博 士 （ 農 学 ） 関 根 寛 直
学 位 論 文 題 名
コ リ ネ 型 グ ル タ ミ ン 酸 生 産 菌 の エ ネ ル ギ ー 代 謝 変 異 に 関 す る 研 究
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
c・ glutamicumを は じ め と す る 微 生 物 を 利 用 し た ア ミ ノ 酸 な ど の 有 用 物 質 の 発 酵 生 産は 我 が 国 で 始 めら れ た 日 本 が 誇 る 産 業 の ー つ で あ る ． 近 年 ま で に 発 酵 の 改 良 の た め ， 突 然 変 異 の 誘 導 から 遺 伝 子 工 学 的手 法 の 応 用 ま で 様 々 な 菌 株 育 種 が 行 わ れ て き た ． こ れ ら 育 種 の 夕 一 ゲ ッ ト と さ れ た の は 主 に目 的 物 質 固 有 の生 合 成 経 路 で あ っ た ． さ ら な る 発 酵 の 効 率 化 や 新 規 な 発 酵 系 の 構 築 の た め に は こ れ ま で と は異 な る 点 を 夕 一ゲ ッ ト に す る 必 要 性 が あ る ． そ こ で 当 研 究 室 で は 糖 質 を 原 料 と し た 発 酵 の 出 発 経 路 で あ る 解糖 系 を は じ め とす る 生 命 の 根 本 に 関 わ る 中 枢 代 謝 系 ， 特 に エ ネ ル ギ 一 代 謝 系 に 注 目 し た 研 究 を 行 っ て き た ．そ も そ も 解 糖 系も 基 質 レ ベ ル の り ン 酸 化 に よ っ て ´ へ11Pを 生 合 成 す る エ ネ ルギ 一 代 謝 系 で ある ． そ の キ ーエ ン ザ イ ム であ る ピ ル ピ ン 酸 キ ナ ー ゼ はAMPに よ っ て ア ロ ス テ リ ッ ク に 制 御 さ れ て い る こ と が 知 ら れ て い る ． 従 っ て ，ATPの 主 要 な 生 合 成 系 で あ るF1F。 ．ArP慾cへ の ア ブ ロ ー チ に よ っ て ， 解 糖系 を は じ め とす る 中 枢 代 謝に 影 響 を 与 えら れ る 可 能 性 が あ る ． 大 腸 菌 に よ るピ ル ピ ン 酸 生 産を モ デ ル 系 とし た 一 連 の 研究 に よ り ，FユFo． バrP笛eの 欠損 変 異 が 糖 代 謝 や 呼 吸 の 活 性 化 を 引 き 起 こ し ， ピ ル ビ ン 酸 の 生 産 性 向 上 に 結 び っ く こ と を明 ら か に し た ．さ ら に ， Cgん 細mfcUmに お け るFユFo‐ArP笛c活 性 低 下 株 を 用 い た 研 究 で は グ ル タ ミ ン 酸 生 産 性 は失 わ れ た が ， 大腸 菌 同 様 糖 代 謝 と 呼 吸 の 活 性 化 を 認 め ，FユF。 ‐ パrPaScの 変 異 が 代 謝 に 大 き な 影 響 を 与 え る こ と を 示 し た ， こ の よ う な 背 景 に 基 づ き ， 本 論 文 で は エ ネ ル ギ 一 代 謝 変 異 がc．gmmmセ mに お よ ぼ す 影 響 に つ い て さ ら な る 解 析 を 行 う た め に ，FユFo‐ バrP慾c遺 伝 子 の 取 得 ， 解 析 と ， 遺 伝 子 工 学 的 変 異 株 の 作 出 を 行 っ た ． FユFo‐バrPasc遺 伝 子 の ク口 一 二 ン グ と シー ケ ン シ ン グの 結 果 ，c．舶 ぬmぬMmのFlFo‐ バrP盤eの 遺 伝 子 は一 般的なバクテリア様のオベロン構造，ロを汀，B（a冫，E（c），F（b），H（6），イ（み，G（Y），D（p），C（￡）の順に列 ん だ 構 造 （ カ ッ コ 内 は 各 遺 伝 子 が コ ー ド す る サ ブ ュ ニ ッ ト を 示 す ） を と り ， ロ 桝 の 最 初 か ら ロ ァCの 終 わ り ま で の サ イ ズ が7646bpで あ っ た ． 