル用電気泳動装置（miniVE）のプロトコールは第6章を 参照してください。※1-1 SDS-PAGEでタンパク質を分離2．ブロッティング
Note：
・ミニゲル用セミドライブロッティング装置（TE 70/TE 77）の プロトコールは第6章を参照してください。 SDS-PAGEによって分離したタンパク質をHybond-Pまたは Hybond-ECLへトランスファー※2-14．一次抗体反応
Note：
・一次抗体濃度は10,000∼100,000倍を目安に検討を始めてくだ さい。一次抗体の特性は抗体ごとに大きく異なるため、結果に 応じて希釈倍率を検討する必要があります。※4-1 ・洗浄には十分量のバッファーを使用してください。 ↓＋2% ECL Advance Blocking Agent in PBS-T or TBS-Tで希釈した一次抗体 ↓室温、1時間（振とう） ↓PBS-T or TBS-Tで洗浄 （2分間×2、15分間×1、5分間×3） ※2-1 すぐに検出を行わないメンブレンは、風乾後、デシケーター中で2∼8℃で3ヶ月まで保存できますが、感度は低下します。使用の際、ニトロセ ルロースメンブレンは湿らせる必要はありませんが、PVDFメンブレンは100％メタノールによる親水化処理が必要です。 ※1-1 miniVE電気泳動装置は、ブロットモジュールを追加することで、ブロッティング操作も行うことができます（第6章 参照）。 ※3-1 メンブレンはブロッキングバッファー中に4℃で一晩浸しておくこともできます。 ※4-1 このための実験にはドットブロッティングが適しています（第3章 参照）。
2.2 ECL Advance
ウェスタンブロッティング検出プロトコール
▲
― 12 ―
5．二次抗体反応
Note：
・二次抗体の希釈倍率は、バックグラウンドとシグナルの比 （S/N比）が最も高くなる条件に設定します。X線フィルムの露 光を10分間とする場合、200,000倍希釈を目安にしてください。 ・ECL DualVue Markerを同時に検出するには、二次抗体反応時にHRP標識S-proteinを反応させます（79ページ参照）。 ・バックグラウンドを下げるために十分に洗浄してください。 ・感度が低下するおそれがあるので、ブロッキング剤は使用しな いでください。 ・HRP標識ストレプトアビジンは、100,000∼500,000倍希釈を 目安にしてください。 ・インキュベート時間は適当な条件に変えてください。 ・洗浄には十分量のバッファーを使用してください。 ↓＋2% ECL Advance Blocking Agent in PBS-T or
TBS-Tで希釈したHRP標識二次抗体
↓室温、1時間（振とう） ↓PBS-T or TBS-Tで洗浄
（2分間×2、15分間×1、5分間×3）
【ビオチン化抗体の場合、またはECL Western Blotting
Molecular Weight Marker使用の場合、以下の操作を続けて行
います】 ↓＋PBS-T or TBS-Tで希釈したHRP標識ストレプトアビジン ↓室温、15分間（振とう） ↓PBS-T or TBS-Tで洗浄 （2分間×2、15分間×1、5分間×3）
6．検出
Note：
・検出試薬はあらかじめ室温に戻しておきます。 ・メンブレン1 cm2あたり0.1 mlの検出試薬が必要です。 ・混合液は2∼8℃の暗所で１ヶ月保存可能です。 ・メンブレンの角をピンセットで軽くつまんで取り出し、反対の 角をキムワイプなどに載せて余分な検出試薬を除去します。 ・気泡が入らないよう注意してください。 ・赤色安全光の下で作業してください。 ・目的タンパク質の量が微量であったり、シグナルが弱い場合は、 露光時間を長くしてください（5分間以上露光）。 ・全体にバックグラウンドが見られる場合は、メンブレンを PBS-T あるいはTBS-Tで10分間2回洗浄した後、再度検出してくだ さい（☆から繰り返し）。非特異的なバンドが見られる場合は、 一次あるいは二次抗体（ビオチン-ストレプトアビジン）の希釈 倍率を検討し直す必要があります。 ↓（☆）メンブレンをラップ上に置き、調製しておいた検出 試薬をかける ECL Advance SolutionA：ECL Advance SolutionB ＝1：1で混合 ↓5分間、静置 ↓検出試薬を除去し、ラップに包む （フィルムカセットにHyperfilm ECLをセットする） ↓ブロット面をフィルム側にして置く※6-1 ↓30秒∼数分間露光 ↓ フィルムを現像 ※6-1 メンブレンのサイズが9×7 cm以下の場合、ECL Mini-Cameraを使用してインスタントフィルム上での検出も可能です。7．リプロービング
Note：
・あらかじめ、メンブレンをフィルムに露光して前回の発光が消 えていることを確認してください。 ・「3.ブロッキング」を参照してください。 検出後メンブレン ↓PBS-T or TBS-Tで洗浄 （10分間×2） ↓＋2％ ブロッキング剤in PBS-T or TBS-T ↓室温、1時間（振とう） ↓4.∼6．（11∼12ページ）に従い、イムノディテクション ブロットを再利用することで、結果の再確認を行ったり、分析するタンパク質が少量あるいは貴重な場合にサンプル を有効に利用できます。異なる動物種由来の一次抗体を用いる場合、以下の方法で繰り返しリプロービングができま す。検出後のメンブレンは、濡れた状態でラップ等に包み2
∼8
℃で保存してください。8．抗体除去とリプロービング
Note：
・抗体除去バッファー： 2% SDS, 100 mM 2-mercaptoethanol, 62.5 mM Tris-HCl, pH 6.7 ・より厳しい条件が必要であれば、70℃でインキュベートしてく ださい。 ・メンブレンをECL Advance 検出試薬で処理し、フィルムで露 光して、抗体除去が完了していることを確認してください。 メンブレン ↓＋抗体除去バッファー※8-1 ↓50℃、30分間（振とう） ↓PBS-T or TBS-Tで洗浄 （10分間×2） ↓3.∼6.（11∼12ページ）に従い、イムノディテクション 下記の方法でブロットから一次抗体および二次抗体を完全にはがすことができます。 検出後メンブレンは、濡れた状態でラップ等に包み2
