博士（医学）長谷川 靖 学位論文題名
Archetype の調節領域を持つJC ウイルスの細胞親和性とその解析 学 位 論 文 内 容の 要 旨
目的 JCウ イル ス（ 以下JCVと 略す ）は 、ヒ ト中 枢神 経の 脱髄 性疾患 であ る進 行性 多巣 性白質脳症（pr｜re multifocal leukoencepha．lopathy：PML）の原因ウイルスである。
従 来 、PML患 薯 麗 臓 縦 織 か ら 分 離 さyたJCV（PA ） に 関 す る 研 究 が 行 わ れ て き たが 、JCVが増 殖可 能な 細胞 がヒ ト胎 児脳 細胞 の初 ミ培 養細胞 にほ ぼ限 られ てい た 。 し か し 最 近 、JCVMad−1株 （PN ） が ヒ ト 神 経 芽 細 胞 腫 由 来 のIMR―32細 胞 で 増殖し たこ とが 報告 され 、JCVの犇 辧驚 よ びPMLの 発症機序の解明を発展させる も のと なっ てい る。 一方 、JCVは幅 広く ヒト に無 症候 性に 感染し てお り、 しば しば 尿 中に 排泄 され てい るこ とが 報告さ れ、 健常 人の 尿中 からJCVが クロ ーニ ング され た 。 こ の 腎 型JCVはarc と 呼 ば れ 腎 親 和 性 を 示 す 。JCVarc り 調 節 領 域 は ［域とは構造カ溟なることが繋驥されており、
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賭雛薬袈誤奮。しかし、腎型JC北関川ま未縣齏簾葬嘶われてお
ら ず、脳 型JCVほ ど研 究も 進められていない。そこで我々は、腎型JCV（archetype） の細胞親和性の解析を試みた。
材料と方法
1） ウ イ ル ス と 細 胞 ：DNAは 、 腎 型 （archet ）JCV株で あ るCY、PML型 のJCV株 で あ るMad―1お よ びCYの 調 節 領 域 とMad−1潟 ヰjラ で あ るJCVChimeraDNAを 用 い た 。細胞 は、 サル 腎細 胞で あるCOS一7細胞とヒト神経芽細胞腫由来のIMR−32細胞を 用 い た 。COS‐7細 胞 は10％FBS添 加MEM、IMR−32細 胞 は10％FBS添 加DMEMで 培 養 した。
2）トランスフェクション：それぞれpUC−！9の正boRIsiteでクローニングされた3型の JCVDNAをEe〇RIで 消化 後、Lipofectamine法によルトランスフェクションを行った。
3） 赤 血 球 凝 集 反 応 （ ：ion：HA） ： 感 染 細 胞 を 凍 結 融 解 に よ り 破 壊 、 遠 心 後その上清をウイルス議ど琶た11at
4） サザ ンブ ロッ ト： 感染 細胞 から抽 出し たウ イル スDNAは且刃RI単独、また正めRI とBammの 両 方 で 消 化 し た 。 プ ロ ー ブ は 、JCVCYDNAを ラ ン ダ ム プ ラ イ ム 法 に よ ル ジゴキ シゲ ニン 標識 し、 シグ ナル の検 出はHNPP―EUと反応後、Epi‐LightUV撮像 セットEU−1100（アイシン・コスモス）を用いて行った。
5） 免疫 染色 ：64日目 の感 染細 胞をカ バー ガラ スに 培養 し、4日後に冷アセトンにて 固定後、抗JCVウサギVP1抗体を用いて行った。
6） シー クエ ンス ：JCV調節 領域の増幅は、プライマーJRR−5（BamHIsiteを含む）と 瓜R−6（Ps旺siteを含 む） を用い、94℃30秒、55℃1分、72℃1分を1サイクルとして 35サ イ ク ル を GeneA System240（ PerkinElmer） を 用 い て 行 っ た 。 形 質 転 換 さ せ た 大 腸 い ち の プ ラ ス ミ ド DNA抽 出 は 、 WizardTMPlusN Punflcationsystem（PII．匸 Madison，USA）キットを用い、insertの災雲iぞ誤竃〕ダAロ ー ン を 選 択 こ 、 日 立 螢 琵 謬1ー ソ ナ ルDNAシ ー ケ ン サ ーSQ‐5500（HrrACHI冫 にて 塩基配列を決定した。
結果
1）トラ ンス フェ クシ ョン 後64日目 のHA価の 測定 を行 った ところ 、COSー7細胞 にお ―−235−
結 語 （ 脳 親 和 性 ） の
JC virusの 組 織 親 和 性 に 関 し て ｀ 卿 謬囎 馨 和 性 ） とPM： づ 紬 胞 来 細 胞 ） ウ イ ル ス 株 の 調 節 領 域 の 差 に よ る ウ ： を 、 主 に C OSCOS （ 腎 由 とIMR‑32細 胞 （ 脳 由 来 細 胞 ） と を 用 い て 解 析 し 、 次 の 結 果 が 得 ら れ た 。
2) HA価の 上昇 を示し たCY‑COS―7、Chimera―COS‑7およびMad‑l‑COS―7細胞のすべ て で、 感染 細胞 の腫 大し た核 内にVP1抗 原を 確認 し、JCVが 細胞 核内 に増 殖し てい る こと が明 らか にさ れた 。
