博士（農学）森 春英 学位論文題名
インゲンマメ (Phaseolus vulgarisL ． CV ．Toramame) Q −ア ミラ L ゼの機 能と発現 に関す る分子機構
学 位論文内容の要旨
a―アミラーゼ（EC3．2．1．1，1，4‑a‑D―glucan glucanohydrolase)は、デンプン加水分解 酵素の最も主要な酵素のーつであり、多糖またはオリゴ糖のa―1，4−グルコシド結合をエン ド様式に加水分解しa‐アノマーの生成物を生じさせる。微生物から動物、植物、昆虫に至 るまで生物界に広く存在し、酵素化学的にあるいはまた遺伝子発現など、幅広く研究され ている。近年a―アミラーゼの三次構造の解析が進み、（8/a）8バレル構造をとること、一次 配列 上に 保存 され る4っの機能領域を持ち、ここに活性部位を形成するアミノ酸残基が含 まれ るこ とが 明ら かにされた。これらの保存領域は、ブルラナーゼ、a−グルコシダーゼ
（ファミリー1）、枝作り酵素、CGTaseなどにも認められる。これらの酵素はa−アミラー ゼファミリーを形成し、いずれも類似した構造および反応機構をとると考えられている。
本 研 究 で は 、 こ のa− ア ミ ラ ー ゼ に つ い て イ ン ゲ ン マ メ の 一 種 で あ る ト ラ マ メ
（Pbaseolus vulgarisL．cv. Toramame）を材料として、機能及び発現について検討した。
Q−アミラーゼは植物において主要な炭素源であるデンプン粒を分解できる唯一の酵素であ り、単子葉植物種子の発芽における。−アミラーゼの発現制御は特に古くから調べられてき た。 イネ 、オ オム ギなどの単子葉植物においてaーアミラーゼは多くのアイソザイムを有 し、その多くはジベレリンにより、一部は糖飢餓により発現誘導される。ジベレリンや糖 に応答するプロモーターのシス領域も同定されている。これに対し、双子葉植物において これらの研究は十分に行なわれておらず、アイソザイムの有無についてさえ明らかではな い。
本研究は、双子藁植物におけるaーアミラーゼの機能と発現機構を明らかにすることを目 的としてなされた。
1．発芽種子に発現するn‐アミラーゼの酵素化学的性質と構造
ト ラマ メを 暗所 で6日 間発 芽さ せた 幼苗 より 子葉 を収 穫し 、これ を材 科と して精製を 行った。子葉100gより、硫安分画（30‑70X飽和画分）、。−サイク口デキストリンカラム によるアフィニティークロマトグラフィーおよびBio‐Gel P‑100を用いたゲルろ過によっ て、比活性90.1 U/mgの。‐アミラーゼ標品、613U、6．8mgを精製した。精製倍率819倍、活性 の回収率31. 4:Cであった。本酵素は、分子量46，000のモノマーで、糖含量1．25'X (mannose換 ー253―
算 ） 、至 適pHは6．O、pH5.5‐7．0に おいて 安定で ある。温 度安定 性は、15分 問の処 理で40℃ ま で で あ る が 、5mM酢 酸 カ ル シ ウ ム の 存 在 下 で は 、70℃ 、15分処 理 ま で 安定 で あ った 。 こ れ ら の 一 般 的 性 質 は 、 他 の 植 物a‐ ア ミ ラ ー ゼ の 示 す 性 質 に よ く 一 致 し た 。Maltoseか ら maltoactaaseま で の 一 連 の マル ト オ リゴ 糖 に 対す る 速 度定 数 か ら 、本 酵 素 のサ ブ サ イト 数 は8、 切 断 部 位 は サ ブ サ イ ト6およ び7の間 と 推 定し た 。 これ は 、 液化 型d‐ アミ ラ ー ゼの 示 す サ ブサ イ 卜 構造 に 類 似 し、 特 に オオ ム ギa‐ ア ミ ラー ゼ で 推定 さ れ たサ ブ サ イ ト構 造 の サ ブサイト1から8までによく類似した。
次に 、 ト ラマ メ 。 ‑ア ミ ラ ーゼ の 一 次構 造 を 明ら か に した 。 常法 に従い、 部分アミ ノ酸配 列 を 解 析 し そ の 情 報 か らcDNAを ク ロ ー ニ ン グ し た 。 予 想 さ れ る ア ミ ノ 酸 配 列 は ヤ エ ナ リ