∼8
℃で保存してください。 ※8-1抗体除去は、0.2 M glycine, pH 2.8溶液を用いて室温30分間、あるいは7M guanidine HCl, 50 mM glycine, pH 10.8, 0.05 mM EDTA, 0.1 M KCl, 20 mM 2-mercaptoethanolで室温10分（振とう）でも行えます。
― 14 ―
1．電気泳動
Note：
・ミニゲル用電気泳動装置 （miniVE）のプロトコールは第6章を 参照してください。※1-1 SDS-PAGEでタンパク質を分離2．ブロッティング
Note：
・ミニゲル用セミドライブロッティング装置（TE 70/TE 77）のプ ロトコールは第6章を参照してください。 SDS-PAGEによって分離したタンパク質をHybond-P（または Hybond-ECL）へトランスファー※2-1, ※2-23．ブロッキング
Note：
・PBS-T or TBS-T のTween 20濃度およびブロッキング時間、 温度は実験ごとに至適条件が異なるので、必要に応じて検討し てください。※3-1、※3-2 ・洗浄には十分量のバッファーを使用してください（メンブレン 10×15 cm2あたり600 mlのバッファー量を目安にしてくださ い）。 ブロット↓＋5％ ブロッキング剤（ECL Blocking agent：
RPN2125）または5％ スキムミルクin PBS-T or TBS-T ↓室温、1時間（振とう） ↓PBS-T or TBS-Tで洗浄 （2分間×2、5分間×1）
4．一次抗体反応
Note：
・一次抗体濃度は0.02∼0.05 µg/mlを目安に検討を始めてくださ い。一次抗体の特性は抗体ごとに大きく異なるため、結果に応 じて希釈倍率を検討する必要があります。※4-1 ・洗浄には十分量のバッファーを使用してください。 ↓＋PBS-T or TBS-Tで希釈した一次抗体 ↓室温、1時間（振とう） ↓PBS-T or TBS-Tで洗浄 （2分間×2、10分間×1、5分間×2） ※2-1 最良の結果を得るために、メンブレンはHybond-P（PVDFメンブレン）またはHybond-ECL（ニトロセルロースメンブレン）の使用をおすすめ します。Hybond-C extraも使用することができます。 ※2-2 すぐに検出を行わないメンブレンは、風乾後、デシケーター中で2∼8℃で3ヶ月まで保存できますが、感度は低下します。使用の際、ニトロセ ルロースメンブレンは湿らせる必要はありませんが、PVDFメンブレンは100%メタノールによる親水化処理が必要です。 ※1-1 miniVE電気泳動装置は、ブロットモジュールを追加することで、ブロッティング操作も行うことができます（第6章 参照）。 ※3-1 ニトロセルロースメンブレンの場合、Tween 20の濃度は0.05∼0.1%が一般的な推奨濃度です。他のブロッキング条件については第3章、第8章 を参照してください。 ※3-2 メンブレンはブロッキングバッファー中に4℃で一晩浸しておくこともできます。 ※4-1 このための実験にはドットブロッティングが適しています（第3章 参照）。2.3 ECL Plus
ウェスタンブロッティング検出プロトコール
▲
5．二次抗体反応
Note：
・二次抗体の希釈倍率は、バックグラウンドとシグナルの比 （S/N比）が最も高くなる条件に設定します。X線フィルムの露 光を10分間とする場合、25,000倍希釈を目安にしてください。 ・ECL DualVue Markerを同時に検出するには二次抗体反応時に
HRP標識S-proteinを反応させます（79ページ参照）。 ・バックグラウンドを下げるために十分に洗浄してください。 ・インキュベート時間は適当な条件に変えてください。 ・洗浄には十分量のバッファーを使用してください。 ↓＋PBS-T or TBS-Tで希釈したHRP標識二次抗体※5-1 ↓室温、1時間（振とう） ↓PBS-T or TBS-Tで洗浄 （2分間×2、10分間×1、5分間×2） 【ビオチン化抗体の場合、以下の操作を続けて行います】 ↓＋PBS-T or TBS-Tで希釈したHRP標識ストレプトアビジン ↓室温、40∼60分間（振とう） ↓PBS-T or TBS-Tで洗浄 （2分間×2、15分間×1、5分間×3）
6．検出
Note：
・メンブレン1 cm2あたり0.1 mlの検出試薬が必要です。※6-1 ・気泡が入らないよう注意してください。 ・赤色安全光の下で作業してください。 ・目的タンパク質の量が微量であったり、シグナルが弱い場合は、 露光時間を長くしてください（5分間以上露光）。 ・全体にバックグラウンドが見られる場合は、メンブレンを PBS-T あるいはTBS-Tで10分間2回洗浄した後、再度検出してくだ さい（☆から繰り返し）。非特異的なバンドが見られる場合は、 一次あるいは二次抗体（ビオチン-ストレプトアビジン）の希釈 倍率を検討し直す必要があります。 ↓（☆）メンブレンをラップ上に置き、調製しておいた検出 試薬をかける SolutionA：SolutionB＝40：1で混合 ↓5分間、静置 ↓検出試薬を除去し、ラップに包む （フィルムカセットにHyperfilm ECLをセットする） ↓ブロット面をフィルム側にして置く※6-2 ↓30秒∼数分間露光 ↓ フィルムを現像 ※5-1HRP標識二次抗体を使用する場合、ECLタンパク質分子量マーカーを同時に検出するためにはHRP標識ストレプトアビジン（RPN1231、 1:1,500）を二次抗体希釈液に加えてください。 ※6-1 混合時に検出溶液が白濁しますが問題ありません。 ※6-2 メンブレンのサイズが9×7 cm以下の場合、ECL Mini-Cameraを使用してインスタントフィルム上での検出も可能です。― 16 ―
7．リプロービング
Note：
