<総説>ヒ卜骨肉腫の実験モデルとしてのべリリウム骨肉腫とハムスター骨肉腫について 利用統計を見る

山梨医大誌3（2），39∼46，1988 総 説

ヒト骨肉腫の実験モデルとしてのベリリウム

骨肉腫とハムスター骨肉腫について

福島 博・赤松功也

    山梨医科大学整形外科学教室 抄録：実験モデルは所詮はモデルであってヒトの疾患と同じということは有りえない。しかし， 動物実験は医学の研究におけるもっとも重要な手段の一つである。著老は骨肉腫の実験モデルにつ いて概説するとともに著者が実際に使用した家兎ベリリウム骨肉腫，ならびにハムスター骨肉腫に ついて検討を加え報告した。骨肉腫実験動物としては現在までに犬，家兎，ラット，マウスあるい はハムスターなどが報告されている。1955年以来1979年まで著者らは骨肉腫の実験モデルとして炭 酸べりリウム（以下，Beと称する。）投与により家兎に骨肉腫を発生させ，1979年以降はハムスタ ー骨肉腫について検討を加えてきた。Beの注入による骨肉腫の発生頻度はBeを注入した家兎の うちで18．5％またBe注入終了後も生存しつづけた家兎のうちでは62．7％であった。また，骨 肉腫の平均発生時期は：Be注入開始後14カ月であった。そして，肺転移率は骨肉腫が発生した家兎 では100％であった。一方，ハムスター骨肉腫の移植成功率は約95％で肺転移形成率は約70％ であった。Be家兎骨肉腫とハムスター骨肉腫の両者とも病骨組織所見はヒトの骨肉腫に極めて類 似し，高頻度に肺転移がおこる点も似ていた。これらは実験骨肉腫として好ましい条件を供えてい るといえるが，Be骨肉腫では作製までに長期間を要し，発生率も低く，動物として雑系であるこ とが欠点であった。これに比較してハムスター骨肉腫は継代移植が容易であり，扱い易い実験モデ ルといえる。 キーワード 骨肉腫，実験モデル，ハムスター，ベリリウム

1。はじめに

 実験動物を用いて，いろいろな疾患のモデル を作製し，それらの病態を研究したりあるいは 治療実験をおこなうことは，疾患の治療方法を 改善する上で重要なことである。  、  実際の臨床での治療経験を積み重ねてその結 果を利用して治療方法を改良していく方法は多 大の時間を要し，しかも客観的判断が困難なこ ともある。実験モデルはあくまでもモデルであ り，ヒトの疾患と同じということは有りえない。 〒409−38山梨県中巨摩郡玉穂町下河町1110 受理：1988年2月5日 しかし，臨床結果から判定する方法における前 述の欠点を補うものの一つとはなりうる。  整形外科学の領域でも多くの実験モデルが使 用されている。今回，最も悪性度の高い腫瘍で ある骨肉腫の実験モデルについて述べ，さらに， それらのうちで実際にわれわれが使用した家兎 ベリリウム骨肉腫およびハムスター骨肉腫につ いて検討を加えて報告する。 II．骨肉腫実験モデルの種類  実験動物としては犬1），家兎2・3），ラット4渤お よびマウス6∼1G）あるいはハムスター三L12）などが 報告されている（表1）。 また骨肉腫発生別に

