博 士 （ 理 学 ） 川 村 猛
学位論文題名
セ1J ン／スレオニン残基特異的プロテインホスファターゼ PP2B の生理的意義の解析ならびにホスファターゼ阻害剤 ト ウ トマ イ シ ン の溝造／ 機能相関 に関す る研究
学位論文内容の要旨
夕ンバク質のりン酸化／脱リン酸化は、そのタンバク分子の重要な機能調節機構であり、
これにより生体機能は可逆的に調節され る。夕ンバク質のりン酸化と脱リン酸化は、それ ぞれブ口テインキナーゼとプ口テインホ スファターゼにより触媒される。プ口テインホス ファターゼはその基質特異性によルセリ ン／スレオニン残基特異的ホスファターゼ、チ口 シン残基特異的ホスファターゼ、スレオ ニン／チ口シン残基特異的ホスファターゼに分類 される。このうちセリン／スレオニン残 基特異的プロテインホスファターゼ（以下セリン
／ス レオ ニン ホス ファ タ ーゼPPと する ）は 、内 在性 のインヒピターI‑lおよびI‑2により 阻 害 さ れ るPP1と 阻 害 さ れ な いPP2に 分 け ら れ 、PP2は さ ら に ポ リ カ チ オ ン 要 求 性 の PP2A、 カ ル シ ウ ム ／カ ルモ ジュ リン 要求 性 のPP2Bお よび マグ ネシ ウム 要求 性のPP2Cに 分類される。
本 論文 にお いて 、1章 では 生体 内で のPP2Bの 役割 を 明ら かに する 目的 で、 脳および免 疫担 当臓 器に おけ るPP2B活性 、免 疫担 当細 胞の 活性 化における本酵素活性の動態、肝癌 細胞 にお けるPP2Bの癌 性 変異 を解 析し た。2章 では 、 セリ ン／ スレ オニ ンホ スファター ゼ阻害剤トウトマイシンの最小機能単位 を明らかにする目的で、トウトマイシンの構造／
機能相関を調ぺた。本論文の要点は以下 にまとめられる。
1章 ：PP2Bは 、 脳 で の 発 現 が 高 く 、 ま た 免 疫 系 に お い て はT細 胞 の 活 性 化 や 細胞 死に 関与するこ とが知られている。しかし、細胞の応答や病態における 本酵素の解析は、ほと ん どな され てい ない 。 本章 では 、生 体内 でのPP2Bの意義を解析するため、正常および自 己 免 疫 疾 患 モ デ ル マ ウスlprマウ スに お けるPP2Bの挙 動、T細 胞の 細 胞内 情報 伝達 系で のPP2Bの動 き、 老化 促 進マ ウス にお けるPP1，PP2A，PP2B活 性、 およ び移 植性腹水肝癌 細胞株と正 常肝細胞におけるPP2B活性を解析した。
1).マ ウ スPP2Bで は 、 脳 のmRNA． 夕 ン バ ク 発 現 量が 脾臓 のそ れに 比 して 著し く高 いに もかかオ） らず、活性は逆に脾臓より低かった。またlprマウスにおいて正常マウスに比ぺ 脾臓での活 性が2倍程度上昇していた。
2).T細 胞の 活性 化過 程 では 、PP2B総 活性 に変 化は 見ら れな かっ た。 した がっ て、T細胞 活 性 化 に お け るPP2Bの活 性化 は、PP2Bの量 的変 化に よる もの では な く、 カル シウ ムに よるPP2Bの 活性化などの質的上昇によるものと考えられる。
3).老化 促進 マウ スで 脳の ホス ファ ター ゼ活 性を 測定した。PP1，PP2Aは小脳・前脳で同 程度の活性 が認められ、加齢による活性変化は見られなかった。し かしPP2Bは、前脳で、
小 脳の 約2倍 の活 性を 示し 、さ らに 老化 促進P‑10系 マウ スの 前脳 で、 加齢 に伴うPP2B活 性の減少傾 向が観察された。
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4).移 槽陸 腹水 肝癌 細胞 でPP1の転 写が 亢進 する ときPP2B活 性は 逆に 減少 してい るもの が 多か った 。
以上 の実 験結 果に より 、PP2Bが種々の病態や生理的条件下に、各々異なった分 子機構 に より 、量 的・ 質的 に調 節さ れて いる こと がわ かっ た 。