・「3.ブロッキング」を参照してください。 検出後メンブレン ↓PBS-T or TBS-Tで洗浄（10分間×2） ↓＋5％ ブロッキング剤または、5％ スキムミルク in PBS-T or TBS-T ↓室温、1時間（振とう） ↓4.∼6.（14∼15ページ）に従い、イムノディテクション ブロットを再利用することで、結果の再確認を行ったり、分析するタンパク質が少量あるいは貴重な場合にサンプル を有効に利用できます。異なる動物種由来の一次抗体を用いる場合、以下の方法で繰り返しリプロービングができま す。検出後のメンブレンは、濡れた状態でラップ等に包み2
∼8
℃で保存してください。8．抗体除去とリプロービング
Note：
・抗体除去バッファー： 2% SDS, 100 mM 2-mercaptoethanol, 62.5 mM Tris-HCl, pH 6.7 ・より厳しい条件が必要であれば、70℃でインキュベートしてく ださい。 メンブレン ↓＋抗体除去バッファー※8-1 ↓50℃、30分間（振とう） ↓PBS-T or TBS-Tで洗浄（10分間×2） ↓3.∼6.（14∼15ページ）に従い、イムノディテクション 下記の方法でブロットから一次抗体および二次抗体を完全にはがすことができます。 検出後メンブレンは、濡れた状態でラップ等に包み2
∼8
℃で保存してください。※8-1 抗体除去は、0.2 M glycine, pH 2.8溶液を用いて室温30分間、あるいは7M guanidine HCl, 50 mM glycine, pH 10.8, 0.05 mM EDTA,
1．電気泳動
Note：
・ミニゲル用電気泳動装置（miniVE）のプロトコールは第6章を参 照してください。※1-1 SDS-PAGEでタンパク質を分離2．ブロッティング
Note：
・ミニゲル用セミドライブロッティング装置（TE 70/TE 77）の プロトコールは第6章を参照してください。 SDS-PAGEによって分離したタンパク質をHybond-ECL （またはHybond-P）へトランスファー※2-1, ※2-23．ブロッキング
Note：
・PBS-T or TBS-T のTween 20濃度およびブロッキング時間、 温度は実験ごとに至適条件が異なるので、必要に応じて検討し てください。※3-1、※3-2 ・洗浄には十分量のバッファーを使用してください（メンブレン 10×15 cm2あたり600 mlのバッファー量を目安にしてください）。 ブロット↓＋5％ ブロッキング剤（ECL Blocking agent： RPN2125）または5％ スキムミルクin PBS-T or TBS-T ↓室温、1時間（振とう） ↓PBS-T or TBS-Tで洗浄 （2分間×2、5分間×1）
4．一次抗体反応
Note：
・一次抗体濃度は0.04∼0.1 µg/mlを目安に検討を始めてくださ い。一次抗体の特性は抗体ごとに大きく異なるため、結果に応 じて希釈倍率を検討する必要があります。※4-1、※4-2 ・洗浄には十分量のバッファーを使用してください。 ↓＋PBS-T or TBS-Tで希釈した一次抗体 ↓室温、1時間（振とう） ↓PBS-T or TBS-Tで洗浄 （2分間×2、10分間×1、5分間×2） ※2-1 最良の結果を得るために、メンブレンはHybond-P（PVDFメンブレン）またはHybond-ECL（ニトロセルロースメンブレン）の使用をおすす めします。Hybond-C extraも使用することができます。 ※2-2 すぐに検出を行わないメンブレンは、風乾後、デシケーター中で2∼8℃で3ヶ月まで保存できますが、感度は低下します。使用の際、ニトロセ ルロースメンブレンは湿らせる必要はありませんが、PVDFメンブレンは100%メタノールによる親水化処理が必要です。 ※3-1 ニトロセルロースメンブレンの場合、Tween20の濃度は0.05∼0.1%が一般的な推奨濃度です。他のブロッキング条件については第3章、第8章 を参照してください。 ※3-2 メンブレンはブロッキングバッファー中に4℃で一晩浸しておくこともできます。 ※4-1 このための実験にはドットブロッティングが適しています（第3章 参照）。 ※4-2 通常、ポリクローナル抗体100∼1,000倍以上、モノクローナル抗体の場合ハイブリドーマ上清で10∼100倍以上、マウス腹水で1,000倍以上を 目安に希釈してください。 ※1-1 miniVE電気泳動装置は、ブロットモジュールを追加することで、ブロッティング操作も行うことができます（第8章 参照）。2.4 ECL
ウェスタンブロッティング検出プロトコール
▲
― 18 ―
5．二次抗体反応
Note：
・二次抗体の希釈倍率は、バックグラウンドとシグナルの比（S/N 比）が最も高くなる条件に設定します。X線フィルムの露光を10 分間とする場合、10,000倍希釈を目安にしてください。※5-2・ECL DualVue Markerを同時に検出するには、二次抗体反応時 にHRP標識S-proteinを反応させます。（79ページ参照） ・バックグラウンドを下げるために十分に洗浄してください。 ・インキュベート時間は適当な条件に変えてください。 ・洗浄には十分量のバッファーを使用してください。 ↓＋PBS-T or TBS-Tで希釈したHRP標識二次抗体※5-1 ↓室温、1時間（振とう） ↓PBS-T or TBS-Tで洗浄 （2分間×2、10分間×1、5分間×2） 【ビオチン化抗体の場合、以下の操作を続けて行います】 ↓＋PBS-T or TBS-Tで希釈したHRP標識ストレプトアビジン ↓室温、40∼60分間（振とう） ↓PBS-T or TBS-Tで洗浄 （2分間×2、15分間×1、5分間×3）
6．検出
Note：
