博 士 （ 医 学 ） 長 谷 川 匡 一
学 位 論 文 題 名
酒石酸 耐性酸性フ ォスファターゼ活性陽性破骨細胞と単核細胞
一 マ ウ ス 大 腿 骨 に お け る 組 織 化 学 的 研 究 一
学 位 論 文 内 容 の 要 旨
骨吸 収を行 う多 核巨細 胞であ る破骨 細胞 は骨の 表面に あって ，骨芽 細胞と協調して成長期のモ デリ ング， 成長後 のり モデリ ングに関与する。長管骨の骨軸方向の成長に関わるモデリングでは，
破骨 細胞は 骨端軟 骨基 質の破 壊吸収 ，一次 と二次 海綿 骨の骨 梁構築 の変化 に関わるが，破骨細胞 の海 綿骨内 分布， 部位 的機能 は明瞭 には解 析され てい ない。 そこで この研 究では，成長が急速な マウ スの大 腿骨を 用い ，海綿 骨内の 部位に よる破 骨細 胞の機 能を骨 成長と 関連して形態学的に追 求し た。今 回，破 骨細 胞を明 瞭に観 察する ために ，破 骨細胞 の標識 酵素で あるといわれる酒石酸 耐 性 酸性 フ ォ ス フ ァ夕 ― ゼ(tartrate―resistant acid phosphatase： TRAP)を 組 織 化 学的 に 染 色し た と こ ろ ，単 核 のTRAP陽 性 細 胞 が骨 髄 内 に 存 在す る こ と を知 った。 破骨細 胞は骨 表 面 で 単核 の 前 破 骨 細胞 の 癒 合 に よ り生 じ ， 前 破 骨細 胞 はTRAPを 含 むと 考えら れてい る。し か し ， 骨表 面 に な い 破骨 細胞 の前 駆細胞 がTRAP陽 性かど うかは ほとん ど知 られて いナょ い。こ こ でfま TRAP陽性 単核細 胞と 破骨細 胞との 関連に も注目 した 。
材料と 方法
生 後1，2，4，8，16，24週の 雌 のdd一マ ウ ス の 大 腿骨 遠 位 半 分 を正 中 縦 割 し ，ホ ル マ リ ン 液 で 固 定 ，EDTAで 脱 灰 後 ， メ タ ク リ ル 酸 樹 脂 （Technovit7100)に 包 埋 し ，3um切 片 と し ， ア ゾ 色 素 法 に よ りTRAPを 染 色 し た 。 す な わ ち 切 片をlOOmM酒 石 酸 水 溶液 に 浸 漬 後 ，ナ フト ー ルAS―BI燐 酸 塩 を基 質 と し たpH5.0の、 ア ゾ化 パラロ ーズア ニリン 溶液 中で反 応させ ， ヘマト キシリ ンと エオジ ンで染 色，光 学顕微 鏡で 観察し た。
定 量 評 価 ： 大 腿骨 遠 位 骨 幹 端部 の 切 片 を 顕微 鏡 投 影 機 で250倍 に 拡大 投 影 し ， 骨梁 ，TRAP 陽性 細 胞 を 描 い た。 二 次 海 綿 骨を 骨 端 部 か ら骨 幹 に向か い500〃m間隔で3領 域に分 け，各 領域 での 単 位 断 面 積 あた り の 骨 梁 表面 長 ・ 破 骨 細胞 数 ・TRAP陽 性 単 核 細胞 数を 求めた 。また ，海 綿骨部 の長さ ，破 骨細胞 に覆わ れた骨 表面の 割合 ，骨梁 表面の 単位長 さあ たりの破骨細胞数，破
骨細胞の大きさも求めた。TRAP陽性単核細胞の破骨細胞との関連を調べるために，一辺が100 nmの正方形を骨髄内で骨梁の表面に接して置き，この骨髄を骨梁表面に破骨細胞が存在するも の と存 在し な いも のの各々 骨1000所に設定し，領域内のTRAP陽性単核細胞を点描し た。
結 果
1．骨梁：骨幹端部では，骨端軟骨板の骨化帯の軟骨小腔は空胞化し，縦に管状となっていた。
