博 士（医学 ） 朱 学位論 文題名
棠
レチノイン酸により誘起されたHL − 60 細胞の分化過程 におけるセリン／スレオニンプロテイ・ンホスファターゼ PP2A およびPP1 の動態とその意義
学位論文内容の要旨
I目的1 ホ ルモ ン応答や細胞増殖など生体における多くの細胞機能は、タンバクのりン 酸化／ 脱リ ン酸 化により可逆的に調節される。タンバク質リン酸化は、プロテインキナ ーゼに よろ りン 酸化とプロテインホスフんターゼによる脱リン酸化により調節される。
フ゛ロテインホスファターゼは，基質特異性の差異により、セリン／スレオニンホスファ ターゼ、チロシンホスファターゼ．およびデュアルホスファターゼの3群に大別される。
本研究 にお いて は、 レチ ノイ ン酸 刺激 によ ってヒト骨髄性白血病細胞株HL‑60細胞の穎 粒球への分化を誘導し、その過程における二種類のセリン／スレオニンホスファターゼ、
PP2A及びPPLの動態を解析したっ
［方 法及 び結 果lHL．60細胞 は血 清飢 餓法 によ りG。期に 同調 させ た。 次いで血清刺激 と同 時fニluMレチノイン酸の有無により穎粒球への分化と増殖（コント口ール）に導い た： この 条件 下でHL．60細 胞は 、レ チノ イン酸によろ分化誘導2日目まではレチノイン 酸非存在下と同機の細胞周其恥で増殖し、細胞数に有意の差は認められなかった。しかし、
4日 目に は、 レチノイン酸存在下の細胞はほとんど増殖を停止した。5日目では、分化型 細胞およ・びNBT染色細胞の割合はそれぞれ35%から95％に、および34％から86％に増加した。
そこ で、 この 分化 と増 殖の 過程 で、 経時 的に セリ ン／ス レオ ニン ホス ファターゼPP2A 及びPP1の動態を解析した。
Mvelin Basic Protein（MBP） を 基質 とし て測 定し たHL‑60細 胞の 粗抽 出液 のPP2A 活性は、血清存在下レチノイン酸で刺激後18時間（G 1/S閲）に．、一過性の上昇を示した。
ホ ス ホ リラ ーゼaを基 質と して 測定 したPP2Aのポテ ンシ ヤル 活性 は、 レチ ノイ ン酸 の 有 無にかかわらず血清刺激後24時間（S期）に一過性の減少を示した。MBPを基質として 測 定したHL゛6（）細胞の粗抽出液のPP1活性は、血清によろ増殖刺激後27‑36時間（G2.
M期 ‥こ 一過 性上 昇が 認め られ たーこれに対しレチノイン酸による顆粒球への分化過程 で は、このPP1の活性上昇．は完全に抑えられた。ホスホリラーゼaを基質として測定し たPP1活 性 は 、 レ チ ノ イ ン 酸 の 有 無 に か か わ ら ず 顕 著 な 変 動 を 示 さ な か っ た 。 次 にHL．60細 胞 の増 殖と レチ ノイ ン酸 によ る分 化の 過程 におい て、PP2A及びPP1の 触媒 サブ ュニ ゛ソト蜀の変動をウエスタンブロット法によって解析した。PP2A触媒サブ ユニ ・ッ ト最 はレチノイン酸の有無にかかわらず1S時間までは変化なく、24時間後に一 過性 に減 少し た． このPP2八 触媒 サブ ユニ ット 景の減 少は 、S期に おけ ろPP2Aのポテン シヤ ル活 性の 減少 と時間 的に 一致 した 、
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レチ， ′イン酸刺 激後18時間 におけろPP2八活性の上昇の健構を明らかにする目的で、
