博士 （歯学）Johanna Rosette K.Po
学位論文題名
EIAF ， an ets‑transcrlptionf ・amilymember ， interaCtSWiththetun10rSuppreSSOrp53reSulting intheaCtiVationofthep21wafl/Cip1
(Etsフんミリー転写因子EIAFは
p53と相互作用してp21wafl/ciplの転写を活性化する）
学位論文内容の要旨
EIAFはC末 端 側 にEts domain'と 呼 ば れ るDNA結 合domainを も つ etsファミリー転 写因子で、他 のets family遺 伝子とはアミノ 酸配列が大 きく 異 なり 、mouse PEA3のhuman homologueで あ るこ とが 明 らかになっ た。これまで、EIAFは細胞外基質分解酵素であるmatrix proteinase−1，う，
うの 転 写を 活 性化 し 、が ん細胞の浸 潤・転移に関 係しているこ とが報告 されてきた。その一方で、EIA,Fがcyclin dependent kinase inhibitorである p21 wafl/ciplの転 写を活性化し 、細胞周期の 停止にはたらく ことも報告 されている。
p53は ヒ ト が ん の50%以 上 で変 異 が生 じ てお り、 そ の異 常 がが ん の 発生 と 深く 関 連し て いる こと が 示唆 さ れて い るが ん 抑制 遺伝 子で、p53 は転写因子 としてtarget geneの転写調節領 域に結合し、 さまざまな下流 遺伝 子 の転 写 活性 化 に働 くこ と が示 さ れて い る。p53が 活 性化する 下流 遺 伝 子 に は 、 Gadd45な ど の DNA修 復 遺 伝 子 や Bax Noxaな ど の apoptosis誘導 遺 伝子 があ り、細胞が ん化の抑制に はたらいてい る。p53 によ り 転写 活 性化 さ れる 遺伝子のー っに、CDK inhibitorであるp21があ り 、 こ れ は 細 胞 のGlか らS期へ の 移行 期に 発 現し 、G1 arrestを 生 じる ことが示されている。
今回、EIAFによるp21wafl/ciplの転写活 性化機構を、 とくにp53との 相互作用を中心に
1． p21の プ 口 モ ー タ ー 活 性 に 対 し て 、 同 様 の 機 能 を も っEIAFとp53 はどのように関係しているのか
2． がん 遺 伝子 とし て 働く こ とが 示 され て いるEIAFにtumor suppressor
と し て の 機 能 は あ る の か という点について検討を行った。
p21の プ ロ モ ー タ ー 領 域 に は2力 所 のets結 合 配 列 が 存 在 し 、 こ れ ら は ヒ 卜 ・ マ ウ ス ・ ラッ ト 間で 良く 保 存さ れ てい るd p53の結 合 サイ ト も2カ 所 存 在 し 、 こ れ ら はets結 合 部 位 と 非 常 に 近 接し 、 一部 は オー バ ーラ ッ プし て いる ことがp21プ口 モーター領域 の解析で明らか になった。
こ の た め 、p53とEIAFはcooperativeにp21の プ 口 モ ー タ ー を 活 性 化 す る可能性が示唆された。
p53が 欠 失 し て い る ヒ ト 肺 が ん 細 胞 株H1299を 用 い た 。H1299に p21 promoter reporter plasmid pWWp−Lucと、E1AFの全長を発現ベクター pcDNA3に 組 み 込 ん だ pcDNA― E1AFお よ びp53の 全 長 を 組 み 込 ん だ pc53―SN3を遺 伝 子導入し 、Luciferaseassayを行っ た。その結果 、p53と E1AFは と も にp21プ 口 モ ー タ ー を 活 性 化 す る が 、 両 者 の 共 導 入 で は さ ら に 転 写 活 性 の 亢 進 が み ら れ 、p53とE1AFは 協 調 的 にp21プ 口 モ ー タ ーを活性化することが示された。
