関す 基礎 的研究 移植 牌 内肝組織片

金沢 大 学 十 全医 学 会 雑誌 第9 9巻 第¹ 号 5 9 ⁻8 1 く1 99 0コ

牌

内肝 組 織 片

的 研 究

金沢 大 学 医 学 部 外科 学 第，^一講座 く主 任^こ岩 喬 教 掛

席 瀬 宏

く平 成²年1 月1 3日受 付1

ラット牌 内肝 組 織 片 移 植^にお け る移 植 片作 製 法巨細 胞 動態お よ び生 者促 進 因子に つき検 討し た^． Fe ulge n⁻D N A 顕 微 蛍 光 測 光 法に よ り， D N A ヒ スト グ ラ^ムを作 製^{し た． ま た}， 抗br o m ode o xy^{u r}id i⁻

n e モ ノク^{ロ ー} ナ^ル抗 体を 用い た免 疫 組 織 化 学 的 方 法^によ り， D N A 合 成 斯 くS宴剛 細 胞の割 合 くL，I^．J を 求め た^． 移植 片作 製 法^の検 討で は， 鋏によ る細切と， コ ラ ゲ ナ ^ー ゼによ る酵 素 消化 法の併用によ り， 生 存 率， 収 量と も良 好な肝 組 織 片 源 液が得ら れ た． 移 植 前， 肝 組 織 片は大 部 分4 倍 体 D N A 重 く^tetr aploid chr o m o s o m al c o m ple m e nt_，4 Cl を持つ肝細 胞で構 成さ れ ていた^． 移植 後 早 期^の牌 内 肝 組 織 片^の D N A ヒ スト グ ラムは， 4 C 以下^の広^い範 囲^に分散し た^． 移植 後^{6 ケ}月以降^の脾 内 肝細 胞は集 団と なっ た． こ の肝 細 胞^{の D N A} 畳は 4 C が主であ^っ た が ， 8 倍 体 D N A く^{o cta}ploid chr o m o s o m al

C O mple me nt_，8 Cl を持つ肝 細 胞が1 0％程 度を占め た^． S期細 胞^の割 合は， 移植 直 後よ り1 2 ケ月 後ま^で，

低 値の ま ま ^一 定^に推移し た^． 肝 切 除によ り， 宿 主肝 細 胞^の L．L は著 明^に増 加し た^． ま た ポ リ プ^ロイ ド化 が進 行し た^{． 一} 方， 移植 後 早 期の脾 内肝 組 織 片の細 胞動 態は， 宿主肝 切 除^によ り影 響を受け な^かっ た^． し か し， 移植 後¹2 ケ月 目^の脾 内 肝 細 胞 集 団は， 宿主肝と同様^の細胞 動 態を 示 し た． 四塩 化 炭 素^{によ り}急 性 肝 不 全^を作 成す る と， 宿 主 肝^の軽 度^の L．I． の増加お よびポ リ プロイ ド化が認め ら れ た^． しかし^，牌 内

に移 植さ れ た肝 細 胞の細 胞 動 態に は変 化が な かった^． イ^{ン ス}リ^ン， グルカゴ ン， ヒド^{ロ コル}チ ゾ^ン， 小 腸 抽 出 液， 脾臓 抽 出 液を肝 組 織 片濾 液 内に添 加し て移植^を試み た が， 脾 内移 植 肝組 織 片^の細 胞 動態^に影 響を及ぼ さ な かった^． し^かし生 者 面 積を比 較す る と， イ^{ン ス}リ^ン添加お よ び7 0％宿主肝 切 除^によ り， 牌 内 移 植 肝 細胞の生 者は促 進さ れ た^． 以 上 の成 績よ り， 牌 内^に再構築さ れ た肝 細 胞 集 団は， 宿 主 肝^と同様 徐々 に ポ リ プ^ロイ ド化が進 行し ていること が判 明し た． 移 植 時^に肝 細 胞 濾 液^にイ^{ン ス}リ^ンを加え る か，

肝 大 量 切 除を行う と， 脾内^に移植さ れ た月輔 弼互集団^の再 構築が促進さ れ た^． ま た移 植 直 後^の急性 期^では， 脾 内肝 組 織 片は各 種 肝 再生促 進 国子の影 響を受け るに至っ て いな^いが， 慢性 期で は， 牌 内^に再 構 築さ れ た 肝 細 胞 集 団は， 肝 再 生促 進 因子^に対す る応 答 能を獲 得し て^いる も の と考え ら れ た^．

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K ey ^{w o r}ds 牌 内肝 組 織 片 移 植^， 肝 再 生 因 子^{， br o m od e o x}y^{u r}idin e， F e ul_ge n⁻