各 サ ブ ユ ニ ッ ト の ア ミ ノ 酸 配 列 を 種 の 近 い 菌 ， そ う で な い 菌 と 比 較 し た 結 果 ， サ プ ュ ニ ッ ト 間 で はc，a，pサ ブ ユ ニ ッ ト が 非 常 に 高 い 相 同 性 を 示 し ，Yサ ブ ュ ニ ッ ト が 比 較 的 高 い 相 同 性 を 示 し た ． ま た こ の4つ の サ ブ ユ ニ ッ ト は 機 能 的 に 保 存 さ れ て い る と 思 わ れ る 領 域 を 多 く 内 存 さ せ て い た ． 得 ら れ た シ ー ケ ン ス デ 一 夕 を 元 に 過 去 に 得 ら れ たCgm鰤 セMmのFlFo‐ パrP齲c活 性 低 下 株で あ るF172−8 株 の 変 異 点 を 解 析 し た と こ ろ ， 一 カ 所 ，Yサ プ ュ ニ ッ ト の273番 目 の ア ミ ノ 酸で あ る セ リ ン がプ ロ リ ン に 変化 し てい た ． ま た ， 復帰 変 異 株R2−1で は この 変 異 点 が さ らに ロ イ シ ン ヘと 変 化 し て いた ．FユF。 ‐パrP盤cの 各サ
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ブュニットの構成においてcサブュニットの割合が非常に高いことから，cサブュニットのみを生成するよ うな転写産物の存在が予想されたが，/一ザンハイプリダイゼーションの結果そのような転写産物はなく，
ロケオペロンの転写産物は全長をカバーする約8 kbの一種類であることが明らかとなった．また，RT‑PCR とプライマーエクステンションにより本オペロンの転写開始点の解明を試みたが正確な位置を決定するには 至らなかった，
クローニングしたDNA断片を用いて予想されるプロモ一夕一から夕一ミネ一夕一までを十分に含むFiF‐ ATPasc全オベロン遺伝子を保持するプラスミドとしてpCS」¥1‑Pを作出し，これを用いてCglutamicumの形 質転換を行った，この形質転換体のATPasc活性は野性株に比ぺ，最大で約2.7倍まで上昇しており，ノー ザ ン ハ イ プ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン の 結 果 ， 転 写 産 物 量 も 明 ら か に 増 加 し て い た ， 得られた形質転換株(FIF‑ATPasc発現上昇株）のグルタミン酸発酵を行い，培養中の撹拌数，培地中の ビオチン濃度の影響にっいて詳細に検討した．形質転換株は野性株に比ベ，生育速度の減少，最大生育量の 増加，酸素要求性，グルタミン酸生産期における菌体あたりの糖消費活性や酸素消費速度の増大などの性質 を示し，グルタミン酸生産期において野性株よりも代謝能カが高いことが示唆された．さらに，溶存酸素濃 度の低い条件では野性株よりもグルタミン酸生産能が低くいが，逆に，十分な溶存酸素濃度のある条件では 野性株よりわずかにグルタミン酸生産能が高くなる傾向にあることも明らかとなった，撹拌数を1200 rpm まで上昇させた場合，野性株は生育阻害を受けたが，形質転換株はそれほど生育の低下を示さなかった．こ の生育阻害は高速の撹拌による物理的ダメージの為とも考えられるが，形質転換株において阻害の程度が小 さいことから，過剰な酸素の影響と考えることもできる．このことからも，形質転換株が酸素利用能カが高 く酸素過剰条件により適していることが示唆される．ビオチン濃度の検討を行った結果，従来の知見通り，
よ ル ビ オ チ ン 量 を 制 限 し た 方 が グ ル タ ミ ン 酸 発 酵 に は 適 し て い る こ と が わ か っ た ． さらに形質転換株のより詳細なエネルギ一代謝特性を調べるため，膜電位，細胞内pH，細胞内ATP量の 測定を行った．膜電位測定の結果，膜電位，ApH双方の指標がともに野性抹に比ぺて大きく，形質転換株 のプロトン駆動カが野性株よりも高く形成されていることが示唆された．さらに細胞内pHの測定の結果か ら，形質転換株のApHが実際に野性株よりも大きいことが明らかとなった．これらの結果から，確かに形 質 転 換 株 は 野 性 株 に 比 べ て 大 き な ブ ロ ト ン 駆 動 カ を 形 成 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た ． 