二 次 元 電 気 泳 動 お よ び ECL Western Blotting を 用 い た 培 養 生 殖 細 胞 上 清 か ら の metallopeptidase の同定
― 54 ― 本報では、精細胞由来のタンパク質をサンプルとして二次 元電気泳動を行い、その後ECLによるウェスタンブロッティ ングによって特定のタンパク質スポットを同定した二次元ウ ェスタンブロッティングをご紹介します。二次元電気泳動後、
メンブレンにタンパク質を転写し、metallopeptidaseに対する 抗体を用いてウェスタンブロッティングを行いました。これ らの解析によって、N-arginine dibasic convertase、 amino-peptidase B、thimet oligopeptidaseを含む既知の生殖細胞由来 metallopeptidaseを同定することができました。
はじめに 10
1 4
ECL
GCCM
N-arginine dibasic (NRD) convertase (narlysin, EC 3.4.24.61) aminopeptidase B (ApB, EC 3.4.11.6) thimet oligopeptidase (TOP, EC 3.4.24.15)
使用した製品
実験方法
培養生殖細胞からの培養上清の調製
Pineau SD
5
GCCM
一次元目電気泳動：等電点電気泳動
GCCM 50 µg 400 µl
8 M 0.5 % Triton X-100 0.2 % DTT 0.5 %(v/v) Pharmalyte 3-10 Orange G
Immobiline DryStrip 3-10 NL 18 cm)
MultiTemp III EPS 3500XL
Multiphor II 1
二次元目電気泳動：SDS-PAGE
Immobiline DryStrip 6M 2 % SDS 10 % 0.5 % DTT 50 mM Tris-HC（pH 6.8）
10 DryStrip 6M
2% SDS 10% 4.5%
50 mM Tris-HCl(pH 6.8) 10
SDS-PAGE ExcelGel SDS Gradient
XL 12-14 ECL Western Blotting
Molecular Weight Marker 1
表7-1．電気泳動条件
Voltage Current Power
Step (V) (mA) (W) Time
IEF
1 500 1 5 5 h
2 500 1 5 5 h
3 3,500 1 5 9.5 h
SDS-PAGE
1 1,000 20 40 45 min
2 1,000 40 40 5 min
3 1,000 40 40 2 h 40 min
銀染色と金コロイド染色 6
PVDF AuroDye Forte Kit
タンパク質のメンブレンへの転写 P V D F
Novablot 1 cm2 0.8 mA 1
ECLを用いたWestern blotting ECL
SDS-PAGE 1D
3% BSA deglycosylated TBS 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) 150 mM NaCl 1
4
0.1%(v/v) Tween 20 /
TBS 1% BSA
deglycosylated 0.1%(v/v) Tween 20 / TBS 1 1/8,000
2 HRP
1/3,000 ECL
Hyperfilm
表7-2．ECLウェスタンブロッティングにより検出されたmetallopeptidaseの特性
タンパク質 Standard Spot Number m（kDa） pI
thimet oligopeptidase 4907-4913-5915-5916-5917 74.4-75.2 5.46-5.59
NRD convertase 3402-3405-3417-3418-3422-3423-4402 23.5-25.4 5.05-5.31
aminopeptidase B 1004-1008-1010-1109 11.3-11.9 4.60-4.62
3.6 4.4 5.2 5.6 6.0 6.4 7.0 8.0 pH (non-linear)
m (kDa)
90 –80 – 70 – 60 – 50 – 40 – 30 –
20 – 15 –
図7-1．銀染色を行ったGCCMの二次元電気泳動
GCCMから回収したタンパク質50 µgをIPG DryStrip 3-10NL（一次元目 電気泳動）およびExcelGel SDS gradient 12-14%（二次元目電気泳動）に よ り 二 次 元 電 気 泳 動 を 行 い ま し た 。G C特 異 的 に 発 現 し て い る metallopeptidaseのウェスタンブロッティング検出にはECLを用いました。