D N A 顕 微 蛍 光 測 光 法

現在， 肝 不 全に対す る治療と し て， 各 種人 工肝 機 能 補助 装 置の使 用， 血祭 交 換な ど が行わ れ て^いる^{り． こ} れ ら は 主に有 害 物 質の除 去を目 的と し ており^， 肝 臓^の もつ代 謝 機 能の補 助^には， 生体 肝^の持^つ酵 素 系^によ る 代 謝経 路を利用 す る以 外 方 法は な^い ． し か し本 邦で は_， 脳 死 体 肝 移 植^に対し て^いま だ社 会 的 同 意が得ら れ

ていない．

一 方 生体 部 分肝 移 植も試みら れ^{つ つ} あ る が， 現 在 論 議の最 中^であ る^．

ところ で， 肝 臓は本 来非 常^に再 生 力^の旺盛な臓器^で あ る^こと が知ら れ ている^． そこで， 肝 臓^から肝紳 胞を 分 離後 再び 生体 内^に移 植し， そ れ が生 者， 増 殖し て機 能す れ ば， いわ ば第^二の肝 臓と して肝 臓 機 能の補 助が

A b br e viatio n s こA B C ， a Vidin⁻b iotin ⁻p^{e r OX} yda s e c o m plex ニA F P， al_phafetop^roteinニA ． U ．

，

a rb itr a ry ^{u n}i_{t 三}Brd U，5⁻br o m o⁻2^，−de o xy^{u r}idin eニ2 C ，di_ploid chr o m o s o m al c o m ple m e nt ニ4 C，

tetr aploid chr o m o s o m al c o m ple m e mt ニ8 C ， O Ctaploid chr o m o s o m al c o m ple m e nt ニC C 14_，

瀬 60

可宙削^こな る と考え ら れ る^．

肝 臓を締 切し， 種^々 の部 位 ^に移 植す る試み は R ib be rt を喘 矢と す る²t そ^の衡 水 戸^{2 ト 5 1}，J 順 ら⁶¹が 実 験 的^{にラッ ト}脾 内^に肝 細 胞を生 者さ せ ^こと^に成 功し て以 来， 脾 内 肝 細 胞 移植^が主流と なった^{． こ の}脾 内 肝 細 胞 移植^に関し て さ ま ざ ま^の報 告が な さ れ た が^， そ れ ら は形 態 学 的 変化^， 代 謝^の変 化^に着 目し た も の が主あ り， 移 植 肝 細 胞^の細 胞 動態を検 討し た研 究は き わ め て 少な^{い ．} 本研 究^では， 移 植 肝 細 胞^の細 胞 動 態^を検 討す る と と も^に， そ れ を指標と し^て移 植 肝 細 胞再 生増 殖 促 進 因子 を検 討し た^． ま た移植 肝細 胞^が宿主肝 細 胞^にお

よ ぽ す影 響^{に つ い}て も検 討し た^． 材 料^およ び方 法

王， 実 験 動物

近交 系^の雄 性^{W ista r} 系ラッ トく1 0 ^へ1 2適 齢^， 静 岡 実 験 動 物 農 業 共 同組 合^{よ り 入}割 を使用 し た^．

II ^． 実 験 方 法

1 ^． 肝 組 織 片 濾 液^の調 整

6時 間 絶食 後^{Sod iu m pe ntoba rb ita1 4 0m g}lkg を腹

腔 内 投 与^{し た． 上}腹 部正中 切 開^にて開 腹， H iggin s⁻

Ande r s o n の方 即 に従^い肝 左 外 側 葉^， 中 葉 切 除 く約

7 0％1 を行^っ た^． た だ ち^に2 4ゲ^ー ジ鄭 犬針を切 除 肝^に 乱 刺し て0 ^．1％^コ ラ ゲ ナ ^ー ゼI V 塾 く^{S igm a，St−Lo uis，} 米 馴 を添 加し た C^a十十， M g

＋＋ 無 添 カロ H ^{a n}ks 液 くWh it take r， Walke r s ville， 米 国，で濯 流す る^こと^によ り血 液 成 分を除 去し た^． 眼 科 用 鉄^にて締 切^し径 約¹

m m 前 後と し，9 5％02 十5％C O2 を投 与し な が ら同 漂 流 液 中で低 速凍押し て， 3 7⁰C， 2 0分 間イ^ンク^{ベ ー} 卜 し た． つ いで これ を ^一重メッ シ^ュガ ^ー ゼにて源 過し，