慰

動 物 表1代表的な実験骨肉腫をもちいた報告 発生方法       報告年 報挑心 犬 家 兎 家 兎 ハムスター ハムスター ラット ラット マウス マウス マウス マウス マウス 自然発生 VX・2 papillonaの骨内移植 炭酸ベリリウムの局所投与 papovaviruaの脳内接種 上記腫瘍の皮下移植 P32腹腔内投与 Moloney saτcoma virus の接種 自然発生 自然発生 自然発生 自然発生 55Fe投一与 ！977 1977 ！979 1979 1985 1976 1976 Bech−Nieis醗1） Spira2） 福島3＞ 内田11） 門島12＞ 冨田4＞ Friedlender5） 1944       Barrett6） 1969         Albala7） ！976       Nakakuki8） 1976        Urist9） 1977       Laiss幾elo） は，自然発生b・樋）あるいは放射線照射，放射 性同位元素投与4）またはベリリウムなどの化学 薬剤の投与3），10）によって骨肉腫を発生させて実 験をおこなう方法がある。さらにヒトの骨肉腫 細胞を培養してそれを抗胸腺血清処理マウスま たはヌードマウスに移植して継代維持する方法 も挙げられる13）。  また，病理組織学的には骨肉腫ではないが， VX−2腫瘍細胞を家兎の大腿骨内に注入して腫 瘍を骨内に増殖させ，悪性骨腫肉のモデルとし ての実験もおこなわれた2）。 m．われわれが使用した骨肉腫実験    モデルについて  1955年以来1979年までわれわれはヒトの骨肉 腫に類似した骨肉腫の実験モデルとして，ベリ リウムを家兎の大腿骨骨髄内に投与して骨肉腫 （以下，ベリリウム骨肉腫と称する。）を発生さ せ種々の治療実験をおこなった。そして，1979 年以降はpapovavirusをハムスターに投与して 発生した骨肉腫（以下，ハムスター骨肉腫と称 する。）について検討を加えてきた12＞。以下，こ れらの詳細について述べる。 A）ベリリウム骨肉腫  1． 作製方法  a．使用実験動物  体重約2kgの幼若白色雑種家兎を用いた。  b．ベリリウムの投与方法  炭酸ベリリウム（BeCO3）を使用した。家兎 の大腿外側部を剃毛し，消毒後経皮的に大腿骨 骨幹部または末梢中間二部の骨皮質に三ツ目錐 または骨髄穿刺器を用いて穴を穿ち，2％炭酸 ベリリウム加生理的食塩水懸濁液を約0．5mZ ずつ週！回，計30回投与する。すなわち30週で 総量0．3gの炭酸ベリリウムを注入することに なる。なお炭酸ベリリウムは非水溶性であるた め，乳鉢内でできるかぎり粉砕し，懸濁液とす る。これを可能なかぎり骨髄内に注入するのだ が骨外にもれることもしばしばであった。  2．炭酸ベリリウムの注入による骨肉腫の発   生頻度  炭酸ベリリウム注入開始後，毎月大腿骨のX 線撮影を行ない骨肉腫の発生を検索した○  総計！73羽の家兎について骨肉腫の発生率を 確認したところ，注入中の30週の間に，173羽 中！22羽（70．5％）は腫瘍の発生をみないで死亡 した。そして炭酸ベリリウム注入終了後も生存 しつづけたのは51羽（29．5％）のみであった。こ のうち，32羽に骨肉腫の発生を確認した。すな わち炭酸ベリリウムを注入した家兎全体として は18．5％，また炭酸ベリリウム注入後も生存 しつづけた家兎について62．7％に骨肉腫の発 生をみたことになる。

ヒト骨肉腫の実験モデルとしてのベリリウム骨肉腫とハムスター骨肉腫について 41  3．骨肉腫の発生時期（図1）  前述のように家兎32羽にX願所見上骨肉腫の 発生をみたが，4羽（12．5％）が炭酸ベリリウ ム注入開始後10ヵ月以内，17羽（53．1％）が10 から15ヵ月，8羽（25．0％）が16から20ヵ月， 3羽（9．4％）が20ヵ月以上経過してから発生 した。骨肉腫の平均発生時期は炭酸ベリリウム 注入開始後14ヵ月であった。  4，ベリリウム骨肉腫のX線所見（図2）  腫瘍部はX線所見上，石灰化あるいは骨化を 思わせる所見で，骨膜反応を伴うこともありヒ トの骨肉腫に極めて類似している。          17羽 4羽 8羽 3羽 注入後 一10ヵ月 10∼15ヵ月 16∼20ヵ月 20ヵ月∼ 図1 BeCO3注入による骨肉腫発生の時期（総    計32羽） 5． ベリリウム骨肉腫の病理組織学的所見  （図3） 腫瘍細胞による旺盛な骨形成あるいは類骨の