・メンブレン1 cm2あたり0.125 mlの検出試薬が必要です。 ・気泡が入らないよう注意してください。 ・赤色安全光の下で作業してください。 ・目的タンパク質の量が微量であったりシグナルが弱い場合は、 露光時間を長くしてください（1分間以上）。 ・全体にバックグラウンドが見られる場合は、メンブレンを PBS-T あるいはTBS-Tで10分間2回洗浄した後、再度検出してくだ さい（☆から繰り返し）。非特異的なバンドが見られる場合は、 一次あるいは二次抗体（ビオチンストレプトアビジン）の希釈 倍率を検討し直す必要があります。 ↓（☆）メンブレンをラップ上に置き、調製しておいた検出 試薬をかける Detection Reagent1：Detection Reagent2 ＝1：1で混合 ↓1分間、静置 ↓検出試薬を除去し、ラップに包む （フィルムカセットにHyperfilm ECLをセットする） ↓ブロット面をフィルム側にして置く※6-1 ↓30秒∼数分間露光 ↓ フィルムを現像 ※5-1 HRP標識二次抗体を使用する場合、ECLタンパク質分子量マーカーを同時に検出するためにはHRP標識ストレプトアビジン（RPN1231、 1:1,500）を二次抗体希釈液に加えてください。 ※5-2 HRP標識Protein Aは1,000∼5,000倍希釈、ビオチン化二次抗体1,000倍、HRP標識ストレプトアビジン（RPN1231）は1,500倍、HRPストレ プトアビジンコンプレックス（RPN1051）は5,000倍希釈を目安にしてください。 ※6-1 メンブレンのサイズが9×7 cm以下の場合、ECL Mini-Cameraを使用してインスタントフィルム上での検出も可能です。7．リプロービング
Note：
・「3.ブロッキング」を参照してください。 検出後メンブレン ↓PBS-T or TBS-Tで洗浄 （10分間×2） ↓＋5％ ブロッキング剤または、5％ スキムミルクin PBS-T or TBS-T ↓室温、1時間（振とう） ↓4.∼6.（17∼18ページ）に従い、イムノディテクション ブロットを再利用することで、結果の再確認を行ったり、分析するタンパク質が少量あるいは貴重な場合にサンプルを 有効に利用できます。異なる動物種由来の一次抗体を用いる場合、以下の方法で繰り返しリプロービングができます。 検出後メンブレンは、濡れた状態でラップ等に包み2
∼8
℃で保存してください。8．抗体除去とリプロービング
Note：
・抗体除去バッファー： 2% SDS, 100 mM 2-mercaptoethanol, 62.5 mM Tris-HCl, pH 6.7 ・より厳しい条件が必要であれば、70℃でインキュベートしてく ださい。 メンブレン ↓＋抗体除去バッファー※8-1 ↓50℃、30分間（振とう） ↓PBS-T or TBS-Tで洗浄 （10分間×2） ↓3.∼6.（17∼18ページ）に従い、イムノディテクション 下記の方法でブロットから一次抗体および二次抗体を完全にはがすことができます。 検出後メンブレンは、濡れた状態でラップ等に包み2
∼8
℃で保存してください。※8-1 抗体除去は、0.2 M glycine, pH 2.8溶液を用いて室温30分間、あるいは7 M guanidine HCl, 50 mM glycine, pH 10.8, 0.05 mM EDTA, 0.1 M KCl, 20 mM 2-mercaptoethanolで室温10分（振とう）でも行えます。
1
2
3
4
5
6
7
8
第
3
章
検出条件の至適化
より良い実験結果を得るためには検出条件の検討が不可欠です。
未定量のサンプルや同定されていないサンプルの場合、検出条件
をどのように絞り込み実験を行うかによりその結果は大きく左右
されます。この章では実際に実験を行う際に検証すべき条件につ
いて解説します。
3.1 •
最適抗体濃度の決定
3.2 •
時間短縮のためのプロトコールガイド
3.3 • ECL Plus
から
ECL Advance
検出法へ移行するための
アドバイス
3.4 • ECL
検出法から
ECL Plus
検出法へ移行するための
アドバイス
3.5 •
発色法（
DAB
検出法）から
ECL Plus
検出法へ移行するための
アドバイス
3.6 • ECL Mini-Camera
と
Hyperfilm
の感度比較
3.7 •
ブロッキング条件の至適化
3.8 •
過酸化水素によるホースラディッシュペルオキシダーゼの
不活性化
ECL Advance
、ECL Plus
、ECL
のような非常に感度の高いウェスタンブロッティング検出では、最良の結果を得るため に最適抗体濃度を設定することが重要です。一般的に、ECL
ウェスタンブロッティングシリーズを使用すると、発色法 と比べてより少量の一次抗体または二次抗体で、感度の良い鮮明な結果が得られます。高感度な検出結果を得るために は最適抗体濃度の決定が必須であり、同時にブロッキングや洗浄の条件を検討することも重要なポイントとなります。3.1.2
ECL Plus／ECL検出で力価のはっきりしない一次抗体／抗血清を用いる場合
抗体の最適希釈率を設定するにあたって、ドットあるいはスロットブロット法は迅速で効果的な方法です。以下に、ECL Plus
およびECL
を使用する際のプロトコールを示します。1） 1∼5 µgのサンプルタンパク質をHybond-P（PVDFメンブレン）またはHybond-ECL（ニトロセルロースメンブレン） 上にスポットし、乾燥させます。希釈率の異なる一次抗体それぞれに対して1枚のブロットを用意します。PVDFメンブレ ンは100％メタノールによる親水化処理が必要です。 2） ブロッキングバッファー（例：5％ スキムミルクを含むPBS-0.1％Tween 20（PBS-T））を用い、室温で1時間ブロッキ ングします。 3） 洗浄バッファーで2回ブロットをリンスした後、それぞれ新しい洗浄バッファーで、10分間1回、5分間2回洗浄します。 4） 一次抗体を希釈後（例：1/100、1/500、1/1,000、1/5,000、1/10,000）、室温で1時間メンブレンをインキュベート します。 5） ステップ3）にならってメンブレンを洗浄します。 6） 二次抗体を希釈後、室温で各メンブレンを1時間インキュベートします（露光時間を10分間とする場合、ECL Plusでは 1/25,000、ECLでは1/10,000を目安に希釈してください）。 7） ステップ3）にならってメンブレンを洗浄します。