（Vigna radiata） 由来a− アミ ラ ー ゼの ア ミ ノ酸 配 列 に94:t、イ ネなど植 物由来 のものに 約 60:C、 そ の 他 動 物 、 微 生 物 、 昆 虫 由 来 の も の に は10−22x程 度 の 相 同 性 を 示 し た 。 Taka−amylaseA（TAA)と は13:r;と 相 同性 は 低 いも の で あ った が 、 推定 二 次 構造 が 概 ね一 致 し、また触媒基を提供するアミノ酸残基D178 (TAA，D206），E203 (TAA，E230），D285 (TAA．D297） お よ び 切 断 部 位 周 辺 の サ ブ サ イ トを 形 成 する ア ミ ノ酸 残 基 が保 存 さ れて い る こ とか ら 、 本 酵 素 もま たTAAと 同 様 （8/a）8パ レ ル構 造 を とる と 推 定さ れ た 。し か し 、 トラ マ メ 酵素 は 、 TAAに お け る （S/a）8バ レ ル 構 造 からC末 端ド メ イ ンに か け て連 結 領 域 を含 む 相 当領 域 を 一 次配列上で大きく欠損するものであった。
2．トラマメ植物体におけるa−アミラーゼの発現
植物 体 に おけ るa− アミ ラ ー ゼの 発 現 を調 べ た 。ま ず 、 他の 器 官 に比 べ て 圧 倒的 に 大 量に 発 現 す る 子 葉 ， に お い て 、a− アミ ラ ー ゼが 発 芽 に際 し てde novo合 成 され る こ とを 確 認 し た 。 重 水 素 に よ る 密 度 標 識 法 、 ウエ ス タ ンお よ び ノザ ン ブ ロッ テ ィ ング 解 析 、 いず れ の 結 果 も 発 芽 後 に 合 成 さ れ る こ と を 示し 、 発 芽種 子 の 子葉 に お いて 転 写 レベ ル で 発 現制 御 が な さ れ て い る こ と が 明 ら か に な っ た。 発 芽 子葉 に 比 ベ微 量 で はあ る が 緑葉 、 登 熱 中期 か ら 後 期 に か け て の 種 子 に もQ− ア ミ ラー ゼ が 発現 す る こと を 示 した 。 こ れら の 解 析 にはa− アミ ラ ー ゼ 以 外 の デ ン プ ン 分 解 活 性 と区 別 す る必 要 が あり 、 電 気泳 動 後 活性 染 色 に より 半 定 量 す る 方法 を 用 いた 。 。 − アミ ラ ー ゼが 示 す 熱安 定 性 、基 質 特 異性 、生成 物特異性 の特徴 から 活 性 バン ド を 示す 活 性 を8‐ ア ミ ラー ゼ な どと 区 別 して 特 定 でき た 乙 いず れ の 器 官に 発 現 す るaーア ミ ラ ーゼ も 電 気 泳動 に お いて 同 じ 易動 度 を 示し た 。 各器 官 で の発 現 を ノ ザン ブ ロ ッ テ ィ ング 解 析 した 結 果 、 根、 茎 に おい て もa− ア ミ ラー ゼ が 発現 し て いる こ と を 確認 し た 。 緑藁 か らa‐ ア ミ ラ ーゼ を 単 離精 製 し 一般 的 性 質と 共 に 、構 造 解 析を 行 っ た 。ト ラ マ メ緑 葉5kgよ り 比活 性10 4U/mgを 示 す精 製 酵素0．27mgを 得た。本 精製は 精製倍率80，000倍、回収 率3Xで あ っ た 。 精 製 酵 素 の 示 す一 般 的 性質 、 部 分ア ミ ノ 酸配 列 お よび ぺ プ チ ドマ ッ プ は、
い ず れ も 緑 葉 由 来 の 酵 素 が 発 芽 子葉 の も のと 同 じ であ る こ とを 示 し た。 転 写 産 物の 解 析 も 行 っ た。 非 翻 訳領 域 の 配 列を3 RACEによ り 増 幅し 解 析 した 。 そ の結 果 は 発 芽子 葉 と 同一 遺 伝 子 産 物 で あ る こ と を 示 し た が 、 ポ リAサ イ ト の 異 な る い くっ か の 配列 を 得 た 。こ れ の 意 味 す ると こ ろ は明 ら か で はな い 。 また 、 緑 葉に 発 現 するa‐ アミ ラ ー ゼの 生 理 的 意義 も 明 確 ではない。