E1AFと 同 じetsフ ァ ミ リ ー に 属 す るets1、ets2で も同 様 にp53と 協 調 的 なp21promoter活 性 化 が 起 こ る か ど う か を 、 同 様 に 検 索 し た が 、 Ets1は 転 写 活 性 化 を 示 さ ず 、p53と の 共 導 入 で もE1AFで み ら れ た 協 調 し た 転 写 亢 進 は 認 め られ ず 、Ets2も 同様 の 結果 を示 し たこ と から 、p53 と 協 調 し たp21プ 口 モ ー タ ー 活 性 の 亢 進 はE1AFに 特 異 的 で あ る こ と が 示唆された。
免 疫 沈 降 法 に よ り 、ets夕 ン バ ク とp53の 結 合 に つい て 検索 した 。 293細 胞 にp53遺 伝子 を組 み 込ん だ アデ ノ ウイ ルス ベ クターを感染さ せ、
その後、E1AF発現 ベクターおよ び、eニts1、ets2発現ベクターを遺伝子導 入 し 、 両 者 の 結 合 を 検 索 し た と こ ろ 、E1AFとp53の 結 合 が 確 認 さ れ た が 、ets1、ets2と の 結 合 は み ら れ な か っ た 。E1AFとp53夕 ン パ ク はin vitrotranslationにより合成したタンバクでも結合し、このような結果は、
E1AFはp53が特異的に結合していることを示していた。
MH3T3細 胞 に ア デ ノ ウ イ ル スE1A遺 伝 子 と 活 性 化ras遺 伝 子 を 導 入 し 、 こ こ にp53あ る い はE1AF発 現 ベ ク タ ー をc01ransfectionし 、 E1AFのtumorSuppreSSOr活 性 をc010nyformationaSSayで 検 討し た。 そ の 結 果 、E1AFはp53と 同 様 にE1A十Rasで 形 成 さ れ た コ 口 二 ー の 数 を 減 少 さ せ 、 tumorsuppressor活 性 を も つ こ と が 明 ら か に な っ た 。 本 研 究 で 、E1AFはp53と 相 互 作 用 し 、 協 調 的 にp21の 転 写 を 亢 進 する こ とが 明 らか になった 。このようなp53と の相互作用は、 他のets1、 ets2では 認め ら れず 、ElAFに 特 有の も ので あ った 。G1−Sへのentr二yに
は活性化されたCyclin/CDKによるRb夕ンパクのりン酸化が重要な役割 を 演 じて い る 。 リ ン酸 化さ れたRbはポ ケット タンバ クであ るE2Fを releaseし、このE2Fが細胞周期を回転させる。EIAFはがん抑制遺伝子 p53と相互作用し、p21の転写を亢進することによってcyclin/CDKを不 活性化し、結果的にRbのりン酸化を阻害し、cell cycle arrestを導くもの と考えられた。
このようなEIAFによるGl期における．cell cycle arrestが、今回示 されたEIAFのtumor suppressor activityと深く関連しているものと思わ れた。
学位論文審査の要旨
学位論文題名
EIAF ， an ets‑transcrlptionf ・ amilymember ， interaCtSWiththetumorSuppreSSOrp53reSulting intheaCtivationofthep21Wafl/Cip1
(Etsフ ァ ミ リ ー 転 写 因 子EIAFは
p53と 相 互 作 用 し てp21wafl/ciplの 転 写を 活 性化 す る ）
審査は、 審査員全員出席の下に口頭試問により行われた。論文審査の概要は、
以下の通 りである 。
最初に申請者から提出論文の要旨の説明があった。
EIAFはC末 端 側 にEts domainと 呼 ば れ るDNA結 合domainを も つetsフ ァ ミ ルー転写 因子で、 これまで、EIAFはmatrix proteinaseの転写を活性化し、が ん 細 胞 の浸 潤・転移 に関係し ているこ とが報告 されてき た。その一 方で、EIAF がcyclin dependent kinase inhibitorであるp21 aflkiplの転写を活性化し、細胞周期 の停止にはたらくことも報告されている。
p53はヒ ト がん の50%以上 で 変異 が 生 じて お り 、そ の 異常 が が んの 発生と 深 く 関 連 して い るこ と が 示唆 さ れて い る がん抑 制遺伝子 で、p53は転写 因子とし て さ ま ざま な 下流 遺 伝 子の 転 写活 性 化 に働い ており、p53により転写 活性化さ れる遺伝子のーっに、CDK inhibitorであるp21がある。
