博 士 （ 医 学 ） 菊 地 健 司
学 位 論 文 題 名
Helicobacter py た灯 StimulateSepithelialCe11migrationvla CagA ・ mediatedperturbationofhOStCe11Signaling
（ヘリコバク夕―・ピロりはCagA を介した宿主細胞内シグナル伝達の 攪乱により細胞運動性を増強する）
学位論文内容の要旨
【背景 ・目的 】Helicobacter pylori（〃．pylori)感染は 、胃 癌をは じめと する胃 ・十二 指腸 粘膜病変 に 関 連 す る 微 好 気 性 の グ ラ ム 陰 性 ら せ ん 状 桿 菌 で あ る 。 な か で もCagAタ ン パ ク 質 を 産 生 す る cagA陽 性H. pyloriは 激 し い 萎 縮 性 胃 炎 を 引 き 起 こ し 、 胃 癌 発 症 の 危 険 率 を 有 意 に 高 め る 。H.
pyloriの 菌 体 内 で 産 生 さ れ たCagAは 、IV型 分 泌 装 置 を 介 し て 胃 上 皮 細 胞 内 に 侵 入 し た後 、 分 子 内のGlu‑ProーIle‑Tyr‑Ala (EPIYA)モ チーフ がチ ロシン リン酸 化をさ れる。 チロ シンリ ン酸化 された CagAはSrc homology 2‑contammgproteintyrosinephoSphaぬse―2（SHP2） と特 異 的 に結合 し、そ の ホス フ ァ タ ー ゼ活 性 を 脱 制 御す る こ と に よ り細 胞 増 殖 ・ 細胞 運 動 の 異 常を 引 き 起 こす 。一方 、CagA はそ の ‐COOH末 側 に 存在 す るCagA多 量 体 化 （CM） 配 列 を介 し てpanitioning‐defectivel（f＿ARl） とり ン 酸 化 非 依存 的 に 結 合 し、 そ の キ ナ ー ゼ活 性 を 抑 制 する こ と に よ り上 皮 細 胞 極性 を破壊 する 。 本 研 究 で は 、cロgA陽 性H． ガ め ′fの 病 原 性 に お け るCagA‐SHP2相 互 作 用 とCagA→PARl相 互 作 用の 役 割 を 解 明す る こ と を 目的 に 、 相 同 組 換え を 用 い て ゲノ ム 背 景 の 均一 なH．pッめ ′fcロgA変 異 株 （isogenic株 ） を 作 製 し 、 胃 上 皮 細胞 株 へ の 感 染実 験 を 通 し てそ の 病 原 生 物活 性 を 検 討 し た。
【方法 ・材料 】
lsogenicH． ガ め ガ 株 の 作 製 ：naturaItransfonnation法を 用 い て 、H． ガ めrfNCTCl1637株 のc昭A 遺伝子 の相同 組換え を行 った。
H． ガ め ′f感 染 実 験 ： ヒ ト 胃 上 皮 細 胞 由 来AGS細 胞 にNCTCl1637株 な ら び に そ のisogenic〃 ． ガめn株を 感染さ せた。
免 疫 沈 降 実 験 ：H． ガ め ′fを 感 染 さ せ たAGS細 胞 よ り 細 胞抽 出 液 を 調 整し 、 抗CagA抗 体 を 用 いて 免 疫 沈 降 を 行 っ た 。 続 い て 、 細 胞 抽 出 液 及 び 免 疫 沈 降 物 を 用 い てSDS‐PAGE及 び 免疫 ブ ロ ッ ト を 行った 。
細 胞 運 動 能 の 解 析 ： 高 密 度 培 養 し たAGS細 胞 にH． ガ めrfを 感 染 さ せ 、Wbundhealingassayを 行 った。
【結果 】
1．IsogenicH．ガめH株 の樹立
CagAのEPIYA含 有 領 域 は 、EPIYAモ チ ー フ 周 辺 の ア ミ ノ 酸 の 違 い か らA，B，C，Dの4種 類 の セ グ メ ン ト に 区 別 さ れ 、 個 々 のH， ガめH菌 株 で 産生 さ れ るCagA分 子 内 のこ れ ら の セ グメ ン ト の 組 み 合 わ せ に 多 様 性 が 認 め ら れ る 。16ア ミ ノ 酸 か ら 構 成 さ れ るCM配 列 は 、Cセ グ メ ン ト 内 な ら び に EPIYA含 有 領 域 の ‐C00H末 側 下 流 に 存 在 す る 。 こ の た め 、H． 緲 わ ′fNCTC11637株 由 来 のCagA