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3) COS―7細胞から抽出されたDNAをそれぞれサザンブロットハイブリダイゼーショ ン法により解析を行ったところ、構造上大きな変化のないJCV DNAであると考えら れた。
5）ArchetypeのJCVがCOS―7細胞においてウイルスを生ずることを証明した。
学 位 論 文 審 査 の 要 旨
主 査 教 授 生 田 和 良
副 査 教 授 吉 木 敬 副 査 教 授 高 田 賢 蔵
学 位論文題名
Archetype の調節領域を持つJC ウイルスの細胞親和性とその解析
JCウ イ ル ス （ 以 下JCVと 略 す ） は 、 ヒ ト 中 枢 神 経 の 脱 髄 性 疾 患 で あ る 進 行性多巣性 白質脳症（ProgresslvemultifoCalleukoencephalopathy：PML） の 原 因 ウ イ ル ス で あ り 、 従 j、 PML患 者 の 脳 組 織 か ら 分 離 さ れ たJCV
（ PML1 に 関 す る 研 究 が 行 わ れ て き た 。 ま た 最 近 、 JCVは 幅 広 く ヒ ト に 曇 鑒 渓 性 に 感 染 し て お り 、 し ば し ば 尿 中 に 排 泄 さ れ て い る こ と が 報 告 さ れ 、 健 常 人の 尿 中 から 腎 型のJCV（archetype） が ク、 ロ ーニ ン グさ れ た 。 し か し 、 腎 型JCVに 関 し て は 未 だ 詳 細 な 解 析 は 行 わ れ て い な い 。 そ こ で 、 腎 型 JCV（ archetype） の 細 胞 親 和 性 の 解 析 を 試 み た 。 ウ イ ル ス DNAは 、 腎 型 （ archety駿 ） のJCVで あ るCY株 、 PML型 の JCVで あ るMad− 1株 お よ びCYの 調 節 領 域 とMad−1の キ メ ラ 株 を 用 い 、 サ ル 腎 細 胞 でSV40T抗 原 を 発 現 し て るCOS‐7細 胞 と ヒ ト 神 経 芽 細 胞 腫 由 来 のIMR132細 胞 にLipofec伍m弧 法 によ る トラ ン スフ ェ クシ ョ ンを 行 った 。 ウ イ ル ス の 増 殖 は赤 血 球 凝集 反 応（Hemagglun髏don：HA） に より 測 定し 、 感 染 細 胞 よ り 得 ら れ た ウ イ ル ス DNAをR（ 尉 単 独 、RdRIとBamHIの 両 方 で 消 化 し て 、HNPPを 用 い た サ ザ ン ブ ロ ッ ト に よ ル シ グ ナ ル の 検 出 を 行 い 、 さ ら にJCV調 節 領 域 の シ ー ク エ ン ス を 行 っ た 。 ま た 、64日 目 の 感 染 細 胞 を 用 い 抗JCVウ サ ギVPl抗 体 に よ る 免 疫 染 色 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 COS‐7細 胞 に お い てCYとChimeraは128HAunits、Mad−1は64HAunitsで 、 IMRー32細 胞 に お い て はMad−1の み256HAunitsで 、CYお よ びCmmeraは 検 出 限 界 以 下 （ く4HAunits） で あ っ た 。 サ ザ ン ブ ロ ッ ト の 結 果 、 正 めRI単 独 で 消 化 し た 場 合 は 約 5．1kbp、 ＆ （ 妊uとBanmIで 消 化 し た 場 合 は 約 2．5kbpの 位 置 に 陽 性 シ グ ナ ル を 認 め 、 シ ー ク エ ンス の 結果 、COS‐7に て 増 殖 し たCYお よ びChin℃raは 欠 失や 重 複な ど 変化 は 認め ら れな か った が 、 Mad‐1は 複 製 開 始 点 か ら109塩 基 の と こ ろ にGGTCと ぃ う4塩 基 の 挿 入 を 認 め た 。 ま た 、 免 疫 染 色 の 結 果 、COS−7細 胞 核 内 にVP1陽 性 で あ っ た 。 以 上 の こ と か ら 、JCVがIMR‐32細 胞 に お い て 増 殖 す る た め に は 、 調 節 領 域 がPMLtypeで 杢 る こ と が 重 要 と 思 わ れ 、COS−7細 胞 に お い て3型 が 増 殖 し た の は 、 調 節 領 域 の 違 い よ り もSV40T抗 原 の 影 響 が 大 き い も の と 思 わ れ た 。 サ ザ ン ブ ロ ッ ト の 結 果 か ら 、 抽 出 さ れ たJCVは 構 造 上 大 き な 変 化 の な いJCVDNAで あ る と 考 え ら れ 、 さ ら にCOS−7細 胞 か ら 抽 出 さ れ
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