8） プロトコールに従って、ECL Plus／ECL検出試薬とインキュベート後、フィルムに露光してシグナルを検出します。
3.1.1
ECL Advance検出で力価のはっきりしない一次抗体／抗血清を用いる場合
ECL Advanceを使用する場合には、希釈倍率の設定に注意する必要があります。抗体濃度の検討には、ドットあるいはスロッ トブロットが効果的です。以下の方法で抗体濃度をご検討ください。 1）サンプルをメンブレン上にスポットし、乾燥させます。希釈率の異なる一次抗体それぞれに対して1枚のブロットを用意し ます。PVDFメンブレンを使用する場合はあらかじめ100％メタノールによる親水化処理が必要です。 2） ECL Advance用ブロッキングバッファー（付録参照）を調製し、室温で1時間ブロッキングします。 3） 洗浄バッファー（PBS-TまたはTBS-T）で軽く2回すすぎを行います。 4） 系列希釈した一次抗体溶液中で（例：1/10,000、1/25,000、1/50,000、1/75,000、1/100,000）、室温で1時間振 とうします。 5） メンブレンを洗浄バッファーで2回軽くすすいだ後、15分×１回、5分×3回洗浄します。 6） 希釈した二次抗体溶液中で、室温で1時間振とうします。二次抗体の希釈濃度はX線フィルムで10分間露光する場合、 1/200,000を目安に希釈してください。 7） ステップ5）と同じ要領で、メンブレンを洗浄します。 8） 検出試薬でインキュベート後、フィルムに露光してシグナルを検出します。3.1
最適抗体濃度の決定
▲
― 23 ― ● 高いバックグラウンドが検出された場合 HRP標識抗体をさらに2倍以上に希釈して用いることで、結果が改善されることがあります。希釈倍率を極端に高くする とシグナルが検出されなくなることがあります。2倍から徐々に希釈倍率を上げてください。ビオチン−ストレプトアビ ジンシステムを用いている場合は、ビオチン化二次抗体とHRP標識ストレプトアビジンの両方をさらに同じ倍率で希釈し ます。 ● バックグラウンドは観察されなかったものの、非特異バンドが検出された場合 一次抗体をさらに2倍以上に希釈して用いることで、結果が改善されることがあります。
3.1.4
力価が明らかな抗体を用いたブロット検出−
ECL Advance / ECL Plus / ECL検出
3.1.3
力価のわからない二次抗体を用いる場合−
ECL Advance / ECL Plus / ECL検出
1） 3.1.1または3.1.2のステップ1）、2）と同様にドットあるいはスロットブロットとメンブレンのブロッキングを行います。 2） 一次抗体を希釈後、室温にて1時間メンブレンをインキュベートします。 3） 3.1.1または3.1.2のステップ3）にならってメンブレンを洗浄します。 4） 二次抗体を希釈後（例：1/3,000、1/5,000、1/7,500、1/10,000、1/25,000）、室温で各メンブレンを1時間インキ ュベートします＊。 5） 3.1.1のステップ5）または1.2のステップ3）にならってメンブレンを洗います。
6） プロトコールに従って、ECL Advance／ECL Plus／ECL検出試薬とインキュベート後、フィルムに露光してシグナルを 検出します。
＊ ECL Advanceを使用する場合には、希釈率に注意する必要があります（7ページの選択ガイドを目安に設定してください）。また、二次抗体の希 釈倍率を決定する場合は、一次抗体の希釈倍率を固定して二次抗体の至適濃度を検討します。
・高濃度のブロッキング剤を用いることで時間短縮が可能です。弊社のブ ロッキング剤（ECL Blocking agent：RPN2125）10%を含むPBS-Tま たはTBS-Tを用いると、10分間のインキュベートで十分な効果が得られ る場合があります（室温、振とう）。スキムミルクをブロッキング剤とし て用いる場合も同様です。ECL Advanceを使用する場合にはプロトコー ルどおりに検出してください ・ブロッキング時間の短縮には、高品質なHybond-P（PVDFメンブレン） およびHybond-ECL（ニトロセルロースメンブレン）が適しています。 1）メンブレンのブロッキング ・ブロッキング後のメンブレンの洗浄時間は短縮することができます。こ の場合、PBS-TまたはTBS-T中で15秒間ブロットをすすぎ、その後バッ ファーを交換してさらに15秒間をすすいでください。 ・一次抗体濃度を上げることにより、感度を下げることなく一次抗体反応 時間を20分程度まで短縮できます。インキュベーション時間に合わせて 抗体濃度を再検討してください。 ・一次抗体の洗浄はできる限り多量の洗浄バッファー（PBS-Tまたは TBS-T）を用い、3回以上ブロットをリンスした後、室温で10分間洗浄して ください。 ・抗体によっては4℃あるいは37℃でインキュベートすると時間を短縮で きる場合があります。 2）一次抗体の反応 ・二次抗体濃度を上げることにより、感度を下げることなく時間短縮がで きます。目安として、4倍濃度で15分間インキュベート（室温、振とう） することで同等の感度を得られます。この場合、バックグラウンドを抑 えるために、メンブレンの洗浄は十分に行ってください。 ・一次抗体の洗浄同様、できる限り大量の洗浄バッファー（PBS-Tまたは TBS-T）を用い、3回以上ブロットをリンスした後、室温で10分間洗浄 してください。 3）二次抗体の反応 ・一次抗体および二次抗体濃度を上げると、露光時間を短縮できます。 ・ECL Mini-Cameraを使用すると、現像時間が省略されるので、X線フィ ルムによる検出に比べ大幅に時間を短縮できます。 4）検出
HRP
標識抗体を使用する検出を、通常より大幅に時間短縮するための実験ガイドを紹介します。以下のガイドを参考 に実験操作をスムーズに行うことで、第2
章に示した検出プロトコールを約2