3.a―アミラーゼ遺伝子の単離と構造
サザンブロッティング解析の結果から、前項の結果と合わせて、本植物体においてaーア ミ ラ― ゼはハブロイドあたり1コピーの遺伝子にのみコードされ、これと相同な遺伝子は 存在しないと判断された。したがって、アイソザイムは存在しない。このa−アミラーゼ遺 伝子をクローニングし、このうちXbal‑ロincU断片4，587bpの塩基配列を解析した。他の植 物 起源 の。―アミラーゼ遺伝子に保存される同様のスプライスサイトを有し、4エキソン
‑3イン ト口 ンの 構造 をとる こと が明 らかとなった。上流プロモータの配列はブラックグ ラム（ゲigna mungo）由来のものに―502bpまで高い相同性を示した。−1，300bp近f旁にジベレ リン応答に関与するシス因子様配列が複数存在しGARCを形成している可能性を認めた。約 一800bpまでの領域をGUS遺伝子に連結し、これをシロイヌナズナに導入しGUSの発現を組織 化学的に解析した結果、ロゼット葉維管東部および発芽後の子葉において発現が確認され た。これにより、発現に￣必須なシス因子は−800bpまでの領域に存在していることが示され た。
学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
インゲンマメ(Phaseolus vulgarisL ．CV ．Toramame) Q ―アミラーゼの機能と発現に関する分子機構
本 論 文 は 、 和 文171頁 、 図65、 表9、7章 か ら な り 、 他 に 参 考 詒 文14篇 が 付 さ れ て い る 。 a−ア ミラーゼ（EC3．Z．1．1，1，4‑a‐Dーglucan glucanohydrolase)は、デンプ ンなどの多 糖 ま た は オ リ ゴ 糖 のa‑l，4‐ グ ル コ シ ド 結 合 を ェ ン ド 様 式 に 加 水 分 解 し 、 微 生物 から 動植 物 、 昆 虫 ま で 生 物 界 に 広 く 分 布 し て い る 。 植 物 に おい てa― アミ ラー ゼは デン プン 粒を 分解 で き る 唯 一 の 酵 素 で あ り 、 イ ネ 、 オ オ ム ギ な ど の 単 子 葉 植 物 に お い て 数 種 の アイ ソザ イム と し て 存 在 し 、 多 重 遺 伝 子 族 を 形 成 し て い る 。 そ の 多 く は ジ ベ レ リ ン に よ り 発現 誘導 され る 。 こ れ に 対 し 、 双 子 葉 植 物 で は そ の 研 究 は 十 分 に な さ れ て お ら ず 、 ア イ ソ ザイ ムの 有無 さ え明 らか では ない 。
本 研 究 は 、 イ ン ゲ ン マ メ の 一 種 で あ る ト ラ マ メ （Phaseolus vulgarisL．cv. Toramame) を 用 い て 、 双 子 葉 植 物 に お け るn− ア ミ ラ ー ゼ の 構 造、 機能 およ び発 現機 構を 明ら かに する こ と を 意 図 し て な さ れ た も の で あ り 、 研 究 の 結 果 は 以 下 の よ う に 要 約 さ れ る 。
1． 発芽 種子 に発 現す るaー アミ ラー ゼの 酵素 化学 的 性質 と構 造｀
ト ラ マ メ を 暗 所 で6日 間 発 芽 さ せ た 幼 苗 の 子 葉100gよ り 、 比 活 性90.1 U/mgのaー ア ミ ラー ゼ標 品、6． 8mgを 精製 した 。本 酵素 の一 般的 性質 （分 子量46，000、 至適pH)は、一般の 植 物Q− ア ミ ラ ー ゼ の 示 す 性 質 に よ く 一 致 し た。 一連 のマ ルト オリ ゴ 糖の 水解 に関 する 速度 定 数 か ら 、 本 酵 素 の サ ブ サ イ ト 数 は8、 切 断 部 位 は サ ブ サ イ ト6お よ び7の 間 と 推 定 さ れ た 。 