細胞内ATP量の測定の結果，野性株，形質転換株ともに対数増殖初期にATP含量が最大となり，定常期 に向かって低下する傾向の経時変化を示したが，予想に反し培養初期と培養後期において形質転換株のATP レベルが野性株よりも低下していることが判明した．培養後期についてはグルコースも少なくなり，生合成 反応が低下し，ATPレベルを維持する必要性も低下レていると考えられ，このような状況でFiFo‐´ATPaseが 過剰発現レていると，FiFo‑ATPaseは細胞内に残っているATPを分解し尽くし，これと共役してプロトンを 細胞外により多く排出してしまっている可能性が考えられる．測定された膜電位と細胞内pHは定常状態を 反映していると考えることができる，このことからもブロトン駆動力上昇の説明が付く．しかしながらこの メカニズムについてはより詳細な解析が必要である．
以上のようにエネルギー代謝変異による中枢代謝系への影響は非常に大きく興味深い．さらなる研究によ っ て 有 用 物 質 の 発 酵 生 産 性 向 上 に 貢 献 で き る 結 果 が 得 ら れ る も の と 期 待 さ れ る ． ー1178−
学位論文 審査の要旨 主査
副査 副査 副査
教授 教授 教授 助教授
横 田 篤 冨 田 房 男 松 井 博 和 浅 野 行 蔵
学 位 論 文 題 名
コリネ 型グルタミン酸生産菌の エネル ギー代 謝変異に関する研究
本論文は8 章からなり，図28 ，表9 ，引用文献27 を含む総項数62 の和文論文である．別 に参考論文2 編が付されている・
C Dグ門ピろロcrピrfロ朋呂血紜mfcM朋をはじめとする微生物を利用したアミノ酸などの有用物質の 発 酵 生 産 に お い て ， 近 年 ま で に 発 酵 の 改 良 の た め ， 突 然 変 異 の 誘 導 から 遺 伝 子工 学 的 手法 の 応 用 ま で 様 々 な 菌 株 育 種 が 行 わ れ て き た ， こ れ ら 育 種 の タ ー ゲ ッ トと さ れ たの は 主 に目 的 物 質 固 有 の 生 合 成 経 路 で あ っ た ， さ ら な る 発 酵 の 効 率 化 や 新 規 な 発酵 系 の 構築 の た めに は こ れ ま で と は 異 な る 点 を タ ー ゲ ッ ト に す る 必 要 性 が あ る ． そ こ で 当研 究 室 では 糖 質 を原 料 と し た 発 酵 の 出 発 経 路 で あ る 解 糖 系 を は じ め と す る 中 枢 代 謝 系 ， 特に エ ネ ルギ ー 代 謝系 に 注 目 し，F．F。 ．ATP．asc（ 以 後 単にATPaseとす る）を ターゲ ットとし た研究 が行なわ れて き た ， 解 糖 系 の キ ー エ ン ザ イ ム がAMPやADPに よ っ て ア 口 ス テ リ ッ ク に 活 性 化 す る こ と か ら ，ATPレ ベ ル を 低 下 さ せ 解 糖 系 の 活 性 化 を 図 る た め に ， 大 腸 菌 の ピ ル ピ ン 酸 生 産 株 や C・ 呂 血 地 朋fcHmの グ ル タ ミ ン 酸 生 産 株 に お いてATPaseの 欠損 変 異 株が 取 得 され ， 実 際に 糖 代 謝 活 性 の 上 昇 が 確 認 さ れ た ． さ ら に こ れ ら の 変 異 株 に お い て ， 呼 吸活 性 の 上昇 な ど 連鎖 的 な エ ネ ル ギ ー 代 謝 の 変 化 が 観 察 さ れ ，ATPaseの 変 異 が ェ ネ ル ギ ー 代 謝 ， ひ い てiま 中 枢 代謝系に大きな影響を及ぼすことが示唆された・
本 研 究 で はC． 呂m地 所 比M腕 の グ ルタ ミ ン 酸生 産 菌 にお い てIATPaseの 変 異が 代 謝 にお よ ぼ す 影 響 を よ り 詳 細 に 解 析 す る た め ，ATPase遺 伝 子 の 取 得 ， 解 析 と ， 遺 伝 子 工 学 的 な 変 異 株の作出，おもに活性上昇株の作出と解析を行った．