分 化ま た は増 殖 過 程に あ るHLG（1細 胞の粗抽 出液につ いて、DEAE．セ ファロー スカラ ム ク口 マ トグ ラ フ イー を 行っ た ー 分化・ 増殖前の 細胞(0時間） の粗抽出 液のPP2A活性 のほと んどは、0．23M NaCl前後で溶 出された っ血清刺 激のみの増殖過程にあるHL．60 細 胞 の18時 間 （C18時 間 ） 及 び24時 間 （C24時 間） 後 の 粗抽 出 液のPP2A活 性 は、0時 間 のPP2A活 性 と同 様 に0.2 3M NaCI前 後 で溶 出 され た 。 これ に 対 しレチノイ ン酸によ ろ 分 化 過 程18時 間 （R18時 間 ） のPP2A活 性 のほ と ん どは 、0.13M NaCl前 後 で溶 出 さ れ た っ し か し分 化 過程24時間(R24時 間） の 粗 抽出 液 のPP2A活 性 、 は再 ぴ 元 の0.2 3M NaCl前 後 に 溶 出 さ れ た 。1985年Tungら の 報 告 で は 、 ウ サ ギ 筋 肉 の 抽 出 液のPP2A活 性 は 同 様 の ク ロ マ イ ト グ ラ フ イ ー で0.1 ‑ 0.15MNaCl、0.19・0.2 4M NaCl、 及び 0．28．O．32M NaClの 三つ の ピ ーク と して 溶 出 され 、 そ れぞ れPP2Ao｀PP2A1｀ 及び PP2Aっと 命 名 され た 。 この 命 名に 従 え ぱ、 本 実験 で 認 めら れ たO時間、C18時 間、C24 時 間のPP2A活 性はPP2Aヱ ｀レ チ ノ イン 酸 に よる 分 化過 程18時 間 のPP2A活性 はPP2Ao｀ そ して24時 間 後 の活 性 はPP2 Aiと なろ。 このR18時間 のPP2Aoを確認 す．るため 、次の 三 つ実 験 を行 っ た っくDRL8時 間とC18時 間のPP2A主 活性 画 分 を混 合して 再クロマ トグ ラ フイ ー を行 っ た とこ ろ 、そ の 両 活性は それぞれ 分離して元 の位置に 溶出され た。◎
Tunzらに よ れ ば、PP2Aー 活性 は ホ スホ リ ラ ーゼaを 基 質と し た 時にプ ロタミン 依存性 が ある ：本実 験のR18時間 のPP2´、活 性をホス ホリラー ゼaを基質と して測定 した時の ピーク はO．2．うmU／mlであるが、5u譬／mlプロタミン共存下では著しく増強され、1．l mL．／mIにな1）、↓倍以上の活性化であった。◎PP2Aは触媒サプユニット（C）、構造サプ ユ ニ ッ トfA） 、 及 び 調 節 サ ブ ユ ニ ッ ト （B） で 構 成さ れ てい る 。PP2Ao｀PP2Al及び PP2Aっ は そ れ ぞ れCAB． 、CAB及 びCAの サ ブ ュ ニ ッ ト 構 成 で あ り 、PP2AoとPP2AIの 差異はBサブュニッ トの違い にあろこ とが知ら れている 。そこで 抗B サプユニット抗体 と 抗Bq廿ブ ユ ニ ット 抗 体を 用 い て、DEAE． セフ ァ ロ ース カ ラ ムで 溶出され たO時間、
C18時 間 、C24時 間 、R18時 聞 及 びR24時 間 のPP2A活 性 画 分 を ウ エ ス タ ン ブ ロ ット 法 によっ て比較した 。抗B．サ ブユニッ ト抗体を 用いたウ エスタン ブロットでは、R18時間 のみで5↓kDのB サプ ユニット バンドが 認められ た。これ に対し抗Baサプユニット抗体 を 用 い た ウ エス 夕 冫ブ ロ ッ トで は 、R18時 間 のサ ン プ ル以 外 のO時間 、C18時間 、C24 時 間 及 びR24時 間 の ． サ ン プ ル に 、55kDのBaサ プ ュ ニ ッ ト バ ン ド を 認 め た 。 次 に、分化あ ろいは増 殖過程に あるHL．60細 胞の粗抽 出液のPP1活 性を同様の 条件の DEAE・セ フ ァ ロー ス ヵ ラム ク 口マト グラフイ ーにより 解析した 。増殖過程30時間にお い ては 、MBPを 基 質 とし て 測定 し たPP1活 性 は、0.2 5M NaCI前後で 溶出され る画分に お ぃて 明 らか に 上 昇し て いた 。 しかし、 レチノイ ン酸によ る分化過程30時間の同 画分 の 活性 は 、む し ろ 減少 し てい た 。