2章 ： セ リ ン ／ スレ オニ ン残 基特 異的 プ口 テイ ンホ スフ ァ ター ゼ阻 害剤 オカ ダ酸 は、T 細胞にアポトーシスを 誘導する。本章ではまず、オカダ酸と類似した構造と分 子量をもつ ト ウト マイ シン を用 いてT細胞へ与える影響を 調べた。その結果、トウトマイシンもまた 白 血 病T細 胞 株 に 対 し ア ポ 卜 ー シ ス を 誘 導 す る こ と が 明 ら か に さ れ た 。 トウ トマ イシ ンはPP1とPP2Aを同 程度 の濃 度で 阻害 する が、 オカ ダ酸 はトウトマイシ ン と類 似し た構 造と 分子 量を もち なが らPP2AをPP1に 比し てよ り強 く阻 害する。このこ とは部分構造の差異が 活性阻害の特異性を決定していることを強く示唆する。したがって、
ト ウト マイ シン の部 分構 造を 用い るこ とに よ りPP1，PP2A活性 阻害 をも たらす最小機能 単 位の 決定 、さ らにPP1，PP2Aそれぞれの特異 的阻害構造を用いることによルアポトーシ ス誘導との関係を解析 することができる。そこでトウトマイシンおよびその部 分合成物や 誘導体を用いて、ホス ファターゼ活性阻害とアポトーシス誘導につしゝて構造／機能相関を 調ぺた。トウトマイシ ンは無水マレイン酸部分をもつ左セグヌン卜と、スピ口 ケタール構 造 を含 む炭 素数26の 右セ グヌ ント から なる が 、ホスファターゼ活性阻害には既に報告が ある無水マレイン酸部 分やC22の水酸基の重要性の 他に、C22‑C96炭素骨格が必 要であると 結諭された。また活性 阻害を示す化合物は、左セグヌントを含む活性阻害を示 した最小構 造 の化 合物 以外 は、PP2AよりPP1を 強く 阻害 した こと から 右セ グヌ ント が阻害の特異性 を決定していると考え られる。一方、アポトーシス誘導にはトウトマイシンの 右セグメン トのスビ口ケタール構 造を含むCi‑C18の骨格が最小単位と考えられ、ホスファ ターゼ阻害 に 重要 な部 分で ある 無水 マレ イン 酸部 分を 改 変した化合物や左セグメントをもたない化 合物でもアポトーシス 誘導能を示した。さらにアポトーシス誘導の最小骨格と 考えられる C1‑C18部分の化合物は 、ホスファターゼ活性を阻害しなかった。これらのこと より、ホス フ ァタ ーゼ 阻害 作用 を示 す構 造と アポ トー シ ス誘導を引き起こす構造には平行関係は見 られず、トウトマイシ ンによるアポトーシス誘導とホスファターゼ阻害は異な る機序によ るものと結論された。 また、アポトーシス誘導能を示す最小骨格のCi‑C18にあ るスピ口ケ タール構造は、他のア ポトーシス誘導能を示すホスファターゼ阻害剤であるオ カダ酸やチ ルシフェリル‑23‑アセ テートにも共有されており、これらの化合物においても アポトーシ ス 誘 導 と ホ ス フ ァ タ ー ゼ 阻 害 は 異 な る 機 序 に よ る も の で あ る と 考 え ら れ る 。 本論 文で は、 セリ ン／ スレ オニ ン残 基特 異的 プ口テインホスファターゼPP2Bの生理機 能 の解 析な らび にPP1，PP2A阻害剤トウトマイシンの構造／機能相関の解析を 行った。今 後 、さ らに 脳と 免疫 系のPP2Bの差 異を 解析 する ためPP2Bの精製などを行う必 要がある。
また、トウトマイシンに おいては、トウトマイシンのスピ口ケタール構造をもつ 部位を用 いたアポトーシスのシグ ナル伝達分子の探索、他のスピ口ケタール構造をもっホ スファタ ーゼ阻害剤でのアポトー シス誘導とホスファターゼ阻害の関係を解析することに より、そ の作用機構がさらに解明 されることが期待される。
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学位論文審査の要旨 主査 教授 菊池九二三 副 査 教 授 谷 口 和 彌 副 査 教 授 矢 澤 道 生
学位論文題名
セリン／スレオニン残基特異的プロテインホスファターゼ PP2B の生理的意義の解析ならびにホスファターゼ阻害剤 ト ウ ト マイ シ ン の構造／ 機能相 関に関す る研究
夕ンバク質のりン酸化／脱リン酸化ば、生体における重要な機能調節機構である。夕 ンハク質の脱リン酸化は、ブ口テインホスファターゼにより触媒される。本論文におい て、1章では生体内でのホスファ夕一ゼPP2Bの役割を明らかにする目的で、脳および 免疫担当臓器におけるPP2B活性、免疫担当細胞の活性化における本酵素活性の動態、
肝癌細胞におけるPP2Bの癌性変異を解析した。2章では、ホスファターゼ阻害剤トウ トマイシンの最小機能単位を明らかにする目的で、トウトマイシンの構造／機能相関を 調べた。本論文の要旨は以下にまとめられる‥