こ れ は 、 液 化 型n― ア ミ ラ ー ゼ の 示 す サ ブ サ イ ト 構 造 に 類 似 し て い る 。 次 に 、 部 分 ア ミ ノ 酸 配 列 を 解 析 し 、 そ の 情 報 か らcDNAを ク ロ ー ニ ン グ し た 。 予 想 さ れ る 全 一 次 ア ミ ノ 酸 配 列 は ヤ ェ ナ リ （Vigna radiata） 由 来a− ア ミ ラ ー ゼ のア ミノ 酸配 列に 94%の 相 同 性 を 示 し た 。Taka‑amylase A(TAA)と の 相 同 性 は13?Cな が ら 、 推定 二次 構造 の類 似 、 な ら び に 触 媒 基 や 切 断 部 位 周 辺 の サ ブ サ イ 卜 を 形 成 す る ア ミ ノ 酸 残 基 ，D178 (TAA， D206） ，E203 (TAA，E230）お よびD285（TAA，D297） が保 存さ れて い るこ とか ら、 本酵 素も
‑ 256 ‑
哉
守
哲
誠
葉
間
藤
千
本
内
授
授
授
教
教
教
査
査
査
主
副
副
TAA と類似の三次構造をとると推定された。
2 ．卜ラマメ植物体における ＿アミラーゼの発現
発芽幼苗の子葉における本酵素の発現量は他の器官に比べて圧倒的に多い。a ―アミラー ゼが 発芽 に際 して de novo 合成されることならびに転写レベルで発現制御されていること を、重水素による密度標識法、ウエスタンおよびノザンブロッティング解析により確認し た。この他、緑葉および登熱中期から後期にかけての種子にも微量ではあるがa ‐アミラー ゼが発現することを認めた。いずれも電気泳動的に同一であった。各器官での発現をノザ ンブロッティング解析した結果は、根、茎においてもQ ‐アミラーゼが発現していることを 示した。
このうち緑葉からa ―アミラーゼを単離精製し一般的性質と共に、構造解析を行った。卜 ラマメ緑葉5kg より比活性10 4U/mg を示す精製酵素0 ．27mg を得た。本精製酵素は、精製倍率 80 ，000 倍、回収率3X であった。精製酵素の示す一般的性質、部分アミノ酸配列及びべプチ ドマップは、いずれも緑葉由来の酵素が発芽子葉のものと同じであることを示した。転写 産物を3 RACE による増幅断片から解析し結果は、ポリA サイトに多様性がある以外は発芽 子葉と同一遺伝子産物であることを示した。
3 ．a ‐アミラ―ゼ遺伝子の単離と構造
サ ザン ブロ ッテ ィン グ解析および前項の結果から、本植物体において、a −アミラーゼ は、 ハプ ロイ ドあ たり 1 コピーの遺伝子にのみコードされ、これと相同な遺伝子は存在し ないと判断された。したがって、アイソザイムは存在しない。本a ―アミラーゼ遺伝子をク ローニングし、このうちXbaI‑ ロinCn 断片4 ，587bp の塩基配列を解析した。本遺伝子は他の 植物起源のa ‐アミラーゼ遺伝子に保存されるスプライスサイトを有し、4 エキソン―3 イン ト ロ ン の 構 造 を と るこ と が明 らか とな った 。上 流プ ロモ ータ の配 列は ブラッ クグ ラム
（Vigna mungo) 由来のものに‑502bp まで高い相同性を示した。−1 ，300bp 近傍にジベレリン 応答に関与する3 っのシス因子様配列が存在し、ジベレリン応答複合体GARC を形成してぃヽ る可 能性 を見 出し た。 約‑800bp までの領域をGUS 遺伝子に連結し、これをシロイヌナズナ に導 入し GUS の 発現 を組 織化学的に解析した結果、ロゼット葉維管東部および発芽後の子 葉において発現が確認された。これにより、発現に必須なシス因子は―800bp までの領域に 存在していることが示された。
以上のように本研究は、双子葉植物におけるa ーアミラーゼの発現と遺伝子構造および酵 素の構造と機能について検討を行ったものであり、学術的に貴重な基礎的知見を提供して いる。
よ って 審査 員一 同は 、轟 春英は博士（農学）の学位を受けるに十分な資格を有するも のと認めた。
― ー257ー