時間まで短縮できます。 注意：ECL Advanceは非常に高感度な検出試薬のため、 ECL PlusやECLで検討した抗体濃度をそのまま用いると、 バックグラウンドが高すぎてX線フィルムが真っ黒になってし まうことがあります（右図）。高感度な検出結果を得るために は最適抗体濃度の決定が必須となります。3.2
時間短縮のためのプロトコールガイド
3.3 ECL Plus
検出法から
ECL Advance
検出法へ移行するためのアドバイス
― 25 ―
ECL Advance
一次抗体 1：50,000 二次抗体 1：200,000ECL Plus
一次抗体 1：5,000 二次抗体 1：100,000←
50
50 ng
から等倍希釈したBSA
をHybond-P
（PVDF
メンブレン）にスロットブロットしました。抗BSA
モノクローナル抗体と
HRP
標識抗ラビット抗体（NA934
）をそれぞれ反応させ、ECL Plus/ECL Advance
検出試薬を用いて検出しました。
X
線フィルム（Hyperfilm ECL
）へ5
分間露光しました。＜実験例1＞
＜実験例2＞
80 40 20 10 5 2.5 1.2 0.6 (ng)
ECL Advance
ECL Plus
80 ng
から等倍希釈したBSA
をSDS-PAGE
後、Hybond-P
（PVDF
メンブレン）に転写しました。一次抗体として抗BSA
抗 体（1:20,000
）、二次抗体としてHRP
標識抗ラビット抗体（NA934
、1:200,000
）を反応させました。ECL Plus/ECL
Advance
検出試薬を用いて検出し、X
線フィルム（Hyperfilm ECL
）へ10
分間露光しました。抗体濃度を同条件で反応させた場合、ECL AdvanceはECL Plusより8倍以上高感度な結果が得られました。
GUIDE
結 果
ECL Plusと同条件の抗体希釈率で検出を行った場合、希釈濃度によってはバックグラウンドが非常に高くなる場合
がありますのでご注意ください。
ECL AdvanceではECL Plusと比較して、一次抗体を10倍、二次抗体を2倍に希釈することでほぼ同程度の検出感度
が得られることがわかりました。
GUIDE
結 果
ECL PlusからECL Advanceへ移行する場合は、まず二次抗体濃度をECL Plusの場合の2∼4倍希釈に固定してから、
一次抗体濃度をECL Plusの場合の4∼10倍希釈の範囲でご検討ください。
←
25
←
12.5
←
6.3
←
3.1
←
1.5
←
0.8
（
ng
）
←
50
←
25
←
12.5
←
6.3
←
3.1
←
1.5
←
0.8
（
ng
）
80 40 20 10 5 2.5 1.2 0.6 (ng)＜実験例＞
20 ng
から等倍希釈したBSA
をSDS-PAGE
後、Hybond-P
（PVDF
メンブレン）に転写しました。抗BSA
抗体（ウサギ）と抗ウサギ
HRP
標識二次抗体（NA934
）をそれぞれ反応させました。ECL Plus/ECL
検出試薬を用いて検出し、X
線フィルム（
Hyperfilm ECL
）への露光は10
分間行いました。2
％BSA
を含む大腸菌懸濁液を10
µ
g
から等倍希釈してSDS-PAGE
後、Hybond-P
（PVDF
メンブレン）に転写しました。抗
BSA
抗体（ウサギ）と抗ウサギHRP
標識二次抗体（NA934
）をそれぞれ反応させ、ECL Plus
検出試薬および
DAB
発色試薬を用いて検出しました。＜実験例＞
X線フィルムへの露光時間を10分間とし、上記の条件でウェスタンブロッティングを行いました。その結果、ECLに 比べECL Plusでは、一次抗体を4倍、二次抗体を2.5倍に希釈することでほぼ同等の感度が得られました。また、この 際バックグラウンドもほとんど見られませんでした。 A）一次抗体は2,000倍希 釈、二次抗体は10,000倍 希釈でそれぞれ反応させ、 ECL検出試薬を用いて検 出しました。 20 10 5 2.5 1.2 0.6 0.3 (ng) 20 10 5 2.5 1.2 0.6 0.3 (ng) B）一次抗体は8,000倍希 釈、二次抗体は25,000倍 希釈でそれぞれ反応させ、 ECL Plus検出試薬を用い て検出しました。 A）一次抗体は1,000倍希釈、二 次抗体は1,000倍希釈でそれぞ れ反応させ、DABを用いて検出 しました。DABの発色時間は15 分間としました。 レーン1：10 ng レーン6：0.3 ng レーン2：5 ng レーン7：0.15 ng レーン3：2.5 ng レーン8：0.07 ng レーン4：1.2 ng レーン9：0.03ng レーン5：0.6 ng レーン10：0.01ng B）一次抗体は20,000倍希釈、 二次抗体は10,000倍希釈でそれ ぞれ反応させ、ECL Plus検出試 薬を用いて検出しました。X線 フィルム（Hyperfilm ECL）へ の露光時間は10分間としまし た。 レーン1：10 ng レーン6：0.3 ng レーン2：5 ng レーン7：0.15 ng レーン3：2.5 ng レーン8：0.07 ng レーン4：1.2 ng レーン9：0.03ng レーン5：0.6 ng レーン10：0.01ng GUIDEECL Plusを用いた結果では、DAB発色法に比べて一次抗体を20倍、二次抗体を10倍に希釈することでほぼ同等の感度が
得られました。2％BSAを含む大腸菌懸濁液を等倍希釈してサンプルとしているため高濃度側で多少のバックグラ ウンドが見られますが、ECL Plusの結果はDABに比べ明らかにS/N比が高いことがわかります。
結 果
ECLからECL Plusへ移行する場合、ECLの至適化条件に対して二次抗体濃度を2∼4倍希釈に固定したうえで、一次
抗体濃度を2∼10倍の範囲で検討してください。 発色法からECL Plusへ移行する場合、一次抗体濃度は20∼50倍希釈から検討してください。二次抗体は、HRP標 識抗体を用いて露光時間を10分とする場合、10∼20倍希釈から検討してください。 GUIDE 結 果 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
