FIGURE 1. The response to hypoxia in K562 cells. (A) 5 × 104
cells/ml of K562 cells were se eded, and cell growth was measured following 24, 48, and 72 h of normoxic (20% O2) or
hypoxic (1% O2) cultivate conditions. (B) The expression level of
HIF-1α protein in K562 cells cultured under 20% O2 or 1% O2
conditions for 24 h. (C) Photomicr ograph of an exosome derived from hypoxic K562 cells. Scale bar, 100nm. (D) Photomicrograph of an exosome derived from normoxic K562 cells. Scale bar, 100 nm. (E) CD63 (exosomal marker) immunoblot of exosome derived from K562 cells cultured under 20% O2 or 1% O2 conditions for 24 h. Equal amount of exosome
(300 ng) were used for the assay. (F, G) The nanoparticle size distribution for the exosome derived from K562 cells cultured under 20% O2 or 1% O2 conditions for 24 h were obtained by
NTA (F), and the nanoparticle concentrations were normalized to final cell counts for 24 h under normoxic or hypoxic conditions. Each bar is presented as the mean ± SD (n = 3) (G).
ナ ル は 、腫 瘍 と 周 囲 の 間 質 組 織 間 の 伝 達 や 増 殖 性 、血 管 新 生 経 路 の 活 性 化 や 転 移 の 開 始 を 通 し て 腫 瘍 の 増 殖 促 進 へ と 働 く 。す で に エ ク ソ ソ ー ム を 介 し た miRNA の 伝 達 と し て 、 白 血 病 細 胞 か ら 血 管 内 皮 細 胞 へ エ ク ソ ソ ー ム が 輸 送 さ れ 、あ る 一 定 の 外 来 性 miRNA が 血 管 内 皮 細 胞 の 遊 走 と 管 形 成 を 調 節 す る こ と が 実 証 さ れ た 。 こ れ ら の こ と よ り 、本 研 究 で は 腫 瘍 微 小 環 境 の 1 つ で あ る 低 酸 素 環 境 を 伝 達 す る エ ク ソ ソ ー ム の 働 き と そ の 働 き の 要 因 と な る miRNA に つ い て 検 討 を 行 っ た 。 第 1章 低 酸 素 環 境 に お け る 白 血 病 細 胞 由 来 エ ク ソ ソ ー ム の 血 管 新 生 増 強 作 用 本 章 で は 、低 酸 素 状 態 で K562 細 胞 か ら 放 出 さ れ た エ ク ソ ソ ー ム が 血 管 内 皮 細 胞 の 挙 動 に 及 ぼ す 影 響 の 検 討 を 目 的 に 研 究 を 行 っ た 。ま ず 、低 酸 素 状 態 に お け る K562 細 胞 の 増 殖 、HIF-1α (低 酸 素 応 答 マ ー カ ー )の 測 定 を 行 い K562 細 胞 の 低 酸 素 環 境 へ の 適 応 を 観 察 し た 。 ま た 、 CD63 (エ ク ソ ソ ー ム マ ー カ ー ) 測 定 や Nanoparticle tracking analysis(NTAs)を 用 い て 、 24 時 間 で の 低 酸 素 状 態 に て K562 細 胞 よ り 放 出 さ れ た エ ク ソ ソ ー ム (K5621 ％ O 2 -exosome)と 通 常 酸 素 状 態 に て 放 出 さ れ た エ ク ソ ソ ー ム (K5622 0 ％ O 2-exosome)の 量 や 粒 子 径 を 測 定 し た 。 K562 細 胞 の 24 時 間 低 酸 素 曝 露 は 低 酸 素 応 答 を 示 し 、 し か し な が ら K562 細 胞 の 細 胞 増 殖 へ 影 響 を 与 え な い こ と が 判 明 し た 。ま た 放 出 さ れ た エ ク ソ ソ ー ム の 粒 子 径 や 量 に 対 す る 影 響 も 生 じ ず 、 K5621 ％ O 2-exosomeの 含 有 物 を 検 討 す る た め の 最 適 条 件 が 24 時 間 の 低 酸 素 曝 露 で あ る こ と が 明 ら か に な っ た 。 こ の こ と か ら 、24 時 間 に 放 出 さ れ た エ ク ソ ソ ー ム を 用 い て 以 下 の 研 究 を 行 っ た 。 次 に K5621 ％ O 2-exosome/ K5622 0 ％ O 2-exosomeを 通 常 酸 素 状 態 の
HUVECs(HUVECs2 0 % O 2)に 添 加 し tube formation assayを 用 い て 、 K5621 ％
O 2-exosomeの 血 管 新 生 増 強 能 を 測 定 し た 。 そ れ ぞ れ の エ ク ソ ソ ー ム を 添 加 す
Ranking: Cellular and exosomal miRNAs which were up-regulated less than 1.5-fold under hypoxic conditions are ranked by the expression level.