これらの管の間の隔壁は柱状または有窓板状に並ぷ石灰化軟骨基質であり，これに連続して一次 海綿骨では縦長の骨粱が密に並んでいた。二次海綿骨は一次海綿骨に連なり，骨幹部方向に疎ら に太く網状に伸びていた。二次海綿骨部の長さは，生後成長に伴い著しく伸びて8週で最長とな り，以後，短縮していった。二次海綿骨は4週で太くなった。単位面積あたりの骨梁の表面積を 表す単位断面積あたりの骨梁表面の長さは，生後1週から成長に伴い増加し，4〜8週で最大と ナより， 以後，加齢に伴い減少した 。骨梁表面は，骨芽細胞と破 骨細胞で覆われていた。
2．骨芽細胞：骨芽細胞は一次海綿骨の骨梁間，二次海綿骨の骨梁骨端側では大型であり，ま た加齢に伴い偏平とナょった。
3． 破骨 細胞：破骨細胞は，不 整形の多核巨細胞として骨 表面に散在し，アゾ色素法で TRAPを 染色 す ると ，胞 体全 体 が赤 く明 瞭に 染色 さ れ， 他の 細胞 と容 易 に区 別さ れた。
分布：破骨細胞は，1）骨端軟骨骨化前線，2）￣次・二次海綿骨境界部，3）二次海綿骨骨 梁の骨幹端に多く存在した。また，破骨細胞教は，骨梁表面の長さ（広さ）と同様の加齢変化を 呈し，4〜8週で最大となった。二次海綿骨で破骨細胞に覆われる骨梁表面の割合は，1〜2週 では約2割，その後しだいに増加して24週では約7割とナょった。このうち骨梁骨幹端は，各齢期 ともほば全てが破骨細胞に覆われていた。
大きさ：破骨細胞の大きさは，1〜2週では小型，4週以降は加齢に伴い大型となる傾向を示 し た 。 ま た ， 骨 化 前 線 ， 骨 粱 骨 幹 端 で 大 き く ， 骨 梁 側 面 で は 偏 平 で あ っ た 。 染 色 性 ： TRAP活 性 は 骨 化 前 線 ， 骨 梁 骨 幹 端 の 大 型 の 破 骨 細 胞 で 強 か っ た 。 4． 骨髄 内TRAP陽 性 単核 細胞 ：TRAP陽 性 細胞 は骨 髄内 に も見られた。この細胞は単核 で，直径 約10 umの楕円・紡錘・不整 形の胞体を示し，胞体全体にTRAP活性反応を認めた。
この細胞に核分裂像は認められなかった。
分布： TRAP陽性単核細胞は，骨髄 内で骨梁の存在する部の骨端側に多く，4〜8週で最多 となる加齢変化を呈し，分布・加齢変化は破骨細胞と同様であった。分布を，破骨細胞が存在す る骨梁と存在しない骨梁の表面に接する100〃m四方の骨髄領域内にこの細胞を点描した像で比
較 す る と ，TRAP陽性 単 核 細 胞 は破 骨 細 胞 が 存 在す る 側 の 領 域に 約10倍 多かっ た。す なわち TRAP陽 性 単 核 細 胞 は ， 破 骨 細 胞 に 近 い ほ ど 多 い こ と が 判 明 し た 。
考 察
1．長管 骨の成 長に 伴う海 綿骨の 軸方向 の変化
今回 ， 破 骨 細 胞は 海 綿 骨 内 で，3力 所 ， すな わ ち1)骨 化前線 ，2)一 次・二 次海綿 骨境 界部，
3)骨梁 骨 幹 端 ， で活 発 に なる ことを 明かに した 。この ような 結果， およ び骨芽 細胞， 骨梁の 太 さ， 密度か ら，海 綿骨 での骨 梁の形成，消失は次のように理解される。骨端軟骨の骨化前線では，
破骨 細胞が 軟骨小 腔に 進入し て軟骨基質を吸収し，軟骨小腔は壁に穴の開いた管状に縦に連なる。