今 回、EIAFによ るp21 aflkiplの転 写活性化機 構を、と くにp53との相互作用 を中心に検討を行った。
p53が 欠失して いるヒト 肺がん細胞 株H1299にp21 promoter reporter plasmid pWWp‑Lucと 、EIAFの 全 長 を 発 現 ベ ク タ ーpcDNA―EIAFお よ びp53の 全 長 を 組 み込んだpc53‑SN3を遺伝子導入し、Luciferase assayを行った。その結果、p53 とEIAFは と も にp21プ 口 モ ータ ー を活 性 化 する が 、 両者 の 共導 入 で はさ ら に 転 写 活 性 の 亢 進 が み ら れ 、p53とEIAFは 協 調 的 にp21プ口 モ ー ター を 活 性化
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男則 人 信 隆靖 正正 後塚 村藤 向戸 田 進 授授 授授 教 教教 教助 査査 査査 主副 副副
する こと が示さ れた 。こ のp53と 協調 したp21の転写亢進はEIAFと同じets ファミルーに属するetsl、ets2では認められず、EIAFに特異的であることが示 唆された。免疫沈降法により、ets夕ンパクとp53の結合について検索したとこ ろ、EIAFとp53の結合が確認されたが、etsl、ets2との結合はみられなかっ た。NIH3T3細胞にアデノウイルスEIA遺伝子と活性化ras遺伝子を導入し、
ここ、にp53あるいはEIAF発現ベクターをco−transfectionし、EIAFのtumor supperssor活性をcolony formation assayで検討した。その結果、EIAFはp53と 同様にEIA十Rasで形成されたコ口二ーの数を減少させ、tumor supperssor活性 をもつことが明らかになった。
本 研究 で、EIAFはp53と相互作用し、協調的にp21の転写を亢進すること が明らかになった。このようなp53との相互作用は、他のetsl、ets2では認め ら れ ず 、EIAFに 特 有 の も の で あ っ た。GlSへ のentryに は 活 性 化 され た Cyclin/CDKによるRb夕ンパクのりン酸化が重要な役割を演じている。リン酸 化されたRbはポケットタンパクであるE2Fをreleaseし、このE2Fが細胞周期 を回 転さ せる。EIAFはがん抑制遺伝子p53と相互作用し、p21の転写を亢進 することによってcyclin/CDKを不活性化し、結果的にRbのりン酸化を阻害し、
cell cycle arrestを導くものと考えられた。
このようなEIAFによるGl期におけるcell cycle arrestが、今回示されたEIAF のtumor supperssor activityと 深 く 関 連 し て い るも の と 思 わ れ た 。
申請者による研究要旨説明後、本研究ならびに関連する研究について質問が 行われた。
主な試問事項は、以下の通りである。
1． EIAFがアデノウイルスの初期遺伝子であるEIA以外の転写活性化にも関 わっているのか？
2. EIAFと他のetsファミリー遺伝子との機能の違い 3. EIAFの正常組織・細胞における発現
4. EIAFのがん遺伝子としての役割
5． Tumor supperssorとしてはたらく際の機構 6.今回用いた細胞のp53のstatus
7. p53と EIAFお よ び 他 の etsフ ァ ミ リ ー 遺 伝 子 の 結 合 部 位 いずれの質問についても明快な回答が得られ、さらに研究を発展させる方向 性 に つ い て も 申 請 者 の 理 解 が 十 分 で あ る こ と が 示 さ れ た 。 本研究は転写メカニズムの解明にあたって、転写因子の相互作用が重要であ ることを明らかにし、さらにEIAFのようながん遺伝子がある条件下ではがん 抑制遺伝子としてはたらくという現象を明らかにした点が重要な意味をもって お り 、 博 士 （ 歯 学 ） の 学 位 授 与 に 値 す る も の と 認 め ら れ た 。
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