Table 1. Top 10 cellular and exosomal miRNAs elevated under hypoxic conditions in K562 c ells
FIGURE 2. The exosome derived from K562 cells in hypoxic conditions enhance tube formation of HUVECs. (A, B, C) The formation of tube-like structures was observed under bright field. Endothelial tube formation of HUVECs cultured on
Matrigel with K5621 % O 2-exosome (A), and
with K5622 0 % O 2-exosome (B),
or without K562-exosome (control) (C). The scale bar indicates 500 μm. (D) The
tube-like structures determined by pixel density are significantly enhanced by the addition of K5622 0 % O 2-exosome (*p <
0.01) or K5621 % O 2-exosome
(**p < 0.001) as compared with control (HUVECs2 0 % O 2). さ ら に 、K5621 ％ O 2-exosome を 添 加 し た 場 合 、 K5622 0 ％ O 2-exosomeを 添 加 し た 場 合 と 比 べ 有 意 に 管 形 成 を 促 進 し た 。 こ の た め 、 K5621 ％ O 2-exosomeは K5622 0 ％ O 2-exosomeよ り も 血 管 新 生 増 強 作 用 を 示 す 物 質 を 含 有 し て い る 可 能 性 が 示 さ れ た 。 K5621 ％ O 2-exosome に 含 ま れ る 血 管 新 生 増 強 作 用 を 示 す 物 質 を 特 定 す る た め に エ ク ソ ソ ー ム に 含 ま れ る 18-25 塩 基 の 非 翻 訳 RNAで あ る miRNAの 関 与 に 着 目 し た 。 低 酸 素 で 誘 導 さ れ た exosomal miRNAを 特 定 す る た め に 、 miRNA profilingを 行 っ た 。 通 常 酸 素 状 態 に 比 べ 低 酸 素 状 態 で 1.5 倍 以 上 発 現 が 上 昇 し た も の を 抽 出 し 細 胞 内 、 エ ク ソ ソ ー ム 内 そ れ ぞ れ に 対 し 2( - Δ C t )値 の 順 で 並 び 替 え た 。 並 び 替 え た 上 位 10 の う ち 細 胞 内 と エ ク ソ ソ ー ム 内 で 共 通 し た miRNAと し て 、miR-18bと miR-210 の 2 つ が 抽 出 さ れ た 。 第 2章 低 酸 素 白 血 病 細 胞 由 来 エ ク ソ ソ ー ム に 含 ま れ る miR-210 に よ る 血 管 新 生 増 強 作 用 本 章 で は 第 1 章 で 抽 出 さ れ た miRNAの う ち miR-210 に 着 目 し 、そ の 血 管 新 生 増 強 作 用 に つ い て 検 討 を 行 っ た 。exosomal miR-210 の 血 管 内 皮 細 胞 の 管 形 成 を 促 進 へ の 関 与 を 示 す た め に 低 酸 素 状 態 で miR-210 を ノ ッ ク ダ ウ ン し た K562 細 胞 か ら 放 出 さ れ た エ ク ソ ソ ー ム (K5621 % O 2/anti-miR-210-exosome)を 用 い
て tube formation assayを 行 っ た と こ ろ 、 コ ン ト ロ ー ル を ノ ッ ク ダ ウ ン し た K562 細 胞 か ら 放 出 さ れ た エ ク ソ ソ ー ム (K5621 % O 2
/con-exosome)を 用 い た 場 合 に 比 べ 管 形 成 が 低 下 し た 。
FIGURE 5. EFNA3 expression of HUVECs cultured with exosome derived from K562 cells. (A, B) EFNA3 expression was inhibited by exosomes derived from hypoxic K562 cells. HUVECs were cultured under normoxic conditions with the exosomes derived from K562 cells cultured under normoxic conditions (K56220%O2-exosomes) for 24 h (A), and with the exosomes derived from K562 cells cultured under hypoxic conditions (K5621%O2-exosomes) (B). The scale bar indicates 10 μm. (C) EFNA3 signal was quantified using ImageJ software. EFNA3 fluoresce nce signals were drastically inhibited by addition of K5621%O2-exosomes (*p < 0.001) as compared with K56220%O2-exosomes. (D) Expression of EFNA3 in HUVECs by immune blot. (E, F) HUVECs were cultured under normoxic conditions with the RPMI822620%O2-exosomes for 24 h