この 管の内 表面に 骨芽 細胞が 出現し て骨化 が始 まり， 一次海 綿骨が 形成さ れる。一次海綿骨の配 列と 密度は ，軟骨 柱と 一致す ることになる。一次海綿骨では，骨形成が骨幹側ヘ進み，骨梁は徐々 に太 くなっ て隣接 骨梁 と所々 で融合 するよ うに なる。 同時に ，この 部で破 骨細胞による骨吸収が 進み ，粗く 太い骨 梁の 二次海 綿骨が 形成さ れる 。一方 ，二次 海綿骨 の骨梁 骨幹端は破骨細胞によ り 吸収 され消 失し ていく 。この ，a)骨 化前線 でfま，破 骨細胞 が最初 に出 現しっ いで骨 芽細胞 が 出 現す ること ，b）骨梁 骨幹 端は大 部分が 破骨細 胞に 覆われ 常に骨 が削ら れてい るこ とは， 骨芽 細胞 は破骨 細胞の 出現 前に存 在し破 骨細胞 の出 現に関 わると する今 日の一 般的見解とは異なる。
骨 の モ デ リ ン グ は ， 破 骨 細 胞 は 骨 芽 細 胞 か ら 独 立 し て 機 能 す る と 考 え ら れ る 。 2．海綿 骨のカ[]齢変 化
今回 の研 究によ り，海 綿骨は 加齢と 関連 して， 骨梁の 太さと長さの2っの変化を示すことを知つ た 。す なわち ，1）生後 早期 は骨吸 収，骨 形成が 平衡 し，骨 梁は細 い（骨 形成骨 吸収 平衡期 ）。
2）4〜8週 では， 骨形 成が優 位とな って， 骨梁は 太く ，長く ナょる （骨形 成優位期）。一方，3‑) 16〜24週では 骨形成 よりも 骨幹 端での 骨吸収 が優位 となり ，骨 梁は短 くなっ ていく（骨吸収優位 期） 。
3． TRAP陽性 単核細 胞と関 連して ．
TRAPは 破骨 細 胞 に 特 有な マ ー カ ー と みな さ れ て い る。 今 回 ， 破 骨細 胞付 近の骨 髄中 には，
同 じTRAPを 含 む単 核 細 胞 が 多数 分 布 す る こと を 発 見 し た。 今 日 ， 多 核の 破骨細 胞は， 単核 の 前駆 細胞の 癒合で 生じ ，その 前駆細 胞は血 液原 性でマ クロフ ァージ と共通 な前駆細胞に起源する と 考 えら れ て い る 。 最近 ， 骨 膜 にTRAP陽 性単 核 細 胞 が 出現 す る こ と が知 られ， 単核の 破骨 細 胞 の 前駆 細 胞 は 骨 表 面でTRAP陽 性 の 前 破 骨細 胞 と な る とい わ れ て い る。 しかし ，今回 のよ う に 骨 表面 か ら 離 れ た 骨髄 内 にTRAP陽 性 単 核細 胞 が 存 在 ・分 布 す る こ とに っいて はほと んど 知
ら れて おらず ，この 細胞の 骨表面 から 離れた 部位で の存在 に注 目した ものとしては今回が最初で あ る 。 今 回 ，観 察 さ れ たTRAP陽 性 単核 細 胞 は ， 破骨 細 胞 の 付 近に 多く， 海綿骨 内で破 骨細 胞 と 同 様 の 分 布・ 加 齢 変 化 を 呈し た こ と か ら， 前 破 骨 細 胞に あ た ると考 える 。破骨 細胞とTRAP 陽 性単 核細胞 との位 置的関 連は， 破骨 細胞存 在部に ，この 単核 細胞の 分化，増殖，あるいは遊走 因 子が 存在す ること 示唆し ，この 因子 は破骨 細胞存 在部で 生じ る拡散 可能な特異物質であること を 推察 させる 。
結 語
マ ウ ス 大 腿骨 の 海 綿 骨 に おけ る 酒 石 酸 耐性 酸 性 フ オ スフ ァ タ ー ゼ(TRAP）活 性 陽 性 細 胞 の 分布と 加齢変 化を 追求し ，次の 結論を 得た 。