得ら れ た濾 液を^{4 0}Cの C^a＋十，M g

＋＋ 無 添 加 ^{H a nks} 液

にて 2 回遠心洗 浄 く^{8 0 0r}p^{m ，}1 翻 し た ものを移 植 用 肝 組 織 片濾 液^{と し た． Tripa n blu e を 用いて}染 色し肝 細 胞^の生 存 率を検 討し た と^ころ平 均^{8 5．3}％であ^った一 得 ら れ た肝 細 胞 濾 液は， 肝 細 胞 数 個^へ 十 数 個^の集 団と なって^いたく囲 い^{． 一 匹 の ラットから}約1 0⁸個の肝 細 胞 が得ら れ た^■ 開 腹^から肝 組 織 片 濾 液 作 成^{ま での}時 間は 約3 0分であ^っ た^■

2 ^． 移 植 方 法

sod iu m p^{e n}toba rbi^ta1 4 0m glkg を腹 腔 内 投与^し，

妄 D A B ， 3 ，3^，−dia m in obe n zidin ei H E ， h e m ato xylin a nd ^{e o s}in e芸 L． I．，

1ab^eling ind e xi S 期， D N A 合 成 凱 ^{光 頭，光 学 顕 微 鏡}

tet^{r a c}hlo r o c a rbo n

牌 内 肝組 織 片移 植^の研 究

上腹 部正中切 開^にて開 腹， 脾 臓 下 極よ り2 3 ゲ ^ー ジ針を 上極 方 向^に向け刺入， ゆ^っく り と抜 去し な が ら肝 組 織 片 濾 液0^．2^mlく約1^．OXl O⁷個1 を注入 し た^．

3 ^． Fe ul_ge n 頗 微 蛍 光 測光 法

標 本は 3 6 時 間 Pe a s e の中性 緩 衝ホル マリン液^8Iに て固 定 後， パラ フ ィ ン包増 し た ． Fe ulge n 染 色は E oi ke らの方 法^9Iに従^って行った^． す な わ ち1 2ノ^上の パ ラフ ィ ン切 片を キ^{シ レ ン}ーア^{ル コ ー ル}系列^にて脱^パラ フ ィ ンし， 水 道 水 中^で水 洗し た^．3 7⁰C I N 塩 酸 中で1

分 間， 6 0⁰C I N 塩 酸 中で 7 分 間，3 7⁰C I N 塩 酸 中で 1 分 間反 応させ _， D N A の加 水 分解を行^っ た． 蒸 留 水で 洗 浄 後 ， Cold Sch iff 試 薬 く和 光 ， 大 阪1 3 0ml＋ So r e n s e n の グ リ^{シ ン}緩 衝 液 くpH 2^．2引8 7 0^ml＋1 5％メ タ重亜硫 酸ナ ト リ ウ^ム溶 液1 0 0ml を混 合し た染 色 液 中^に室 温で 4 時 間 反 応さ せ た^． そ の後， So r e n s e n の グ リ^{シ ン}綬 衝 液 くpH 2．2即と1 5％メ タ重亜硫 酸^{ナ ト リ} ウ^ム溶 液を 9 ニ1 の割 合^で混合さ せ た洗 浄液で1 0分づ つ4 回洗 浄し， 水 洗， 脱 水， 封入 し た^． な お， スラ イ ドグラ^スお よ び封入材^には無 蛍 光^のも^の を使用 し た^． その後， 藤田 の方 法^{1 0Iに}従^い， 非 特 異 蛍 光を減 弱 ある いは消 失さ せ る た め， 晴天 下 の自 然 太 陽 光線 下^に約3 日間曝 光し た^． 蛍 光 顕 微 測 光は， 落 射 式 蛍 光 顕 微 鏡 Sta nda rd 1 8 型 く^{Zeis s}，O be rko che n，西 独1 ^に，顕 微 測 光 装置 N iko n P lく日本 光 学，東 京l を と り^つ け てお こ な ^った^． 水 銀ランプ光 源か ら ， 励 起フ ィ ル タ ^ー G くI F 5 0 0^一旬5 5 01 く日本 光 学1 お よ び 吸光フ ィ ルタ ^ー を通し

て緑 色励起 光を選 択し， ダイ ク ロ イ ッ ク ミ ラ ^ー くD M 5 7 51 く日本 光 学1 を経て Feulge n 染 色 標 本^に照 射

し た^． 蛍 光 顕 微 鏡 下で見る と， 核は明らかな赤 色 蛍光 を発し たく図21^． 放 出さ れ る赤 色 蛍 光を， 吸収^フィ^ル タ^ー くピ^ー ク値6 2 0n m H 日本 光 学1 を通じ て測 光し た^． なお， 顕微 測光 装 置 N iko n P l では， 1 個^の核の測光