現 在 ま で に い く つ か の miR-210 の タ ー ゲ ッ ト 遺 伝 子 が 同 定 さ れ て い る が 、 既 に 報 告 さ れ る も の の 1 つ に 受 容 体 型 チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ リ ガ ン ド で あ る Ephrin-A3(EFNA3)が あ る 。 K5622 0 ％ O 2-exosomeに 含 ま れ る exosomal miR-210
に よ る EFNA3 発 現 量 の 変 化 を 免 疫 染 色 と Immunoblottingを 用 い て 測 定 し た 。 通 常 酸 素 状 態 の HUVECsに K5621 % O 2-exosomeを 添 加 す る こ と に よ っ て EFNA3 の 発 現 は 抑 制 さ れ た 。EFNA3 は 血 管 新 生 と VEGFシ グ ナ ル の 制 御 に お け る EFNA1/ephA2 の 相 互 作 用 に 重 要 な 役 割 を も つ こ と が 知 ら れ て い る 。EFNA3 は 血 管 新 生 に お け る 負 の 制 御 因 子 と し て 作 用 す る と 考 え ら れ て い る 。 従 っ て 、 miR-210 を 高 濃 度 で 含 む エ ク ソ ソ ー ム が EFNA3 を ダ ウ ン レ ギ ュ レ ー ト し 、 そ の た め HUVECs の 管 形 成 が 促 進 さ れ た と 考 え ら れ た 。 総 合 考 察 低 酸 素 条 件 で 24 時 間 培 養 し た K562 細 胞 か ら 放 出 さ れ る エ ク ソ ソ ー ム の 粒 子 径 は 通 常 酸 素 条 件 下 で 放 出 さ れ た エ ク ソ ソ ー ム の 粒 子 径 と ほ と ん ど 差 が 生 じ な か っ た 。長 期 間 の 低 酸 素 曝 露 が ど の よ う に し て 腫 瘍 細 胞 の エ ク ソ ソ ー ム の 放 出 と 機 能 に 影 響 を 及 ぼ す か に つ い て は ま だ 分 か っ て お ら ず 、本 研 究 で は エ ク ソ ソ ー ム の 量 で は な く 含 有 物 に よ る 影 響 を 特 定 す る た め に 24 時 間 の 低 酸 素 曝 露 を 、 本 研 究 を 行 う 上 で の 最 適 条 件 と し た 。 エ ク ソ ソ ー ム は 機 能 性 タ ン パ ク 質 や mRNA,miRNA な ど 多 く の 物 を 含 ん で い
FIGURE 4. Knockdown experiment of exosomal miR-210. (A) The validation of the efficacy of miR-210 inhibitor in K562 cells transfected with the luciferase reporter vector containing miR-210 sequences in EFNA3 3′ -UTR. The tr ansfection of anti-miR-210 to K5621 % O 2 cells inhibited the induction of luciferase activity (normoxia control vs. hypoxia control: *p < 0.05;
anti-miR-210 vs. negative control: #p < 0.05; n = 3). (B) The nanoparticle size distribution for the exosome derived from K5621 % O 2/con (K5621 % O 2 cells transfected with negative control miR) and K5621 % O 2/anti-miR-210 (K5621 % O 2 cells transfected
with miR-210 inhibitor) were obtained by NTA. (C) HUVECs2 0 % O 2 wer e transfected with the luciferase reporter vector
containing miR-210 sequences in E FNA3 3′ -UTR. Luciferase activity was compared with HUVECs2 0 % O 2 cultured with
exosome derived from K5621 % O 2/anti-miR-210 or K5621 % O 2/con (with K562-exosome vs. control: *p < 0.05; anti-miR-210 vs.