．1，TRAP陽 性 多核 破 骨 細 胞 の 知覚 の 骨 髄 にTRAP陽 性単 核 細 胞 が みら れ た 。 こ の こと は ， 破 骨 細 胞 存 在 部 に 破 骨 細 胞 前 駆 細 胞 の 分 化 ， 増 殖 遊 走 因 子 が 存 在 す る こ と を 示 唆 する 。 2． 破骨細 胞は 一次と 二次海 綿骨の 骨梁構 築に 妥当な 分布を 示す。
3．破 骨細胞 の出現 と分布 は， 骨端軟 骨の骨 化前線 と骨梁 骨幹 端では ，破骨 細胞は 骨芽 細胞か ら独立 して機 能す ること を示唆 する。
4． 海綿骨fま ，加齢 に伴 い骨形 成骨吸 収平衡 期期， 骨形 成優位 期，骨 吸収優位期の順に経過す る。
学位論文審査の要旨
こ の研究 は，近 年，破 骨細 胞のマ ーカー 酵素と して認 めら れてい る酒石酸耐性酸性フオスファ ター ゼの 存在を 骨組織 で組織 化学的 に染 色し， 長管骨 の骨幹 端海 綿骨における破骨細胞の分布お よび ，そ の加齢 変化を 検索し たもの であ る。こ れまで 破骨細 胞の 形態や機能は，骨表面の微小局 所で 論じ られて きたが ，この 研究で は， 海綿骨 全体で の広い 視野 に立って，破骨細胞の骨成長，
海綿 骨に おける 骨梁の モデリ ング，リモデリングにおける役割を知ろうとしたことに特徴があり，
志
郎
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一
清 和
征
田
嶋
本
金 長
藤
授 授
授
教 教
教
査 査
査
主 副
副
また ，本研 究によ り，骨 髄内に 酒石 酸耐性 酸性フ オスタ ーゼ(tartrate―resisitant acid phos・ phatase： TRAP） を も つ 単 核 細 胞 を 発 見 し た こ と は ， 新 し い 所 見 で あ る 。 こ の 研 究 では， 材料と して， 生後1から24週ま での雌 のマウ スを用 い， 大腿骨 の遠位 部をホ ル マ リ ン 固 定 ，EDTA脱 灰 後 ， メ タ ク リ ル 酸 樹 脂 に 包 埋 し ，3um切 片 と し て ア ゾ 色 素 法 で TRAPを 染 色 した 。 こ れ を 光学 顕 微 鏡 に より 観 察 す る とと も に ， 各 標 本で ， 破 骨細胞 の分布 ， 数 ，大 き さ を 骨 梁 の形 態 ， 表 面 積と 関 連 し て ，定 量 的 に 解 析し た 。 ま た ，TRAP陽性 単核細 胞 の 分布 も ， 破 骨 細 胞の 存 在 部 位 と関 連 し て 解 析し た 。 そ の 結果 ， 次 の こ と が明か とな った。
1． 破 骨 細胞は ，各 齢期と もに海 綿骨全 体に分 布し ていた が，と くに骨 端軟 骨骨化 前線， 一次 と二 次海綿 骨境界 部，二 次海綿 骨骨 梁の骨 幹端に 多く存 在し た。こ の分布 は，海 綿骨骨梁形成の 際に ，骨端 軟骨を 削り骨 化の場 をっ くる。 一次海 綿骨の 微細 な網を 二次海 綿骨の 粗い網にする。