に際し自 動 的^に1 0 回^の測 定を く り返し， その平 均 測光 値が表示 さ れ る機 構^に なっ ている^． 測 光^にあたっ て は， プレ パラ ^ー ト を手 動で操 作し， 肝 細 胞を各 例 1 0 0^ノー2 0 0個 測 光し， 細 正博 博士 く金 沢大 学 第^二病 理1 作 製^の プロ グ ラ^{ム1 11} で_， パ ^ー ソナ^{ル コ ン}ピ^{ュ ー} タ^ー P C ⁻9 8 01V M 2く日本電 気1 を 用^いて解 析し た^． な お， 変性， 壊死^に陥^っ た細 胞や， 切 片上^に核^の一部 しか入って^いないと考え ら れ る細 胞は， 測 光^の対 象^か ら可 能な限り除 外し た^． なお ， 蛍 光 顕 微 鏡下で単 核，

多核 細 胞を区別す るのは困 難な た め， 両 者を区 別せず 核^一 個 当た りの蛍 光量 を測 定し た^． 肝 細 胞と， そ れ 以 外の リン パ球 系細 胞， 間英 系 細 胞 等の区 別は蛍 光 顕 微 鏡下 で は容 易^であ^っ た^．

蛍光 測光のコ ント^{ロ ー ル}と し て， 各 例ご と^に組 織 中

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のリン パ球の核を3 0^ノー5 0個 測 光し， その最頻 値を 2 倍 体 D N A 量 くd iploid chr o m o s o mal c o mple m e nt_， 2 Cl と し て 用^いた^． Fe ul_ge n 染色の染 色 性や減光 処 置

の程 度^によって， 標 本ご と^に核が発す る蛍 光^に強 弱が あ る た め， 核D N A 量^の測 定デ ^ー タ の数 値は相対 的な ものと な る． そ の た め核 D N A 量の測 定 値を， 各標 本

のリ^{ン パ}球よ り求め た 2 C の値で除し， お の お のを仮

の共 通 単 位 系 く^{A． U．} 単 位^{ニ a rbitr a r}y u nitl で表し，

これ を横 軸^に， 核の個 数を縦 軸^にとって D N A ^{ヒ ス} ト グ ラムを作 成し た^．

4 ． 5⁻br o mo⁻2^，−de o xyu rid in e くBrd Ul ^に よ る D N A 合 成 期 くS 期さ 細 胞 標 識 法 く酵 素 抗 体 法1

Brd U は， 生 理的食 塩 水に溶 解し， 犠死1 時 間 前に 50m gハくg を ラットの腹 腔 内に投 与し た^． 摘 出し た臓 器は中性 緩 衝^{ホ ルマ}リン液 中^で3 6時 間 固定 後^パラフ ィ

ン包埋 し， 染 色^に供し た．

染色は脱^パラフ ィ ン後， 3 7⁰C4 N塩 酸 中で3 0分 処理 し， D N A を変 性さ せ^二重 鎖D N A を単 鎖D N A と し た． 瀾 酸 緩 衝 液^にて中和 後， 0．3％ 過 酸 化 水 素 加メ タ ノ ^ー ル に3 0分 反 応さ せ内 因性^{ペ ル}オ キ^シダ^ー ゼ活 性を 阻止 し た． 次^にウマ正常血清^に3 0分 反応さ せ， 非 特 異 反 応の減 弱を計^った^． その後， 1次 抗 体 く抗5⁻br o^． m o⁻2^，−de o xyu ri din e モ ノク^{ロ ー} ナ^ル抗 体， 2 0倍 希 釈1 くD A K O，G lo str up，デ^{ンマ ー} クl に4^OC で ^一晩， 2次 抗 体 くVe cto r， Bu rling^{a m e，} 米 国ン ^に室 温で 3 0分 ，

a vidin^．b iotin⁻pe r O Xida s e c o rn ple x くA B Cl 試 くV E C T A S T A I N砂A B C K itJ くVe cto rl ^に室 温で3 0分

反応さ せ た． 次^に過 酸 化 水 素 加ジ ア ミノ ベ ンチ ジン

く3，3^，．d ia min obe n zid in e，D A Bl 溶 液^に入 れ， 光 学 顕 微 鏡 く光顕I 下^に観 察し な が ら反 応を^{お こ}な ^った^． 水道 水

F i_g．2． Fe ulge n stain of intr a sple nic hepato cy t⁻ e s six m o nths afte r tr a n spla ntatio n． Nu clei

shed 幻u o r e s c e n c e．