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譜 ”隊．  腫瘍部はX線所見上，石灰化あるいは骨化を 思わせる所見で，骨膜反応を伴とこともある。 矢印は骨膜反応を示す。 図2 ベリウム骨肉腫のSoftex X線所見（大腿    骨部）   腫瘍細胞による旺盛な骨形成あるいは類骨の形成をみとめる 図3 ベリリウム骨肉腫の病理組織学的所見（H：＆E染色 ×100）

形成があり，ヒトの骨肉腫に極めて類似してい る。  6． ベリリウム骨肉腫の遠隔転移（図4）  家兎のベリリウム骨肉腫は，血行性に転移す る。骨肉腫が発生した家兎のうち剖検しえた26 羽について転移部位を検索したが，肺転移は26 羽中26羽（100％），肝転移は6羽（23．1％），腎 転移は4羽（14．5％），脾転移は3羽（11．5％）， 心臓転移は2羽（7．7％）であった。なお，リン パ節への転移は認められなかった。 B）ハムスター骨肉腫  1． ハムスター骨肉腫の作製と維持方法  Uchida11）により1979年に， papovavirusで あるBKウイルスを出生直後のハムスターの 脳内に接種して発生させた骨肉腫をハムスター の背部皮下に継代移植し維持しているものであ る12）。なおBKウイルスは1971年Gardnerに よって発見されたウイルスで，ヒトでは乳幼児 肺 肝 腎 卑 直 心 リンパ節 エ00％ 23．1％ 期に大部分が感染し，ほとんど目立った症状を 起さないとされている。  維持方法としてはハムスターの背部皮下で増 殖した骨肉腫を無−菌的に摘出し，腫瘍塊を細切 して約1mm角の大きさとする。その4∼6個 をトロカールを用いてハムスターの背部皮下へ 移植して継代維持する。なお原則として骨肉腫 の移植には，4週齢の雄のハムスターを用いて きた。  2．ハムスター骨肉腫の背部皮下生着率と発   育速度（図5）  移植2週ころより表面から腫瘤を触知するこ とが可能となり，ほぼ10週まで腫瘍は増殖を続 けた。移植成功率は約95回転あった。  3． ハムスター骨肉腫の遠隔転移発生頻度  X線所見上，腫瘍移植5週ころより肺転移が 確認され，その出現率は約70％であった。肺 以外の臓器への転移は心臓に一回のみ確認した のみで極めて稀であった。  4． ハムスター骨肉腫のX線所見（図6）  腫瘍部はX線透過性が減少し石灰化あるいは 骨化を思わせる所見である。 15．4％ 11．5％ 7。7％ 0％ 図4ベリリウム骨肉腫の他臓器への転移率

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123456789101112

       週    骨肉腫移植後の腫瘍径の変化 図5 ハムスター骨肉腫の発育遠度  腫瘍部はX線透過性が減少し，石灰化あるいは 骨化を思わせる所見である。   図6 ハムスター骨耕腫のX線所見

ヒト骨肉腫の実験モデルとしてのベリリウム骨肉腫とハムスター骨肉腫について 43

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  悪性の腫瘍細胞による活発な類骨形成や骨形成がみられる 図7 ハムスター骨肉腫の病理組織学的所見（H＆E染色 ×200） oo

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図8ハムスター血清ALP値の変動  5． ハムスター骨肉腫の病理組織学的所見   （図7）  悪性の腫瘍細胞による活発な類骨形成や骨形 成がみられ，典型的なヒトの骨肉腫に極めて類 似している。  アルカリホスファターゼ（以下，ALPと称 する。）染色では，腫瘍細胞部に一致してALP が陽性となった。  6．ハムスター骨肉腫における血清ALPお   よびALPアイソザイムの変動  正常ハムスターのALP値は生後6∼10週で 349±45Uであったが，骨肉腫移植後3週より 上昇がみられ，10週で最高値（2，818±872U） となった。（図8）  骨肉腫の増殖によるALPアイソザイムの変 化としては，正常で二峰性のピークがαとβと の間で一峰性となり，熱失活率は56℃5分で