1ま と め1ぶNtBPを 基 質 と し て 測 定 したHL‑60細 胞 の粗 抽 出 液のPP2A活 性は 、 レ チ ノイ ン酸存在 下でのみGl／S期（18時間 ）に一過 性の上昇 を示した 。この時PP2Aはホロ 酵素PP2A，の性状 を示したが 、培養2′l時間には 元のホロ 酵素PP2Alの性 状に戻った。
これ らの変化 はレチノイ ン酸依存 的である ことから、分化誘導援構の一部として機能し てい る可能性 があろ す なわちレ チノイン 酸刺激さ れたHL．60細 胞のGl／S移 行期（18 時 間 ）にPP2Aの ホ口 酵 素型が変 換し、その 標的蛋白 が変わる ことで細 胞を分化 へと導 く と ぃう 濺 溝が 考 え られ ろ 、＠ ホ ス ホリ ラ ーゼaを 基質 として測 定したPP2Aの ポテン シャ ル活性は 、レチノイ ン酸の有 艇にかか わらず培養24時間に一通性の減少を示した。
この 時間にの みPP2′ヽの触繊サブヱニットが減少しており、活性の減少と一致した。こ れら の変化は レチノイン 酸非依存 的であり 、S期と一 致すろこ とから増 殖に関与してい
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学位論文審査の要旨
主 査 教 授 小 野 江 和 則
副 査 教 授 小 林 邦 彦 副 査 教 授 齋 藤 政 樹 副査 教授 菊池九二三
学 位 論 文 題 名
レ チ ノ イ ン 酸に より 誘起 され た HL ― 60 細 胞の 分化 過 程 における セリン／スレオニンプ口テインホスファターゼ PP2A および PP1 の動態とその意義
本 研究 に おぃ て は 、レ チ ノ イン 酸 刺激 に よ って ヒト骨髄性 自血病細 胞株HL‑60細 胞の穎 粒球への 分化を誘 導し、そ の過程にお ける二種類のセリン／スレオニンホスファ タ ー ゼ 、PP2A及 ぴPP1の 動 態 を 解 析 し た 。 実 験 成 績 は 以 下 の よ う に 要 約 さ れ る 。 1）Myelin Basic Protein（MBP） を 基 質 と し て 測 定 し たHL．60細 胞 の粗 抽 出 液の PP2A活性は 、血清存 在下レチ ノイン酸 で刺激後18時間（Gl／S期 ）に、一 過性の上昇を 示 した 。 ホ スホ リ ラー ゼaを 基 質と し て測 定 し たPP2Aの ポテンシャ ル活性は 、レチノ イン酸 の有無に かかわら ず血清刺 激後24時間 （S期）に一過性の減少を示した。MBPを基 質 とし て 測 定し たHL．60細 胞 の 粗抽 出 液のPP1活 性は 、 血清 に よ る増 殖 刺 激後27‑36 時間（G2.M期）に一 過性上昇 が認めら れた。こ れに対しレチノイン酸による顆粒球への 分 化過 程 で は、 こ のPP1の活 性上昇は 完全に抑 えられた 。ホスホリ ラーゼaを 基質とし て測定 したPP1活性 は、レチ ノイン酸 の有無に かかわらず 顕著な変 動を示さ なかった。
2． ）次 にHL 60細胞 の 増殖と レチノイ ン酸によ る分化の 過程におい て、PP2A及びPP1 の触 媒 サ ブュ ニ ット 量 の 変動をウ エスタン ブロット 法によって 解析した 。PP2A触媒サ ブユ ニ ッ ト量 は レチ ノ イ ン酸の有 無にかか わらず18時 間までは変 化なく、24時間後に 一過 性 に 減少 し た。 こ のPP2A触媒 サ ブユ ニ ッ ト量 の 減 少は、S期に おけるPP2Aの ポテ ンシ ャ ル 活性 の 減少 と 時 間的 に 一 致し た 。 ．
3）レチノイ ン酸刺激 後18時間に おけるPP2A活性の上昇の機構を明らかにする゛目的で、