1章： 生体内におけるPP2Bの意義を明らかにするため、正常および自己免疫疾患 モデルマウスll)rマウスにおけるPP2Bの挙動、T細胞の細胞内情報伝達系でのPP2B の動き、老化促進マウスにおけるPP1，PP2A，PP2B活性、および移植性腹水肝癌細胞 林と正常肝細胞におけるPP2B活性を解析した。
1).マウス脳ではPP2BのmRNA．夕ンバク発現量が脾臓のそれに比して著しく高しゝに もかかオjらず、活性は逆に脾臓より低い値を示した。またlprマウスにおいて正常マウ スに比ぺ脾臓での活性が2倍程度上昇していた。
2）．T細胞の活性化過程で、PP2B総活性に変化は見られなかった。したがって、T細胞 活性化におけるPP2Bの活性化は、PP2Bの量的変化によるものではなく、カルシウム に よ る PP2Bの 活 性 化 な ど の 質 的 上 昇 に よ る も の と 考 え ら れ る 。 3).老化促進マウスで脳のホスファターゼ活性を測定した。PP1，PP2Aは小脳・前脳で 同程度の活性が認められ、PP2Aは加齢による活性変化は見られなかったが、PP1の前 脳で加齢にともない約30％の活性上昇が認められた。またPP2Bは、前脳で、小脳の約 2倍の活性を示し、老化促進マウス、コント口ールマウスともに、加齢により前脳の PP2B活性が減少する個体が多く見られた‥
4).移植性腹水肝癌細胞でPP1の転写が亢進するとき、PP2B活性は逆に減少している ものが多かったー
2章：本章ではまず、トウトマイシンが白血病T細胞株に対しアポトーシスを誘導す ることを明らかにした。次いで、トウトマイシンおよびその部分合成物や誘導体を用い て、ホスファターゼ活性阻害とアポトーシス誘導について構造／機能相関を調ぺた。ト
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ウトマイシンは無水マレイ ン酸部分をもつ炭素数7の左 セグヌントと、スピ口ケタール 構 造を 合む 炭素 数26の右 セグヌン卜からなる。ホスファターゼ活性 阻害には無水マレ イン酸部分やC,22の水酸基 の重要性が既に報告されているが、阻害活性を示さない左セ グヌントにC22‑C2r）部分を合む骨格を付加した化合物が阻害活性を示すこと、Ci‑C26フ ラグヌントが阻害活性をも つことから、活性阻害にはC22‑C26の炭素骨格が重要である と結論された‥また左セグ ヌントとC,22‑ C26の炭素骨格を含む活性阻害を示した最小構 造 の 化 合 物 はPP1とPP2Aを同 じ濃 度で 阻害 した が、 他の 活性 阻害 を示 す化 合 物は す べ てPP1をPP2Aよ り わ ず かで ある が低 濃度 で阻 害し た。 この こと から 右セ グ メン ト が阻害の特異性に影響を与 えていると考えられる。一方、アポトーシス誘導には卜ウト マ イシ ンの 右セ グヌ ント のスビ口ケタール構造を含むCi‑C18の骨格 が最小単位と考え られ、ホスファターゼ阻害 に重要な部分である無水マレイン酸部分を改変した化合物や 左セグヌントをもたない化 合物でもアポトーシス誘導能を示した。さらにアポトーシス 誘 導の 最小 骨格 と考 えら れるCl‑C18部分の化合物は、ホスファター ゼ活性を阻害しな かった‥これらのことより 、ホスファターゼ阻害作用を示す構造とアポトーシス誘導を 引き起こす構造には平行関 係は見られず、トウトマイシンによるアポトーシス誘導とホ スファターゼ阻害は異なる 機序によるものと結論された。また、アポトーシス誘導能を 示 す最 小骨 格のCi‑Ci8に あるスビ口ケタール構造は、他のアポトー シス誘導能を示す ホ スフ ァタ ーゼ 阻害 剤で あるオカダ酸やチルシフウリル‑23‑アセテ ートにも共有され ており、これらの化合物に おいてもアポ卜ーシス誘導とホスファターゼ阻害は異なる機 序によるものであると考え られるー
これ を要 する に、 著者はセリン／スレオニンブ口テインホスフ ァターゼPP2Bの調節 機 構な らび にホ スフ ァターゼ阻害剤卜ウトマイシンの構造／機能 相関について新知見 を得たもので、ブ口テイン ホスファターゼ研究に貢献するところ大なるものがある。よ っ て、 著者 は、 北海 道人学博士（理学）の学位を授与される資格 あるものと認める。
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