二次 海綿骨 を骨端 則から 削って いく ことを 説明し ていた 。ま た，部 ，数， 大きさ 等は，海綿骨構 築の 加齢に よる変 化も説 明して いた 。これ らの加 齢変化 は， 海綿骨 が全体 として ，骨形成骨吸収 平 衡 期 ， 骨 形 成 優 位 期 ， 骨 吸 収 優 位 期 の 順 に 変 化 し て い く こ と を 示 し た 。 2． 破 骨 細胞の 機能 では， 近年， 多くの 研究は ，リ モデリ ングと 関連し て， 骨表面 微小局 所で の 骨芽 細 胞 との協 調(coupling） ，とく に，破 骨細胞 機能 が骨芽 細胞機 能によ り調 節され ている こと に注目 してい る。論 文中， 申請 者は， 破骨細 胞は骨 化前 線では 必ず骨 芽細胞 に先行して出現 する こと， 二次海 綿骨骨 梁の骨 幹端 の大部 分を覆 ってい るこ とに注 目し， これら の部では，モデ リン グと関 連して ，破骨 細胞は 骨芽 細胞から独立して機能している可能性にも視点を向けている。
3． こ の 研 究でtま ， 骨 髄内 にTRAP陽 性 単 核 細胞 が 出 現 す る こと を 発 見 し ，こ の単核 細胞は 破骨 細胞が 存在し ない骨 表面近 くに 比べて ，破骨 細胞存 在部 の近く に多い ことを 証明した。これ ま で， 骨 表 面 にTRAP陽 性 単核 細 胞 が 出 現す る こ と は 知ら れて おり， このよ うな細 胞Iま前破 骨 細胞 である と考え られて いる。 この 研究は ，この ように 前破 骨細胞 に相当 すると みなされる細胞 が骨 髄中に も出現 するこ とを， 示し た最初 であり ，破骨 細胞 の由来 ，分化 ，およ びこれに関連す る液 性因子 の存在 を考え ていく 上で ，重要 な新知 見であ る。
この 研究は ，組織 化学 による 所見を 形態学 的に綿 密に 観察， 解析し ，骨組 織形 成，骨吸収と骨 形成 との関 連，破 骨細胞 の由来 等， 多くの 問題に っいて の新 しい視点，知見を示し，論文fまこれ らの 複雑な 問題を よく整 理して 明瞭 にまと めてい た。口 頭発 表に際 し，長 嶋和郎 教授から，破骨 細 胞はTRAP陽性 単 核 細 胞 の癒 合 に よ り 生ず る か 否 か ，破 骨 細 胞 の タ ーン オ ー バー， 破骨細 胞 が骨 芽細胞 から独 立して 機能す ると する根 拠，破 骨細胞 の大 きさと 機能の 関係に っいて，小野江 和 則教 授 か ら ， 破 骨細 胞 は 単 核 細胞 食 細 胞 系 （mononuclear phagocyte system）由 来か 否か
に っ い て ， 藤 本征 一 郎 教 授 から ， 雌 を 選 択し た 理 由 ， 雌雄 差 ， 破 骨細 胞のTRAPの染色 性と 機 能 との 関係， 破骨細 胞の大 型化 と機能 亢進と の因果 関係， 骨幹 端部の 骨における破骨細胞の波状 緑(ruffled border)の 向き にっい て，そ れぞ れ質問 があっ たが， 申請 者は概 ね妥当 な解答 をし た 。そ の後， 申請者 は，長 嶋和 郎教授 ，藤本 征一郎 教授か ら個 別に審 査を受け，合格と判断され た 。
本研究 は，マ ウス大 腿骨 におけ る成長 期の破 骨細 胞の海 綿骨内 分布を 調べ，破骨細胞の部位的 機 能を 明かに し，さ らに酒 石酸 耐性酸 性フオ スプァ ターゼ 活性 陽性多 核破骨細胞の近くの骨髄に 酒 石酸 耐性酸 性フオ スファ 夕一 ゼ活性 陽性単 核細胞 が分布 する ことを 発見し，この分布の理由を 考 察し たもの である 。近年 骨粗 鬆症の 研究が 老齢社 会化と 関連 して， 重要となっている。本研究 は ，骨 粗鬆症 の研究 の基礎 とな る骨吸 収・骨 形成の 理解に ，骨 組織を 広い視野から追求していく こ との 重要性 および ，この 分野 での新知見を示したものであり，博士の学位に値すると認定した。