85％以上を示し，骨由来のALPの上昇であ

ることが示唆された。（図9）

IV．考

察 A）骨肉腫治療において実験モデルの果す役割  について：  骨肉腫は整形外科領域では最も悪性度の高い 腫瘍であり，原発性骨悪性腫瘍のなかでは最も

正 常 骨肉腫 移植後4週 骨肉腫 移植後8週 α1 α2 β 図9 ハムスター血清ALPアイソザイム分爾像 頻度が高く，日本整形外科学会による全国骨腫 瘍患者登録一覧表によると，昭和47年より60年 までの14年間に続発性骨腫瘍も含めた骨腫瘍 の全登録例27，241例中1，612例が報告されてい る14）。骨肉腫が腫瘍として悪性度が高いのは， 容易に肺転移しやすいためであり，発症してか ら2年以内に肺転移が明らかになる例が多く， 1965年以前には，外科的切断術が唯一の治療方 法であったが，当時の骨肉腫患者の5年生存率 はわずか0∼20％程度のものであった。その後 放射線療法あるいは化学療法の進歩および診断 技術，手術方法の発展がつづき，最近では5年 生存率が50％以上になったとする報告も出て きている15）。しかし，依然治療成績は不満足で あり，種々の治療方法が摸索され試みられてき ている。骨肉腫の実際の治療を行なうにあたっ ては，臨床例の結果を詳細に反省し，新たな治 療を検討していかなければならない。しかし， 臨床上のみでは統計処理などを行なうためには 減数に制限があり，客観的判定を行なうのに困 難である。そのため一定の骨肉腫の状況をつく りだしたり，各種の治療方法の優劣を判定する のには条件を揃えやすい骨肉腫の実験モデルが 必要となる。また骨肉腫治療上の大きな問題で ある肺転移形成の機序あるいは骨形成機序の解 明にヒトの骨肉腫に性格の類似した実験モデル は有効な研究手段となる。以上の諸事実よりヒ トの骨肉腫に似ている動物の骨肉腫モデルの開 発が急務とされている。 B）骨肉腫実験モデルの種類について  文献上では犬，ラット マウスおよびハムス ターの骨肉腫が報告されている（表！）。  実験的に骨肉腫を作製したのは1929年Lacas− sagerが放射照射により家兎に骨肉腫を発生さ せたのが最初とされている。また，自然発生 の骨肉腫の記録としては1944年にBa∫rett6）が C3Hマウスに発生した骨肉腫の報告以降散見 されている。それらのうちで代表的な実験モデ ルとしては表1のものがある。一般に実験動物 を用いて実験をする場合，薬剤の動脈内投与，あ るいは局所の放射線照射などの細かい手技を要 するとき，動物としては犬あるいは家兎のよう な比較的大きい動物がよいが飼育に手間がかか るなど欠点があり，多数を実験に使用するのは 困難である。またマウス程度の小動物では飼育 が容易であり，多数を準備することは可能であ るが細かい操作は手技上不正確となるおそれが ある。そのため実験の目的にあわせて実験動物 を選ぶ必要がある。  実験動物において骨肉腫が自然発生すること はまれであり，犬についての報告例としては， ！977年Bech−Nielsen1＞が11匹の自然発生骨肉腫 を使用してBCGの骨肉腫に対する影響をみて いることのほかはほとんどがマウスにおける自 然発生である。人工的に作製された骨肉腫はウ ィルスによるもの以外は作製に長期間を要する