negative control: #p < 0.05; n= 3). (D, E, F) Endothelial tube formatio n of HUVECs2 0 % 0 2 cultured on Matrigel with
K5621 % O 2/con-exosome (D), and with K5621 % O 2/anti-miR-210-exosome (E). (F)The tube-like structures determined by pixel
density are reduced by the addition of K5621 % O 2/anti-miR-210-exosome (*p < 0.01) compared with K5621 % O 2/con-exosome.
る が 、 特 に miRNA は 主 に 翻 訳 阻 害 と mRNA の 分 解 に 関 わ り 標 的 と な る 複 数 の 遺 伝 子 を 制 御 す る 。さ ら に エ ク ソ ソ ー ム に よ り 受 容 細 胞 へ 移 動 が 示 さ れ た こ と で 、細 胞 内 で の 遺 伝 子 制 御 に 留 ま ら ず 、他 細 胞 の 遺 伝 子 も 制 御 す る 間 接 型 細 胞 間 相 互 作 用 を 示 す 物 質 と し て 注 目 を 集 め て い る 。 miRNA profiling の 結 果 よ り 、い く つ か の miRNA は 細 胞 内 よ り エ ク ソ ソ ー ム 内 の 発 現 量 が 高 く 、あ る 種 の miRNA が 選 択 的 に エ ク ソ ソ ー ム に 含 有 さ れ る こ と が 示 唆 さ れ た 。ま た 、 低 酸 素 環 境 に よ り 細 胞 内 と エ ク ソ ソ ー ム 内 の miR-210 発 現 が 上 昇 し 、miR-210 を 低 酸 素 腫 瘍 細 胞 よ り 放 出 さ れ る 主 要 な eoxosmal miRNA で あ る と 考 え た 。 K5621 ％ O 2-exosomeに よ る 血 管 新 生 増 強 作 用 は 、 エ ク ソ ソ ー ム 量 で は な く 含 有 さ れ る exosomal miRNAの 違 い に よ る も の で あ り 、 低 酸 素 エ ク ソ ソ ー ム は miR-210 を 多 く 含 ん で い る 。 miR-210 は エ ク ソ ソ ー ム を 介 し て HUVECsへ 伝 達 さ れ 、通 常 酸 素 状 態 に い る HUVECsを 低 酸 素 環 境 下 に い る か の よ う に Ephrin A3 の 発 現 を 減 少 さ せ 、 血 管 新 生 増 強 作 用 を 誘 発 す る 可 能 性 が 示 さ れ た 。
慢 性 骨 髄 性 白 血 病 (CML: chronic myeloid leukemia)患 者 の 骨 髄 で は 顕 著 な 血 管 新 生 が み ら れ る が 、骨 髄 は 低 酸 素 環 境 で あ る こ と が 知 ら れ て い る 。本 研 究 は 、低 酸 素 環 境 下 に お け る CML 細 胞 が エ ク ソ ソ ー ム を 介 し て 血 管 内 皮 細 胞 に 作 用 し 血 管 新 生 を 増 強 す る 可 能 性 を 示 唆 し た 。こ の こ と は 腫 瘍 細 胞 が そ れ 自 体 の 微 小 環 境 を エ ク ソ ソ ー ム に よ っ て 他 の 細 胞 へ 伝 達 す る 可 能 性 を 示 し て い る 。腫 瘍 血 管 新 生 は 、様 々 な 因 子 に よ っ て 制 御 さ れ て い る こ と が 知 ら れ て い る が 、エ ク ソ ソ ー ム を 介 し た 非 接 触 型 の 細 胞 間 相 互 作 用 は 、低 酸 素 環 境 下 に お け る 腫 瘍 微 小 環 境 の 調 節 に 重 要 な 役 割 の 一 端 を 担 う 。 本 研 究 で は 、 腫 瘍 血 管 新 生 に お け る 低 酸 素 腫 瘍 細 胞 よ り 放 出 さ れ た exosomal miRNA の 役 割 を 初 め て 実 証 し た 。 【 本 研 究 結 果 の 掲 載 】
