博士（医学）杉木博幸 学位論文題名
PDGF 受 容 体 に 対 す る ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ を 用 い た 血 管 平 滑 筋 細 胞 増 殖抑 制
学 位 論 文 内 容 の 要旨
【緒 言 】 経皮 的 冠 動脈 形 成術(PTCA)は， 冠 動脈 バイ パス術に 比ベ侵襲 が少 なく，ま た反復し て施行可 能なこと から，狭 心症や心 筋梗塞に対 する有カな 治療 法 と して 定 着 しつ っ ある ． し かし ，PTCA後の 冠動脈再 狭窄は， 約半数 近く の 症 例で 認 め られ ， 虚血 性 心 疾患 の 治療 にPTCAを用い る上で最 大の問 題点とな っている ．prl℃A後再 狭窄の機 序として は，バル ーンによる血管内 皮の機械 的損傷に 伴う血栓 形成，そ れに引き 続く中膜 平滑筋細胞 の内膜への 遊走 ・ 増 殖が 主 体 と考 え られ て お り， こ の過 程 にはPDGFを はじめと してい くっかの 増殖因子 やサイト カインの 関与が推 定されて いる．、こ の様なPTCA 後再狭窄 を防止す る目的で ，現在ま でに様々 な薬物が 検討されて きたが，充 分な効果 は得られ ていない ．
近年，血 管平滑筋 細胞に外 来性遺伝 子を強制 的に発現 させたり， 内在性遺伝 子の 発 現 を抑 制 す るこ と によ り ，PTCA後再 狭 窄を 制御しよ うとする 遺伝子 治 療 の 可 能 性 が 検 討 さ れ て い る ． 本研 究 で は，PDGF 受容 体mRNAに 対す るAntisense oligonucleotideを用い て血管平滑筋細胞の増殖抑制を試みた．
【方法】1． Antisenseoligonucleotideの合成
ラ ッ トPDGFa受容 体mRNAに対 す る3種 類のphosphorothioate antisense oligonucleotide（AS―No.1〜‑ No.3）を合成し，AS−No.2，No.3に対応するsense oligonucleotide（Sense‑No.2，No.3）を対照とした．
2． ASによるDNA合成抑制の検討
培養ラット胸部大動脈血管平滑筋細胞（Al0細胞）を24 well plateで4，OOO cells／cm2となるまで10% fatal bovine serum（FBS）で培養した．24時間同調 培 養 し た 後 ，AS 0‑‑1〃M存 在 下 に1〜4日 間 培 養 し ， そ の 後3% FBS又 は
PDGF−AA，‑AB，‑BB（10ng／ml）で24時間刺激 した．増 殖因子に よるDNA合 成 の 程 度 は ， 3H− thymidineの 取 込 み に よ り 定 量 し た ． 3． PDGFa，p受 容体mRNAの 発現 量 の 検討
Al0細 胞 カ、 ら 抽出 し たtotal RNAから ，RTーPCR法 によ り ，ラ ッ トPDGF ロ 及 び ロ受 容 体 部分cDNAを 増幅 ・ 精 製し ，Northem blot法の 標識プロ ーブ を 作 成 した ． Northern blot法 でAl0細胞 に おけ るPDGFロ ，メ受容 体mRNA の 発 現 量 を 検 討 し た ． ま たASが 受 容 体mRNAの 発現 量 に与 え る 影響 は ， 定 量 的RT−PCR法で 検 討し た ．
【 結 果 】 1． ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ （AS） に よ るDNA合 成 抑 制 の 検 討 3種 類 のASlルMをAl0細 胞 に3日 間 作 用 さ せ た と こ ろ ，AS‑No.3はPDGF― AB刺 激に よ るDNA合 成 をコ ン トロール に比べ有 意に低下 させた（pくO.Ol）・
ま たAS‑No.3 1/iMを3日 聞AIO細 胞 に 作 用 さ せ る と ，3％FBSお よ ぴPDGF‑
AB， −BB刺 激に よ るDNA合 成 を有 意 に 抑制 し た（ コ ン トロ ール群 に比較し，
それ ぞ れ51%，44%，49％） ． ま たSense‑No.2にはDNA合 成抑制 効果は認 めな かった．異 なる濃度 のAS―No.3（0.25，0.5，l冖M）は3ワ。FBS及びPDGF‑AB，