ヒト骨肉腫の実験モデルとしてのべリりウム骨肉腫とハムスター骨肉腫について 45 場合が多い。われおれのベリリウム家兎骨肉 腫ではベリリウム注入開始より平均14ヵ月を要 し，冨田4）のラットにおけるP32誘発骨肉腫で も投与開始後平均32週後あるいは平均43週後で あり発生率もそれぞれ52，9％，55．5％であっ た。Laissue王。）によるマウスの55Fe誘発骨肉腫 例でも，300日以上生存した14匹中6匹（42．9 ％）に発生をみたと報告している。ヒトの骨肉 腫を培養してヌードマウスあるいは抗胸腺血 清処理マウスに移植して抗癌剤の骨肉腫に対す る感受性テストに利用する研究も積極的であ る13）。しかし，免疫力の低下している動物を用 いるため飼育に特別の施設が必要なことやもと もと正確な状態の動物でないことなどが問題と なる。 C）ベリリウム家兎骨肉腫とハムスター骨肉腫  について  ベリリウム家兎骨肉腫は炭酸ベリリウムによ って誘発した骨肉腫3）であり，ハムスター骨肉 腫はpapovavirusによって誘発した骨肉腫12）を 継代移植しているものであるが，両者とも腫瘍 の病理組織所見はきわめてヒトの骨肉腫に類似 し高頻度に肺転移がおこる点も似ている。これ らは実験骨肉腫としては好ましい条件を備え ているといえる。しかし，前述のごとくベリリ ウム骨肉腫では作製までに長期間を要し，発生 率もベリリウムを注入した家兎の18．5％と低 く，家兎自体が雑筆であることが欠点であっ た。これに比較してハムスター骨肉腫は継代移 植が容易であり，移植した骨肉腫は10週程度ま で安定した増殖を続けるので家兎に比べて扱い やすい。しかし，動物としての大きさが家兎よ りも小さく細かい操作が行ないにくいことが欠 点となる。 D）今後の骨肉腫実験モデルの問題  動物実験は医学の研究におけるもっとも重要 な手段の一つであり，医学の進歩上必要不可欠 である。しかしながら，動物福祉の観点からみ て，不必要な動物実験，科学的に適切でない実 験，あるいは動物に対して配慮の欠ける実験は 行なうべきでない16）。骨肉腫の実験モデルにつ いても同様の観点でみなければならない。すな わち，臨床に還元できる研究を行なうためには 実際のヒトの骨肉腫に性質が近ければ近いほど 適切で最小の犠牲で有益な結果が得られ，あま りにも性質のかけ離れている実験動物系では無 駄な実験になってしまう。したがって，常に最 適の骨肉腫実験モデルを開発していくことが必 要である。現時点におけるわれわれのハムスタ ー骨肉腫は病理組織学的所見，遠隔転移形式が ヒトの骨肉腫に極めて類似していること，そし て動物が扱いやすいことから最適の骨肉腫実験 モデルといえる。このハムスター骨肉腫より高 湿転移の系あるいは低肺転移の系を新たに開発 することにより，骨肉腫の肺転移の機序が解明 され，肺転移の予防法ひいては治療方法が確立 する可能性もある。また，骨をつくるという骨 肉腫独特の性質を利用して，骨形成および骨吸 収の機序の解明に役立つことも期待される。 V．ま と め  現在までの主な骨肉腫実験について概説する とともに，われわれが実際に作製あるいは維持 しているベリリウム家兎骨肉腫およびハムスタ ー骨肉腫についてのべた。 ︶ 蓋 9価 ︶ 3 ︶ 4 μひ 文 献 君ech−Nidscn s， Rr・dey Rs， Fldler IJαα∼・ The effec￡of：BCG onノη漉γo immlme re− activity alld clinical coursc 量n dogs treatcd surgically for osteosarcoma・ EuroP J cancer 茎977； 13： 33−41． Spira￡， Bamea A， Trillin Z 8∠α∼． An cx− perimcntal mo（lel of malignant bone tumor・ 1鯉mati・na茎Orth・pacdics（S豆COT）1977；1： 16−18． 福島 博，伊丹康人，赤松功ほか、ベリリウム による家兎骨肉腫．整形．災害外科董989；22： 629−634． 冨田幸八郎．P32による実験骨腫瘍の生成．日 大医｝誌 茎972； 32： 534−543． Friedlαxler G￡an〔｛Mitchell MS A virallv       ノ_{induced osteosarcoma in ra宅s（a mode蓋foy} immしmO10giCal Stこid圭eS Of hUman OSεeOSar− coma）。 J 80ne Joint surg玉976；58rA：29ξ∼一302．