分化または 増殖過程 にあるHL、 ．60細胞の 粗抽出液 について 、DEAE．セファロースカラ ムク ロマ トグラフ イーを行 った。分 化・増殖 前の細胞（O時間）の 粗抽出液 のPP2A活性 のほ と んど は 、0．23M NaCl前 後 で溶 出された 。血清刺 激のみの増 殖過程に あるHL‑60 細 胞 の18時 間 （C18時 間 ） 及 び24時 間(C24時 間 ） 後 の 粗 抽 出 液 のPP2A活 性 は、0時 間のPP2A活 性と 同 様 に0．23M NaCl前 後 で溶 出 され た 。 これ に 対しレ チノイン 酸によ る 分 化 過 程18時間 （R18時 間 ） のPP2A活 性 のほ と ん どは 、0．13M NaCl前後 で 溶出 さ
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れた 。 しか し 分 化過 程24時 間 （R24時 間 ）の 粗 抽出 液 のPP2A活 性は、再 び元の0．23M NaCl前 後 に 溶出 さ れ た。Tungら の命 名 に 従え ば 、本 実 験 で認 め られ た0時 間 、C18時 間 、C24時 間 のPP2A活 性 はPP2A． 、 レ チノ イ ン酸 に よ る分 化 過程18時間 のPP2A活 性 はPP2Ao、 そ し て24時 間後 の 活性 はPP2A1と なる 。
4） こ のR18時 間 のPP2Ao以 下 の 実 験 で 確 認 さ れ た 。 ＠R18時 間 とC18時 間 のPP2A主 活性画分を混合して再クロマトグラフイーを行ったところ、．両活性は完全に分離された。
◎R18時 間 のPP2A活 性 を ホ ス ホ リ ラ ー ゼaを 基 質 と し て 測 定 し た 時 の 活 性 は プ ロタ ミン共存 下では著 しく増強 された。 ◎PP2Aは触媒 サブユニッ ト（C）、 構造サプ ユ ニ ッ ト （A）、 及 び調 節 サ ブユ ニ ット （B） で 構成 さ れて い る 。PP2Ao｀PP2A1及 び PP2A2は そ れ ぞれCAB 、CAB及 びCAのサ プユニッ ト構成で ある。抗B サブユニ ット抗 体 を用いたウ エスタン ブロット では、R18時 間のみで54kDのB．サブユミ．ットバンドが 認 め ら れ た。 こ れに 対 し 抗Baサ ブユ ニ ット 抗 体 を用 い たウ エ ス タン ブ ロ ット で は、
R18時 間 の サ ン プ ル 以 外 の0時 間 、C18時 間 、C24時 間 及 びR24時 間 の サ ン プ ル に 、 5 5kDのBaサブユニットバンドを認めた。
5）PP1活 性 を 同 様 の条 件 のDEAE‑セフ ァ ロ ース カ ラ ムク ロ マト グ ラ フイ ― によ り 解 析し た 。増 殖 過 程30時間 に お いて は 、MBPを 基 質と し て 測定 し たPP1活性は、0．25M NaCl前 後 で溶出さ れる画分 において 明らかに 上昇してい た。しか し、レチ ノイン酸 に よ る 分 化 過 程 30時 間 の 同 画 分 の 活 性 は 、 む し ろ 減 少 し て い た 。 公 開発 表 は 約30名の 聴 衆 の前 で 行 われ 、 小林 教 授から基 質を選択 した根拠、B． B．サブ ユニット 変換のメ カニズム 、プロタ ミンの作 用機構、斎 藤（政） 教授より、レ チノイ ン酸の作 用部位、 細胞分化 と増殖の 関係について、菊池教授より、ホスホリラー ゼaホス フんター ゼ活性の 減少機構 について 質問がな された。申 請者はお おむね適切な 回答を なし得た 。
以上本実験で得られた成績は、HL．60細胞の分化・増殖におけるプロテインホスファ タ ーゼの役 割を解明 する上で 重要な新 知見であ る。審査員一同は、これらの成果を高く 評価し、申請者が博士（医学）の学位を受けるのに充分な資格を有するものと判定した。
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