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第 6 章
miniVE
とは...
泳動、ゲルキャスティング、ブロッティングを
1
つのユニットで行うことができる一体型の縦型電気泳動装置です。6.1.1 ゲルモジュールの準備
6.1.2 ゲル作製
6.1.3 サンプル添加
1）ゲルサンドウィッチ（ノッチ付きガラスプレートおよびガラスプレート のセット）を作製ゲル枚数分準備します。
2）ゲルサンドウィッチをゲルモジュールに設置し、クランプで挟みスクリ ューをしっかり締めます（図6-1）。
3）シーリングプレートを起こし、つまみをしっかりとはめ込みます。シー リングプレートのガスケットがゲルサンドウィッチの底辺に密着してい ることを確認してください。
1）ウェルを崩さないようにコームをはずし、泳 動バッファーでウェルを洗浄します。
2）ウェルに泳動バッファーを満たし、サンプル を添加します。
1） ゲル溶液を準備します（枚数、厚さによって溶液量が異なります）。
必要なゲル溶液量（2枚分）
ゲル厚（mm） 分離ゲル（ml） 濃縮ゲル（ml）
0.75 15 3.35
1.0 20 4.47
1.50 30 6.70
※バッファー組成、ゲル溶液の調製については付録を参照してください。
2）10% 過硫酸アンモニウム、TEMEDを加えた分離ゲル溶液をゲルサンドウィッチへ流し込み、n-ブタノール飽和水溶液を 重層して1時間以上重合させます。
3）n-ブタノール飽和水溶液を除き、濃縮バッファーで分離ゲル表面を洗います。
4）濃縮ゲル溶液を重層して静かにコームを差し込み、1時間以上重合させます。
クランプ スクリュー ゲルサンドウィッチ
シーリングプレート
ウェル深1 mmあたりのサンプル量（µl）
ウェル数 ゲル厚
0.75 mm 1.0 mm 1.5 mm
5 9.5 12.7 19.1
9
−5.8
−10 3.6 4.8 7.2
15 2.2 2.9 4.4
18
−2.9
−図6-1
6.1 miniVE ミニゲル用電気泳動装置／ブロッティング装置
▲
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6.1.4 泳動槽の準備
1）シーリングプレートのつまみを下段の窪みにはめ込み（図6-2）、下部バッ ファータンク内にゲルモジュールを設置します。
2）上部バッファーチャンバーに泳動バッファーを満たします。ノッチ付きプ レートの3〜5 mm上までバッファーを注ぎ入れてください。
3）下部バッファータンクの「MIN」の表示より上、「MAX」の表示の下まで 泳動バッファーで満たします。必要なバッファー量はゲル（ゲルモジュー ル）により異なります。
1）ゲルモジュールの陰極、陽極の縁にガスケットをはめ込みます。
2）ゲルと同じサイズのブロッティングペーパーを準備し、トランスファーバッファーに浸しておきます。
3）メンブレンをゲルと同じサイズにカットします。ニトロセルロースメンブレンは蒸留水につけた後、PVDFメンブレンはメ タノールで親水処理を行った後にトランスファーバッファーに浸しておきます。図6-3のようにダクロンスポンジ（a,f）、 ブロッティングペーパー（b,e）、ゲル（c）、メンブレン（d）を重ねます（メンブレンとゲルの間に気泡が入らないように します）。
4）陰極の上にa〜fをのせ、Blot Moduleを300〜350 mlのトランスファーバッファーで満たします。
5）Blot Moduleを下部バッファータンクに設置します。下部バッファー タンクを1.2〜1.7 Lの室温もしくは4℃に冷却した蒸留水で満たしま す。
6）リッドを被せ、電極コードをパワーサプライに接続します。
7）定電流でブロッティングを行います。Towbin Bufferを使用する場合、
300〜400 mAで1〜2時間の条件で行います。
6.1.7 Blot Module（オプション）の取り扱い 6.1.6 泳動終了
1）リッドを被せ、電極コードをパワーサプライに接続します。
2）定電流もしくは定電圧で泳動を始めます。SDS-PAGEでは、10〜20 mA/ゲルで泳動します。
3）色素がゲル下端に達する直前に泳動を終了します。
a b
c d e f
6.1.5 泳動
1）電源を切り、リッドをはずします。
2）ゲルモジュールを逆さにして泳動バッファーを捨て、ゲルサンドウィッチを取りはずします。
3）プレートからゲルをはがし、染色もしくはブロッティングを行います。ブロッティングを行う場合、ゲルをトランスファー バッファーに浸して平衡化します。
図6-3
図6-2 リッド
ゲルモジュール 下部バッファー
タンク
陽極
陰極
6.2.1 転写の準備
6.2.2 ブロッティングの実行
TE 70 / TE 77
とは...