︶ 6 ︶ 7 ︶ 8 ︶ 9 10） 分arrett MK， Dalton AJ， Edwards J氾8‘αム A transplantable osteogenic sarcoma o・rigina￡ing in a c3H mouse． J Natl cancer Inst 1944； 4： 389−402． Albala MM and￡sparza AR． Transpla欝table Gsteogen童。 sarcolna i駐 illbred AKR mice。 Cancer】Rしesearch l969；29： 1519−1522． Nakakuki K， Shimokawa K， Yamauchi H 8‘認． Asponta！｝eoas transpla捻tab王e osteogenic sa1㌔ coma h〕AKR／Ms mice． Gam｝1976；67：513− 521， Urist MR， Na．kata N， Felser JM 6‘αム A獄 osteosarcom盆cell盆厩l matrix retai登ed mor− phogen forτ嚢ormal bone formadon． Clinlc盆1 0rthopacdics l977； 124：251−266。 Laissue JA， Rurlington H， crα儀kite EP 8齪ど． Inducti・n・ξ・ste・sarc・mas and he撮at・P・iet− ic neoplasms by 55Fe in． mice・C技ncer Researcl・ 1977；37：3545−3550． ll＞ 12） 13） 14） 15） 16） Uchida S， Watanabe S， Aizawa T 6‘α♂． Polv一       ノ OnCOgeneCity an（l inSUIinOma−lndUChlg abilit》・ of BK vims， a human papovavirus， in syriall golden hamste｝二s・ JNc1 1979；63： 119−126． 福島 博，横山 巌，赤松功也，関欝守正．腫 瘍切除によるハムスター骨肉腫のアルカリホス ファターゼ値の変動．医学のあゆみ1985；134： 347−348 Manabe S， Takasc B and Yamazaki Y Hαero− tr撮1splantation of cultured human bolle tu㎜or cell Iines． J Jap orthop Ass l977；5豆： 27−36． 日本整形外科学会骨軟部腫瘍委員会．全国骨腫 瘍患者登録一覧表（昭和60年度）。東京，園立 がんセンター，1985． 浜田良機，赤松功也，福島 博，骨肉腫に対する ：放射線療法．整形外科Moo鳳983；26：118−125、 1ヨ本実験動物学会．動物実験に関する指針． Exp Anim 墨987；36：285−288． 君eryllium Osteos績rco㎜謎and Hamster Os重eosarco㎜a￡or     Exper韮mental Models of Huma職Os￡eosarco㎜a       H．iroslli Rヨkushin｝a an（藁Noriya Akam蹴su Dψ6舶η副。／0γ〃∼oρα6砒5，yωηαηα517∫M8砒α♂Co〃698    Wc examined two khコds of animal ostcosal℃oma。 One is the r批bbit osteos盆rcoma｝nduced by bone marrow injection o￡b￠ryllium carbo1｝ydmte and the other is hamster osteos捷rcom縦， which was originally in（luce（l by papovavirus injection， maintained by subcutaneous￡ra1玉spla11・ tation of tumor mass・The char翫cte1’istics of these osteosarcomas are vαy similar to those of human osteosarco恥a。 Injection of berylllum carbohy（h’ate was carried ou皇on 173 rab｝）its． The osteosarcomas were formed in 32σ8．5％）rabbits， and the meaJ｝time of ocαlrrence was至4months a釜ter the beghmi！、g the beryl玉ium inlectio！、s・Ltmg metastasis aPPe欲e（1 to all mbbits with osteo− sarcoma． The su｝）cuta貧eous trallspla∼質aεioll o蓋hamster osteosarcom批was sロccessぞuh翻95％of all盆11imals． T．he frequency of lung met歌stasis was bout 70％、Ve condude that experimental ・s宅cos盆rco用a using hamste雲’s was m・re successive釜uhhan tこsin9童abbits・ Key w・rdS：・S芝e・SaTC・ma， eXperimeBtal m・（lel， hamStα， ber》・11iUm