−BB刺 激 に よ るDNA合 成 を ， 用 量 依 存 性 に 抑 制 した ．ASと の 培養 時 間 を変 化 さ せ て 検 討 し た 結 果 ，AS‑No.3は 血 清 刺 激 によ るDNA合 成 を2日 で35 010 抑 制 し ， 以 後4日 目 ま で同 様 の 抑制 を 示し た ． 以上 よ りAS−No.3は，A10細 胞 のDNA合 成 を 用 量 依 存 性 に 抑 制 し ， そ の 効 果 発 現は48時 間 以 内に 最 大と なることが 示唆され た．
2． PDGF口，p受容 体mRNAの発現 の検討
Northem blot法 で 検 討 し た 結 果 ，Al0細 胞 で はPDGFp受 容 体mRNAの 発 現 を 認 め た が ， PDGFa受 容 体mRNAの 発 現 は 同 定 さ れ な か っ た ． ま た ， AS−No.3，Sense−No.3（1メM)はPDGFp受 容 体mRNAの 発 現 に 影 響 を 与 え な か っ た ．RT−PCR法 に よ る 検 討 で は ，AS−No.3（1ルM） はPDGF＆ 受容 体 mRNAの 発 現 を 低 下 さ せ た が ，Sense‐No． 3で は 変 化 が な か っ た ．
【 考察 】 近年 ，PTCA後 再狭 窄 を防 止 す る目 的で ，アンチセ ンス遺伝 子の血 管平滑 筋細胞へ の導入が試 みられる 様になっ た．現在 までに，細胞周期関連 遺伝子ではproliferating cell nuclear antigen（PCNA），cdc2やcdk2kinase， oncogeneではcーmybやc‑myc遺 伝子 等 のmRNAに 対 す るア ン チセ ン ス 遺伝 子 につい て検討さ れており， いずれも 平滑筋細 胞に導入 することにより増殖抑 制効果 を有する 事が報告さ れている ．しかし 細胞周期 関連遺伝子はすべての
―355―
増殖細胞で普遍的に発現することから，その発現を抑制するアンチセンス遺 伝子を用いた場合，分裂細胞の豊富な他の臓器・組織への影響が懸念され，
実際の臨床応用には問題が多い′と思われる．本研究では，PDGFロ受容体 mRNAに 対す るASを 用い て ，主 要 な増 殖 因 子で あ るPDGFに由来 する増殖 シグナルの抑制を試みた． PDGF 受容体は各細胞種によりその発現の程度 が異なることから，同受容体をASの標的とすることで臓器選択性を高める ことが可能である．
血小板 由来増殖因 子PDGFは分子量約3万のA鎖とB鎖の2本のpolypeptide のdimerからなる蛋白質で，PDGF‑AA，―AB，―BBの3つのisoformが存在する．
一 方，PDGF受 容体 にはロ ，pの2つのsubtypeが存在し，PDGFと結合した 後dimerを形成する ．PDGF―A鎖 はa受容 体と特異的 に結合し，B鎖はa，p 両受容 体に対して 親和性を有 する．本研 究で検討し たPDGF 受容体mRNA に対す るASは，平滑 筋でのd受容体の発現を抑制することで，動脈硬化巣 において発現の亢進したPDGF‑A鎖の細胞増殖促進作用をより効果的に抑制 することが期待される・
本研究 で検討を加 えたAS‑No.3は，3%FBS，PDGF‑AB．‑BB刺激によるDNA 合成をl冖Mまでの濃 度で用量依 存性に抑制 した．受容 体mRNAの発現の検 討 では ，AS‑No.3は 受 容体mRNAの 発現 を 低下 さ せたが，p受容体mRNA の 発現 に は変 化 がな かった．セ ンスオリゴ はDNA合成 ，及び受容 体mRNA の発現 に影響を与 えなかった ．この事か ら，AS‑No.3は 標的であるPDGFd 受 容体mRNAの 発現 を 配列 特 異的 に 低下 さ せ， そ の結果AlO細胞のDNA合 成を抑 制する事が 示唆された．ASによるDNA合成抑制の時間依存性を検討 した結 果，血清刺 激の場合，AS添加2日 目において35ワ。のDNA合成抑制 が認められ，以後4日目まで同程度の抑制効果が観察された．AS遺伝子は，
PDGF受容体のdenovo合成を抑制するが，すでに発現している受容体に対し ては抑制効果を持たず，ASの効果発現には受容体蛋白の代謝回転を待たなく てはならない．この実験結果から，細胞膜に存在するPDGF受容体の代謝分 解には48．時間は必要である事が示された．したがって本研究で検討を加えた ASをinvivoで応用 する際には ，短期間でPDGFの作用を抑 制するような受 容体阻害剤との併用が必要となると思われる．
本研究において，PDGFロ受容体に対するアンチセンスオリゴを用いるこ とで， 血管平滑筋 細胞のDNA合成を著明に抑制し得た．今後，最適な塩基 配列の決定や，動物モデルを用いたinvivoでの検討が必要であるが，PTCA 後 の 再 狭 窄 の 予 防 に 本 法 が 有 用 で あ る 可 能 性 が 強 く 示 唆 さ れ た ．