3.4 ECL
検出法から
ECL Plus
検出法へ移行するためのアドバイス
3.5
発色法（
DAB
検出法）から
ECL Plus
検出法へ移行するためのアドバイス
― 27 ―
ECL Mini-Camera
は化学発光の検出チェックをインスタントフィルムを使用して行うカメラです。 通常、化学発光はX
線フィルムやCCD
カメラ等を搭載した画像解析装置を使用して検出を行いますが、このECL
Mini-Camera
を用いることによって、化学発光をインスタントフィルムに簡便に検出することができます。メンブレンサイ ズ74
×93 mm
までの検体はこのECL Mini-Camera
で検出できますので、暗室に行かずに実験台の上で検出のチェ ックを行うことができます。＜感度比較実験＞
1
×10
5倍から等倍希釈したHRP
標識抗ウサギ抗体（NA934
）をそれぞれ100 µl
ずつスロットブロットした後、ECL
Plus
およびECL
検出試薬、DAB
発色試薬でそれぞれ検出しました。ECL Plus
とECL
の露光時間は5
分間、DAB
の発色時間は
15
分間としました。X
線フィルムはHyperfilm ECL
、ECL Mini-Camera
はISO3000
相当のインスタントフィルムを用いました。
DAB発色法との感度比較（5分間露光）
検出試薬
ECL
ECL
ECL Plus
ECL Plus
検出フィルム
Hyperfilm
ECL Mini-Camera
Hyperfilm
ECL Mini-Camera
DAB
発色法に対して16
倍8
倍64
倍16
倍 ※ BCIP/NBT発色試薬はDAB発色試薬に比べ、4倍程度高感度です。 ※ 上記の結果は5分間露光による検出ですが、ECL PlusおよびECL検出試薬を用いた場合、露光時間を延長することによってより高い感度を得ることがで きます。ECL Mini-CameraとHyperfilmの検出感度の違いは？
1×105希釈 2×105希釈 4×105希釈 8×105希釈 16×105希釈 32×105希釈 64×105希釈 128×105希釈 256×105希釈 512×105希釈 1×105希釈 2×105希釈 4×105希釈 8×105希釈 16×105希釈 32×105希釈 64×105希釈 128×105希釈3.6 ECL Mini-Camera
と
Hyperfilm
の感度比較
▲
Mini-Camera Mini-Camera Mini-Camera
抗体濃度の至適化とブロッキング条件の至適化は、
ECL
シリーズのような高感度な検出系で、バックグラウンドが低 く、良好なS/N
比の結果を得るための重要なポイントです。 タンパク質をメンブレンにトランスファーした後に、抗体や他のプローブが非特異的に結合しないよう、非特異的な結 合部位をあらかじめ飽和させておく必要があります。効果的なブロッキングがおこなわれないと、高いバックグラウン ドをもたらします。 目的タンパク質の性質は個々のタンパク質によりさまざまです。また、抗体との結合性も、抗体の種類や抗原タンパク 質との組み合わせにより異なります。したがって、すべてのタンパク質に対して最良の結果をだすプロトコールという ものはありません。以下に、ウェスタンブロッティングでよく用いられるブロッキング溶液とその特徴をご紹介します。 これらのブロッキング剤は、ECL
シリーズに用いることができます。 通常ブロッキングは、室温30
分∼1
時間、あるいは4
℃一晩でおこないます。 ブロッキング剤濃度、反応温度を上げることで、効果が改善される場合もあります。■
ECL Blocking agent
（コード番号：
RPN2125
）
ECL
およびECL Plus
専用のブロッキング剤です。高感度な検出系に至適化したブロッキング剤で、バックグラウンドの 低い良好な結果が得られます。注意）
ECL Advance
で検出する場合は、キットに付属の専用ブロッキング剤をご使用ください。■ スキムミルク／
Tween 20
安価で効果の高いブロッキング剤です。通常
5%
スキムミルクと0.1%Tween20
をPBS
またはTBS
に加えて使用します。多くの場合、バックグラウンドの非常に低い良好な結果が得られますが、抗原によっては、抗体結合部位までマスキン
グされる場合があります。
ECL
、ECL Plus
の推奨ブロッキング剤のひとつです。■ スキムミルク
タンパク質実験操作で最も一般的なブロッキング剤です。非常に安価であり、多くの場合、バックグラウンドの低い良 好な結果が得られます。通常5%
スキムミルク濃度になるよう、PBS
またはTBS
に加えて使用します。スキムミルクの 欠点は、保存が利かないため、用事調製の必要があることと、抗原までマスキングしてしまうことがある点です。この ような場合、スキムミルク濃度を1%
まで下げることにより、シグナルが強くなることがありますが、改善されない場 合は、他のブロッキング剤を試します。■
Fish Gelatin
（コード番号：
RPN416
）
フィッシュゼラチンは動物由来のものより水素結合を形成するアミノ基が少ないため、低バックグラウンドになります。 通常2%
濃度で用いられ、溶解性もよく、この濃度であれば、4
℃でもゲル化しません。欠点は、抗原によってはマス キングされてしまう点と、ビオチンのような競合する物質が含まれる点です。また、比較的高価な試薬になります。■
BSA
価格もそれほど高価でなく、良好なシグナル強度が得られます。通常PBS
に0.3
∼3%
の濃度でPBS
に加えて使用しま す。炭水化物の夾雑物があるので、レクチンをプローブに用いた場合、バックグラウンドが高くなる可能性があります。 リン酸化チロシンの抗体による検出では、2%BSA
がブロッキング剤としてよく用いられます。■ 血清（ウマ血清あるいはウシ胎仔血清）
0.02%
アジ化ナトリウムを添加した10%