（ABCCC） は4つ のCM配 列 を 保 有 す る の に 対 し 、F32株 由 来 のCagA（ABD） はCM配 列 を1つ だ け 保 有 す る 。 本 研 究 で は 、 形 質 転 換 効 率 の 高 いNCTCl1637株 を 用 い 、NCTCl1637株 が 保 有 す る 翻gA遺 伝 子 内 のEPIYA含 有 領 域 （ABCCC） を コ ー ド す る 塩 基 配 列 をF32株 由 来 の 相 同 部 位 （ABD） を コ ー ド す る 塩 基 配 列に 置 換 し 、ABD型 の 野生 型CagA（wt‐CagA） 発 現株 を 樹 立 し た。
次 に こ の 株 を 用 い て 、EPIYAモ チ ー フ の チ ロ シ ン 残 基 を アラ ニ ン 残 基 に置 換 し た り ン酸 化 耐 性 型 CagA（PR−CagA） 発 現 株 な ら び にCM配 列 を 欠 失 さ せ た 変 異 型CagA（CagA― △CM）発 現 株 を 樹 立 した。
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2． Isogenic H. pylori株 の基 本 的 性 質 の評 価
NCTC11637株 な ら び に 作 製 し たisogenic H. pylori株 の 増 殖 速 度 は 、菌 株 間 で 差 がみ ら れ な か っ た 。 さ ら に 、 〃 ，pylori感 染 細 胞 に 特 異 的 に み ら れ る 細 胞 空 胞 化 は 、NCTC11637株 と 同 様 に isogenic H. pylori株 の 感 染 でも 観 察 さ れ た。 以 上 の こ と から 、 ゲ ノ ムの 相同組 換えがisogenicH． pylori株の 基 本 的 性 質 に影 響 を 与 え ない こ と を 確 認し た 。
3． CagA‑SHP2相 互 作 用 とCagA‑PARl相 互 作用 の 解 析
AGS細 胞 にisogenic H.ガ め ガ 株 を 感 染 さ せ 、 免疫 沈 降 実 験 を行 っ た 。 そ の 結果 、 細 胞 内 に注 入 さ れ たCagAが り ン 酸 化 依 存 的 にSHP2と 結 合 す る こ と に 加 え 、 リ ン 酸 化 非 依 存 的 にCM配 列 を 介 し てPAR1と 結 合す る こ と が 示さ れ た 。
4． Isogenic H. pylori株 が示 す 病 原 生 物活 性 の 解 析
H. pylori感 染 に お け るCagA‑SHP2相 互 作 用 な ら び にCagA‑PARl相 互 作 用 の 病 原 生 物 活 性 を 明 ら か に す る た め 、isogenic H. pylori株 感 染 が 胃 上皮 細 胞 の 細 胞 運動 能 に 及 ば す役 割 を 比 較 検 討 し た 。 そ の 結 果 、cagA陽 性H. pylori株 （wt‑CagA、PR‑CagA及 びCagA‐ △CM発 現 株 ） は い ず れ も 細 胞 運 動 性 を 亢 進 さ せ た 。 な か で も 、wt．CagA発 現 株 によ る 細 胞 運 動亢 進 能 が 有 意 に高 か っ た 。 一方、cロ 必遺伝 子を欠 損したisogenicH．ガ ´D′f株 （△CagA）は細 胞運動 性に 影響を 与えな かっ た 。 さら に 、 〃 ， ガめH感 染 細 胞の 細 胞 形 態 変化 を 調 べ た とこ ろ 、wt‐CagA発現株 は細胞 を著 しく伸 長 さ せ た の に 対 し 、PR‐CagA発 現 株 とCagA‐ △CM発 現 株 は 細 胞 形 態 に 明 確 な 影 響 を 与 え な か っ た 。こ れ ら の 結 果か ら 、 細 胞 運動 性 亢 進 に 代表 さ れ るcロ必 陽 性 〃 ． ガ め′fの 病 原 生物 活 性発 現 に はCagAの 病 原 性 に はCagA‐SHP2相 互 作 用 とCagA‐PARl相 互 作 用 が 協 調 的 に 作 用 す る こ と が 明 らか に な っ た 。
【 考 察】 本 研 究 で は、isogenic〃． ガ め ′f株を 作 製 し 、H． ガ 加f感 染実 験を 通して 、CagAが りン酸 化 依 存 的 にSHP2と 結 合 す る こ と 一 方 、CM配 列 を 介 し て り ン 酸 化 非 依 存 的 にPARlと 結 合 す る こ と を 示し た 。 こ れ まで に 、CagAを 全 身 性に 発 現 す る卜ラ ンスジ ェニッ クマ ウスは 消化管 腫瘍と 血液 系 腫 瘍 を 発 症 す る の に 対 し 、 機 能 獲 得 型SHP2発 現 マ ウ ス は 血 液 系 腫 瘍 の み を 発 症 す る こ と が報 告 さ れ て い る 。 