図7-2．ECLウェスタンブロッティング（A）ならびに金コロイド染色（B） を用いて検出したGCCM中のthimet oligopeptidaseのスポット 実験は図7-1と同様の方法で行い、ウェスタンブロッティングによって検 出されたタンパク質のスポットを長方形の枠で囲っています。Standard Spot Number 7210のタンパク質スポットは以前にN末端アミノ酸シーク エンシングによってtesticular phoshatidylethanolamine binding protein と同定されたタンパク質のフラグメントです。右側のレーンにはECL Western Blotting Molecular Weight Markerを泳動しています。サイズは 上から、97,400、68,000、46,000、31,000、20,100、14,400 Daにな ります。
リプロービング
100 mM /
2%(w/v) SDS / 62.5 mM Tris-HCl(pH 6.7) 50 30
0.1 %(v/v) Tween 20 / TBS 10 2 3% BSA deglycosylated TBS 50mM Tris-HCl (pH 7.6) 150 mM NaCl 1
結果と考察
GCCM metallopeptidase ECL
1 2 1
thimet oligopeptidase ECL
ECL 2
3
ECL Western Blotting Molecular Weight Marker
結論 ECL
metallopeptidase
参考文献
1. Boitani, C. et al., Cell Differentiation 9, 41-49 (1980).
2. Kramer, J. M. and Erickson, R. P., J. Reprod. Fert. 64, 139-144 (1982).
3. Jutte, N. H. P. M. et al., J. Exp. Zool. 233, 285-290 (1985).
4. O' Brien, D. A., Biol. Reprod. 37, 147-157 (1987).
5. Pineau, C. et al., J. Androl. 14, 87-98 (1993).
6. Heukeshoven, J. and Dernick, R., Electrophoresis 9, 28-32 (1988).
図7-3．ストリッピングによるウェスタンブロッティングのシグナルの影響
NRD convertaseをウェスタンブロッティングにより検出しました。一次
抗体には抗NRD convertase抗体、二次抗体にはHRP標識抗ウサギ抗体を 用いました（A）。メンブレンを本文中の方法によってストリッピングし、
thimet oligopeptidaseのウェスタンブロッティング検出を行った後に再度 メンブレンをストリッピングし、NRD convertaseの検出を行いました（B）。
― 56 ―
本報では、チロシンリン酸化タンパク質のプロテオーム解 析に二次元ウェスタンブロッティングを利用した例をご紹介 します。まず、二次元電気泳動後のタンパク質をPVDFメン ブレンに転写し、イムノブロット解析によりチロシンリン酸 化タンパク質を検出しました。つづいて、このイムノブロッ ト解析の結果を、蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳 動解析（2D DIGE）により検出された発現差異データ、およ びタンデムマス解析（MS/MS）によるタンパク質同定結果と 関連づけて解析しました（図7-4、7-5）。
Ettan DIGEシステムは、内部標準を利用したプロトコール を用いることで、キトサン処理／未処理 Arabidopsis thaliana
（シロイヌナズナ）抽出サンプルにおいて、リン酸化チロシン 抗体により検出されたタンパク質スポットならびにチロシン リン酸化されていないタンパク質の発現差異を明らかにしま す。ウェスタンブロッティングにより検出された87個のタン パク質をMS/MSによる質量分析のために切り出し、また、発 現差異のみに基づいて92個のタンパク質を選択しました。こ の結果、4個のチロシンリン酸化タンパク質で発現量に有意 な変動がみられました。
はじめに
32P
PY20 1 4G10
2
2 3 ECL Plus Western Blotting Detection Reagents
2D DIGE Arabidopsis
thaliana
7-5 A. thaliana
130 Mb A. thaliana
4 2D DIGE Ettan DIGE Differential Gel Electrophoresis
CyDye Cy2 Cy3 Cy5
CyDye
5 A. thaliana