1． ATPase遺伝 子 の 取得 と 解 析
ATPase遺 伝 子 の ク 口 ー ニ ン グ と シ ー ケ ン シン グ の 結果 ，C．glutamicumのATPaseの 遺 伝 子は 一 般 的な パ ク テリア様 のオベ口 ン構造 ，ロル工B (a)，E(c)，F（b）IH（6） ，イ（ め，G
り，D（助，C（￡）の順に列んだ構造（カッコ内はコードされるサプュニット）をとり，atpl か らatpCまでのサ イズが7646 bpで あった． 各サプユ ニットの アミノ酸 配列の相同 性を比 較 した 結 果， 近 緑 な菌 と の相 同 性は全て のサブュ ニットに おいて近縁 でない菌 よりも高 く，ま た，サプュ ニット間 ではc，a，Bサプユニ ットが非 常に高い相同性を示し，Yサブユ ニットが比較的高い相同性を示した．
ATPaseの各サ プュニット の構成に おいてcサ ブュニッ トの割合が非常に高いことから，c サブユ ニットのみ を生成す るような 転写産物 の存在が 予想されたが，ノーザンハイプリダ イゼーションの結果そのような転写産物は検出されなかった，
2． ATPase活 性 上 昇 株 （ 形 質 転 換 株 ） の 作 出 と グ ル タ ミ ン 酸 発 酵 分 析 ク ロ ーニ ン グ したDNA断片 を 用 いて 予 想 され る プ口 モ ー ター からターミ ネーター まで を 十分 に 含むATPase全オ ペ 口ン 遺伝子 を保持す るプラズ ミドとし てpCSATPを作出し ，こ れを用 いてC． glutamicumの形質転換を行った，この形質転換体のATPase活性は野性株に比 ベ，約2．7倍に上昇 していた ．
得られ た形質転換 株のグル タミン酸 発酵を行 い，培養 中の撹拌数，培地中のピオチン濃 度 の影響につ いて検討 した，形 質転換株 は野性株 に比ベI生 育速度の減 少，最大 生育量の 増加， 酸素要求性 ，グルタ ミン酸生 産期にお ける菌体 あたりの糖消費活性や酸素消費速度 の増大 などの性質 を示し， グルタミ ン酸生産 期におい て野性株よりも代謝能カが高いこと が示唆 された．さ らに，溶 存酸素濃 度の低い 条件では 野性株よりもグルタミン酸生産能が 低いが ，逆に，十 分な溶存 酸素濃度 のある条 件では野 性株よりわずかにグルタミン酸生産 能が高 くなる傾向 にあるこ とも明ら かとなっ た，
3． ATPase活性上昇株 の細胞エ ネルギー レベルの 解析
さ ら に形 質 転 換株 の より 詳 細 なェ ネ ルギ ー 代 謝特 性 を 調べ る ため ， 膜 電位 ， 細胞 内 pH， 細 胞内ATP量 の測 定 を行 っ た ．膜 電 位， 細 胞 内pHの 測定 の 結果 ｜ 膜 電位 ，ApHの 双 方 とも野性株 に比べて 大きく， 形質転換 株のプ口 トン駆動 カが野性株よりも高く形成され て い るこ と が 示唆 さ れた ． 細 胞内ATP量 の測 定 の結 果 ， 培養 後期にお いて形質 転換株の ATPレベルが野 性株より も低下し ているこ とが判明 した，培 養後期では 生合成反 応が低下 す る ため ，ATPレベ ル を維 持 す る必 要 性 も低 下 して い る と考 えられ， このよう な状況で ATPaseが過 剰 発 現し て いる と ，ATPaseは 細 胞内 に 残っ て い るATPを分解 し尽くし， これ と 共役してプ 口トンを 細胞外に より多く 排出して しまって いる可能性が考えられる．しか し な が ら こ の ヌ カ ニ ズ ム に つ い て は よ り 詳 細 な 解 析 が 必 要 で あ る と 思 わ れ る ．
以上の ように， 今回の申 請者によ るコリネ 型グルタ ミン酸生産菌のエネルギー代謝変異 に関する研究は，産業的に重要なアミノ酸生産菌c． gtutamicumのエネルギー代謝に関する 知見を 深めると ともに， 従来とは 異なった 手法によ るアミノ酸の発酵生産性向上の可能性 を示し たもので ある，
よって 審査員一 同は，関 根寛直が 博士（農 学）の学 位を受けるのに十分な資格を有する ものと 認めた．