こ の 事 実 は 、 胃 癌発 症 に はCagAに よ るSHP2の 脱制 御 だ け で は不 十 分 で あ り、P」 へRl 抑 制 を 介 し た 上 皮 細 胞 の 極 性 破 壊 も ま た 重 要 な 役 割 を 担 う こ と を 示 唆 し て い る 。 本 研 究 で は 、 帆 ―CagA、PR―CagA及 びCagA一DCMを 発 現 す る 〃 ・ ガ 炳 が 胃 上 皮 細 胞 に 与 え る 効 果 を 比 較 し た と こ ろ 、ca呂4陽 性 〃 ．ガ め 打 の 病 原 性の 指 標 の ー っと 考 え ら れ る感 染 胃 上 皮 細胞 の 運 動 性 亢 進 や 細 胞 形 態 変 化 誘 導 に お い て 、CagA―SHP2相 互 作 用 とCagA―PARl相 互 作 用 が 共 に 重 要 な 役 割 を 担う こ と が 明 らか に な っ た 。
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学位論文審査の要旨 主 査 教授 平野 聡 副 査 教授 今村 雅 寛 副 査 教授 田中 伸 哉
学 位 論 文 題 名
Helicobacter pylori stimulates epithelialCe11migrationvla CagA ‐ mediatedperturbationofhOStCe11Signaling
（ヘリコバク夕―・ピロりはCagA を介した宿主細胞内シグナル伝達の 撹乱により細胞運動性を増強する）
Helicobacter pylori (H. pylori)感 染 は 胃 ・ 十 二 指 腸 粘 膜 病 変 に 深 く 関連 す る 。 な かで も cagA陽 性H. pyloriは 激 し い 萎 縮 性 胃 炎 を 引 き 起 こ し ェ 胃 癌 発 症 の 危 険 率 を 有 意 に 高 め る 。 H. pyloriの 菌 体 内 で 産 生 さ れ たCagAは 、 胃 上 皮 細 胞 内 に 注 入 さ れ た 後 、 チ ロ シ ン リ ン 酸 化 依 存 的 に チ ロ シ ン 脱 リ ン 酸 化 酵 素SHP2と 特 異 的 に 結 合 し 、 細 胞 増 殖 ・ 細 胞 運 動 を 脱 制 御 す る 。 一 方 、CagAは り ン 酸 化 非 依 存 的 にCagA多 量 体 化 （CM） 配 列 を 介 し て pamtioning‐defectivel（PARl） に 結 合 し 、 その キ ナ ー ゼ 活性 を 抑 制 す るこ と に よ り 上 皮細 胞 極 性 を 破 壊 す る 。 本 研 究 で は 、 遺 伝 的 背 景 の均 一 なisogenicH． ガ め ′f感 染 実 験 を 行い 、cnひ 陽 性H．pyめ ガ の 病 原 性 に お け るCagA―SHP2相 互 作 用 とCagA‐PARl相 互 作 用 の 役 割 を 解 明 す る こ と を目 的 と し た 。
ま ず は 、 形 質 転 換 効 率 の よ いNCTC11637株 を も と に 相 同 組 み 換 え に よ り 、cロ ひ 遺 伝 子 をCMsequenceを ー つ の み し か も た な いF32株 タ イ プ の 野 生 型CagA（wt‐CagA） 、 リ ン 酸 化 耐 性 型CagA（PR‐CagA） 、CM配 列 欠 損 型CagA（CagA‐ △CM） を コ ー ド す る 遺 伝 子 に 置 換 し たisogcnicH．pッ めrf株 を 樹 立 し た。 樹 立 し たisogenic株 のCagAの 注 入を 検 討 す る た めに 、 ヒ 卜 胃 上 皮 細 胞 由 来 のAGS細 胞 とisogenicH． ガ め 灯 株 を 共 培 養 し て0．1％ サ ポ ニ ン で 抽 出 し た 。
次 に、IsogenicH．ガ ゎ ′f株 の基 本 的 性 質 の評 価 を す る ため 、isogenic〃． ガめ ′f株 を液 体培 地 で 培 養 し 増 殖 速 度 を 調 べ た と こ ろ 、 菌 株 間 に 差 は 認 め ら れ な か っ た 。 さ ら に 、AGS細 胞 へ の 感 染 実 験 を 行 い 、H． ガ め ′f特 異 的 な 細 胞 空 胞 化 を 観 察 し た と こ ろ 、NCTCl1637株 と 同 様 にisogenicH． ガ め ′f株 感 染 に よ っ て 細 胞 空 胞 化 が 誘 導 さ れ た 。 以 上 の こ と か ら、 ゲ ノ ム の 相 同 組 換 え がisogenicH． ガ めn株 の 基 本 的 性 質 に 影 響 を 与 え な い こ と を 確 認 し た。 ま た 、 一 方 で 、CagA−SHP2相 互 作 用 とCagA‐PARl相 互 作 用 の 解 析 行 う た め に 、AGS細 胞 にisogenlc