血清としてよく用いられます。このブロッキング剤は高価で、潜在的に交差 反応を引き起こす免疫グロブリンを含んでいるという欠点があります。二次抗体やProtein A
をプローブとして用いる 系には向きません。3.7
ブロッキング条件の至適化
▲
― 29 ―
■ 界面活性剤
NP-40
やTriton
のような界面活性剤は、メンブレン上のタンパク質と効率よく置換されてしまうので、使用は避ける べきです。Tween-20
は使用できますが、濃度を0.3%
以上にするべきではありません。一般的には0.1%
濃度で5%
ス キムミルクと組み合わせて使用します。■ ブロッキング剤のミックス
複数のブロッキング剤を組合わせて使用することで、良好な結果が得られる場合があります。 例）・1% ECL blocking agent（RPN2125）、0.5% BSA
・3% Fish Gelatin（RPN416）、10% スキムミルクin PBS 図3-1 ブロッキングバッファーの違いによるバックグラウンドの比較 ラット肝臓サンプルをSDS-PAGEし、メンブレンにブロットしたものを、抗リン酸化チロシン抗体PY20で検出 しました。 ブロッキングバッファー：a）BSA in TBS-T b）スキムミルクin TBS-T スキムミルクにはリン酸化タンパク質が含まれるため、リン酸化タンパク質の検出には適しません。 a ） b ）
ECL
ウェスタンブロッティング検出システムは、高感度で簡便な化学発光検出試薬です。ここでは、 について行った実験を紹介します。 １） ラット腎臓溶解液（20 µg/lane）を電気泳動し、Hybond-ECLにエレクトロブロッティングします。 2） メンブレンは10%スキムミルクを含むPBS-T（Tween0.1％）で1.5時間室温でブロッキングをおこなった後、PBS-Tで5 分×3回洗浄します。 3） メンブレンを2つのセクションに切り、別々に処理します。 メンブレンⅠ：抗アクチンマウスモノクローナル抗体と抗βチューブリンマウスモノクローナル抗体を各々1：3,000 希釈PBS中にて1時間反応 メンブレンⅡ：抗アクチンマウスモノクローナル抗体を1：3,000希釈PBS中にて1時間反応 4） メンブレンⅠ、ⅡともPBS-Tで5分間×3回洗浄します。 5） HRP標識二次抗体を反応させます。 メンブレンⅠ：抗マウスIgG-HRP標識二次抗体と抗マウスIgM-HRP標識二次抗体をPBS-Tに1：3,000希釈で30分反応 メンブレンⅡ：抗マウスIgM-HRP標識二次抗体をPBS-Tに1：3,000希釈で30分反応 6） メンブレンⅠ、ⅡともPBS-0.3%Tween20で5分間×3回洗浄します。 7） メンブレンⅠ、ⅡともPBS-Tで5分間×3回洗浄します。 8） ECLで1分間反応後、ラップに包み、Hyperfilmに30秒露光します。 9） PBS-TあるいはPBS-0.3%Tween20で10分×2回洗浄し、検出試薬を除去します。 10） メンブレンⅡを15%H2O2in PBS（30%H2O2とPBSを1:1で混合）に30分インキュベートし、HRPを不活性化します。 メンブレンⅠはPBS中で一晩保存します。 11） メンブレンⅠ、ⅡともPBS-Tで5分間×3回洗浄します。 12） メンブレンⅡをECLで1分間反応後、ラップに包み、Hyperfilmに1分露光します。 13）PBS-Tで10分×2回洗浄し、検出試薬を除去します。 10） メンブレンⅡを抗βチューブリンマウスモノクローナル抗体 1：3,000希釈PBS-Tで30分インキュベートします。 15）PBS-Tで5分間×3回洗浄します。 16）抗マウスIgG-HRP標識二次抗体をPBS-Tに1：3,000希釈で30分反応させます。 17）PBS-0.3%Tween20で5分間×3回洗浄後、PBS-Tで5分間×3回洗浄します。 18） メンブレンⅠ、ⅡをECLで1分間反応後、ラップに包み、Hyperfilmに1分露光します。HRP
の不活性化に必要なペルオキシドの濃度は、HRP
の量やインキュベート時間によって異なります。このサンプルでは15%
のペルオキシドが必要でしたが、これによるメンブレンの損傷や処理後の抗体反応への影響は見られませんでした。 この方法を使うことで、検出系を変えることなく、別のタンパク質に関する情報を得ることができました。 ●HRP
標識二次抗体を用いた抗原の標識と検出 ●HRP
の不活性化 ●最初に検出したタンパク質による妨害のない別のタンパク質の標識／検出3.8
過酸化水素によるホースラディッシュペルオキシダーゼの不活性化
▲
― 31 ―
図3-2
Rat Kidney Lysate を20 µg/レーンで泳動しHybond-ECLニトロセルロースメンブレン （RPN202QD）にブロットした。
ブロッキングは0.1% Tween 20を含むPBSに10%スキムミルクを加えたバッファーを用いた。 ブロッキング後、メンブレンは２つに分けて以下の条件下で抗体反応を行った。
（メンブレン ）抗チューブリン抗体と抗アクチン抗体を含む反応液で1時間インキュベートし た後、メンブレンを洗浄し、二次抗体抗-mouse IgG-HRP（Sigma）とIgM-HRP（Cappel）を 含む反応液でさらに30分インキュベートした。
（メンブレン ）抗アクチン抗体で1時間インキュベートした後、メンブレンを洗浄し、二次抗 体 抗-mouse IgM-HRP で30分間インキュベートした。
各メンブレンはECL 検出試薬で1分間の反応後、Hyperfilm ECL（RPN2103）に露光した。
図3-3 メンブレン は15%のH2O2を含んだPBS中で30分間インキュベートした後、ECL 検出試薬に 1分間反応させてHyperfilm ECL に1分間露光して検出した。 メンブレン はPBSに一晩漬けて保存した。 図3-4 メンブレン は抗チューブリン抗体で1時間インキュベートした後、Anti-mouse IgG-HRPで 30分間インキュベートした。 メンブレン とメンブレン （PBSで一晩保存したもの）をECL検出試薬 による反応後、 Hyperfilm ECLに30 秒露光して検出。