TE 70
、TE 77
は、低電流・低電圧下で発熱量を最小限におさえながらタンパク質をゲルからメンブレン上にすばやく転写できる装置です。
1）陽極、陰極の各電極板を脱イオン水ですすぎます。
2）ウェル部分と濃縮ゲルを除いたゲルサイズを測定します。
泳動後のゲルは必要に応じてトランスファーバッファーで平衡化します。
3）測定したゲルサイズより各辺2 mm程小さい 窓 をマスク中央に開けます（マイラーマスク）。このマスクを陽極電極板 上におきます。
4）4〜6枚のブロッティングペーパーをゲルと同じサイズにカットし、2〜3枚×2組に分けてトランスファーバッファーに浸し ます。
5）メンブレンをゲルと同じサイズにカットします。ニトロセルロースメンブレンは脱イオン水ですすいだ後、PVDFメンブレ ンはメタノールで親水処理を行った後にトランスファーバッファーに浸します。
6）以下のようにブロッティングペーパー、メンブレン、ゲルを陽極電極板上に重ねていきます（下図）。 a：4）のブロッティングペーパー1組を軽くバッファーをきり、陽極電極板においた
マイラーマスク上に 窓 を覆うように重ねます。
b：5）のメンブレンをa）に重ねます。
c：2）のゲルをb）に重ねます。
d：4）の残りのブロッティングペーパーをc）に重ねます。
7）カバーをセットし、電極コードをベースの接続口に差し込みます。
8）複数枚のゲルを転写する場合は、電極の接触をよくするために カバーの上に1 kgの重しをのせます。
1）パワーサプライの電圧値を50 Vに設定します。
2）電極コードをパワーサプライにつなぎます。（赤：陽極、黒：陰極）
3）ゲルサイズに対し、0.8 mA / cm2に電流値を設定します。
4）ブロッティングを開始します。（通常、1時間以内に終了しますが、高分子タンパク質やNative状態のタンパク質を転写す る場合はさらに時間をかけたほうが転写効率が上がります。ただし、2時間以内に終了してください。）
注意：ブロッティング中、電圧値が以下のような場合、サンプルやユニットにダメージを受けることがあります。
・ 電圧が20 V以上になる：イオン強度が不適当→バッファー濃度を確認してください。
・ 電圧が10 V以上変動する：バッファー不足→トランスファーバッファーに浸したブロッティングペーパーを増やしてください。
・ カバーの温度が上がった場合にもトランスファーバッファーに浸したブロッティングペーパーを増やしてください。
マイラーマスク
ゲル メンブレン
ブロッティングペーパー 2-3枚
ブロッティングペーパー 2-3枚
6.2 TE 70 / TE 77 セミドライブロッティング装置
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6.2.3 ブロッティング終了後
1）パワーサプライのスイッチを切り、電極コードをぬきます。
2）カバーから出ている電極コードをベースからぬき、カバーをはずします。
3）メンブレンを取り出します。
注意： ・ユニットは、脱イオン水ですすぎ乾燥させます。オートクレーブ、自動洗浄装置は使用しないでください。
・セイフティーインターロック部と電極コードはぬらさないでください。
・ユニットを水につけ込まないでください。
ブロットプロトコールを行うには、最初にブロット用トレイと試薬を準備します。ブロット用トレイをトレイサポー トにのせ以下のセットアップ操作をしてください。
・ ペリスタルティックポンプのチューブをトレイリッドにつなぎます。
・ トレイの水平調節を行います。
・ ポンプのキャリブレーションを行います。
（トレイサイズを変えるときは、必ずトレイの水平調節を行ってください）
＜ブロットモード＞
MultiProcessor
とは...
ウェスタンブロッティングにおけるメンブレンの検出用溶液の交換およびゲルの染色、脱色を自動的に行う装置です。
ブロットしたメンブレンをブロット面が上になるようにトレイに のせ、リッドをセットします。試薬チューブをあらかじめ準備 しておいた抗体や洗浄用ボトルに正しく差し込みます。
メンブレンをセットしたチャンバーのバルブ（リッドに設置さ れています）を開きます。使用しないチャンバーのバルブは閉 じていることを確認してください。
プロトコール、メンブレン数およびトレイサイズを選択し、ス タートボタンを押します。ECLまたは発色法によるウェスタン ブロッティング検出用プロトコールがあらかじめ入力されてい ますが、自分でもプログラムすることができます。
選択したプロトコールに従って、溶液の添加、振とう、排出を 自動的に行います。実行中のプロトコールを変更したり、ステ ップを追加することもできます。
マニュアル操作でECLシリーズ検出試薬をメンブレンに添加し ます。（発色法の場合、発色試薬を自動添加します）
使用後は、チューブの洗浄を行います。
■ ブロット操作
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6.3 MultiProcessor ゲル・メンブレン用自動検出処理装置
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プログラミング済みブロット用プロトコール
プログラム 用途
１．ECL Plus ECL Plus検出キット用
２．ECL ECL検出キット用
３．Standard 一次抗体および二次抗体による免疫検出
４．Enhanced 一次抗体およびビオチン化二次抗体とスト
レプトアビジン化合物による免疫検出
５．Clean チューブ、バルブおよびボードの洗浄