〃 ．pッ め ′f株 を 感 染 さ せ 、 免 疫 沈 降 実 験 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 細 胞 内 に 注 入 さ れ たCagAが り ン 酸 化 依 存 的 にSHP2と 結 合 す る こ と に 加 え 、 リ ン 酸 化 非 依 存 的 にCM配 列 を 介 し て PAR1と 結 合 す る こと を 示 し た 。
最 後 に 、IsogenicH． ガ めrf株 の 病 原 性 を 評 価 す る た め に 、H．py´D灯 感 染AGS細 胞 の 細 胞 遊 走 能 を 調 べ た 。 そ の 結 果 、cロ 必 陽 性H． ガ ゎrf株 （Wt．CagA、PR‐CagA及 びCagA‐ △CM発 現 株 ） は い ず れ も 細 胞 遊 走 能 を 亢 進 さ せ た 。 な か で も 、wt‐CagA発 現 株 に よ る 細 胞 遊 走 の 亢 進 能 が 有 意 に 高 か っ た 。 一 方 、c昭A遺 伝子 を 欠 損 し たisogcnic〃 ．ガ わ ガ 株 （ △CagA） は細 胞 遊 走 能 に 影 響 を 与 え な か っ た 。 さ ら に 、H． ガ め ′f感 染 細 胞 の 細 胞 形 態 変 化 を 調 べ た と こ
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ろ 、wt‑CagA発 現 株 は 細 胞 を 著 し く 伸 長 さ せ た の に 対 し 、PR‑CagA発 現 株 とCagA‑ACM 発 現 株 は 細 胞 形 態 に 影 響 を 与 え な か っ た 。 こ れ ら の 結 果 か ら 、CagAの 病 原 性 に は CagA‑SHP2相 互 作 用 とCagAーPARl相 互 作 用 が 共 に 必 要 で あ る こ と を 明 ら か に し た 。 本 研 究 で は 、wt一CagA、PR．CagA及 びCagA‐ △CMを 発 現 す るH． ガ め ′fが 胃 上 皮 細 胞 に 与 え る 効 果 を 感 染 実 験 を 用 い て 比 較 し た と こ ろ 、cロ 必 陽 性H． ガ め ′fの 病 原 性 の 指 標 の ー っ と 考 え ら れ る 感 染 胃 上 皮 細 胞 の 運 動 性 亢 進 や 細 胞 形 態 変 化 誘 導 に お い て 、CagA‐SHP2相 互 作 用 と CagA． PARl相 互 作 用 が 共 に 重 要 な 役 割 を 担 う こ と が 明 ら か に な っ た 。 口 頭 発 表 に 続 き 副 査 今 村 雅 寛 教 授 よ りCagAの 病 原 性 に 関 し てSHP2とParlの 協 調 的 な 作 用 お よ びhummingbird表 現 型 と 癌 化 の 関 連 に つ い て 質 問 が あ っ た 。 続 い て 副 査 田 中 伸 哉 教 授 よ りCagAと 胃 癌 発 症 の 関 連 性 お よ び ヒ ト ヘ の ピ ロ リ 菌 感 染 に よ る 発 が ん メ カ ニ ズ ム の 解 明 に 向 け た 感 染 実 験 の 今 後 の 応 用 に つ い て 質 問 が あ っ た 。 最 後 に 主 査 平 野 聡 教 授 よ り 病 理 検 体 で のSHP2やPARlの 発 現 に 関 す る 報 告 の 有 無 に つ い て の 質 問 、 ピ ロ リ 菌 感 染 胃 が ん の 疫 学 的 検 討 に つ い て の 質 問 に 加 え て ピ ロ リ 菌 の 治 療 へ の 臨 床 応 用 の 可 能 性 な ど の 質 問 が あ っ た 。
い ず れ の 質 問 に 対 し て も 申 請 者 は そ の 主 旨 を よ く 理 解 し 、 自 ら の 研 究 内 容 と 文 献 的 考 察 を 混 じ え て 適 切 に 回 答 し た 。
審 査 員 一 同 は こ れ ら の 成 果 を 高 く 評 価 し 、 大 学 院 課 程 に お け る 研 鑽 や 取 得 単 位 な ど も 併 せ 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 充 分 な 資 格 を 有 す る と 判 定 し た 。
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