管 関す 基礎的研究 妊症対 策 経頸 的胚移植

26

金 沢大 学 十 全 医学 会雑 誌 第

1 0 1

巻 第

1

号

2 6

^‑

3 3

(

1 99 2

)

不妊 症 対策として の経 頸管的 胚 移植 ^に関 す^る基礎 的 研 究

金 沢 大 学 医学 部 公 衆 衛 生学 講 座 (

^主

任^: 岡

田

晃 教 授)

本 保 喜 康

( 平 成

4

年

1

月

7 日

受 付)

ヒ ト体 外 受 精

お よ び

胚 移 植

( H u m a n i n

‑

^{v i}

^t

^{r o f e r}

^t

^{ili z a}

^t

^{i o n a n d e m b r}

y

o

巾

a n s f e r

, ヒ ト

I V F

‑

E T )

^に

お

け

る

低 成 功 率 (

1 0

‑

20

% ) の原 因^{の 一}端

^を

解

明

す

^{る た め}

^に,

B D F

l雌^マ

^{ウ ス}

^の胚

を

, ヒ

ト

体 外 受 精 胚

と

同 様^に経 頸 管 的に偽

妊

娠

I C R

雌^マ

^ウ

^{ス の}

子

宮

へ移 植

した

^･

2 6 ゲ

^ー

ジ

の腰椎穿 刺針

を

改 造

し た

胚 移 植 用 器 具 内^に

¹

^.

⁰

^‑

¹

^.

⁵

〃

】

の培 養 液

と

共^に

5

^‑

1 5

個の胞 胚

を

浮 遊

し

, 交 尾 後 第

³

^･

¹

/

^{2 日}

^{目の レ}

^シ

^{ピ ア}

^ン

^トマ

^{ウ ス}

(

³

^･

¹

/

2 日

^レ

^シ

^{ピ ア}

^ン

ト) ^の

子

宮 下 部^へ移 植 す

る と

l 最 良^の着 床 率

6 4

% (

^{1 26}

/

^{1 9 8}

)

を

得

た

^{･ こ の}着 床 率

は

▲ 経 腹 壁 的^に子 宮 腔^へ胚

を

移 植

し た

諸 文 献^に

お

け

る

着床 率(

^{7 0}

^‑

^{7 5}

% )

^{お よ び}

本 実 験^で経 腹壁 的に卵 管 内

へ胚 移 植

し た

際^の着 床 率

^{5 6}

% (

^{8 5}

/

^{1 5 0}

) ^に比

し

大 差

が な

い. こ

れ

^に対

し3

^.

0

〃

1

以

上

^の培 養 液^に浮遊

し て 3

^･

1

/

2 日 レ シ

ピ ア

ン

ト

に移 植

^{し た}

胞 胚^の着 床率

は 0

%

( 0

/

^{1 0 4}

),

1

^･

0

^‑

Ⅰ

^,

5

〃

1

の培 養 液^に浮 遊

し 2

^･

1

/

^{2 日 レ シ}

^{ピ ア}

^ン

^{ト に}移植

^{し た 2}

細 胞 期 胚

^か

ら 桑実 胚^の着 床 率

は 0

･

7

% (

1

/

^{1 37}

)

^と

低 値

で

あ^っ

^た

^. 次^い

^{で イ}

^ン

^ジ

^{ゴ カ ル ミ}

^{ン で}

青 色

^に

染 色

し

胚

を

浮 遊

し な

い培 養液

を

同 様 な 条 件

^で

子宮 内^へ注

入 し て

^一時 間後^{に観 察 す}

^{る と}

, 培 養 液

^は

子 宮^口

よ り

流 出

し

て い

た

^.

ま た 3

^‑

4

細 胞 期 胚

^{を 2}

^･

¹

/

^{2 日}

^{レ シ}

ピ ア

ン ト

に経 頸 管 的

に

移植

し

, 交尾 後 第

^{4 日 目}

^の早 朝^に

^子

宮 内

^を

還 流 (

^{fl u s h}

法) す

る と

, 移 植 胚の

1 0

% (

³

/

^{3 0}

) ^の

み が 回

収

さ

れ

^た

^･ す

な わ ち

着 床 率 急低 下^の原 田

と し て

移 植 胚^の殆

ど が

着 床 前

に

子 宮 腔

か ら

排 出

さ れ る

^こ

と が

示 唆

さ れ た

. 次^{い で}, レ シ ピ ア

ン

ト^マ

ウ ^ス

の腹 腔 内^へβ2

S

t

i r n u l a n

t であ

る リ

ト

ド リ ン

(

r i

t

_o d r i n e

)

^を

注

^{入 し}

, 子 宮 収 縮 抑 制

を

試

^{み た}

^.

2

^‑

4

細 胞 期

^{胚 と} 2

^･

1

/

^{2 日}

^{レ シ}

^ピ

^ア

^{ン ト}

^の組

^み

合

^{わ せ で}

,

リ

ト

ド リ ン を

使 用

ま た は

使 用

し

な^い場 合^の着 床 率

は

, 各

^々 0

% (

0

/

^{4 6}

^),

^{お よ び}

1

% (

¹

/

^{8 9}

)

で

あ^っ

た

^{･ 一} 九

8

^‑

1 6

細 胞 期胚

と 3 日

早 朝^レ

シ

ピ ア

ン ト

^の阻

み

合

^{わ せ}

^で

^は

,

リ ト ド リ ン を

使 用

ま た は

使 用

し な

^い 場 合の着床 率

ほ

各

^{々 9}

% (

⁷

/

⁷⁵

),

お よ び 0

% (

⁰

/

^{9 0}

) ^であっ

た

. 後 者^の組

み

合

わ せ

で

ほ リ

ト

ド リ ^ン

の効果

が

認

め ら れ た (

p <

0

･

0 5

)^･ 以

上

^の実 験 結 果^に

よ り

,

2

^‑

8

細 胞 期^{の ヒ}

ト

体 外 受 精 胚 移 植 後

に

あ

る

割 合^の胚

が

子 宮 腔

か

ら 排 出

^{さ れ る と}

考

え ら れ た

^. こ の こ

と が

^{ヒ ト}

I V F

‑

^{E T}

^法に

^{お け る}

低 成 功 率^{の 一}因

^で

あ

^{る と}

す

る な ら

ば,

母

体^{へ の}

子

宮 収縮抑 制 剤 投 与

が

ヒ ト

I V F

^‑

E T

法^の成 功 率

を

改 善 す

^る

^一策

^で

あ

る 可

能 性

が

あ

る

^. こ の

よ う な

薬 剤^の検 索

を

更^に進

め る 上

で_, 経 頸 管 的 胚 移 植^のマ

ウ ス

モ

デ

^ル

が

有

用 と

考

え

ら

れ た

^.

K e y

^{w o}

^r

ds mi

c e

,

e

mb

r y ^o t

r a n sf

e r

,

0 V u m

i

m p

l

a n t a t

io

n

,

b e t a a

d

r

e

n a g

i

c r e

c e

p ^{e r a} g

^o

n

i

s t

両 側 卵 管 閉 塞^に

^{よ る 不}

妊 症の婦 人^に対

^し

, 従 来

^ほ

卵 管 移 植

ま た は

^マ

イ

^{クロサ ー}

ジ ャ リ ィ

(

m i c r o s u r

g

e r

y) ^に

よ る

卵 管 接 合^{1 )}

が

唯 ^{一 の}治 療 方 法

で

あっ

た

.

し か し

こ の治療法

^ほ

卵 管 腔

^が

広 範 囲

に癒 着

^{し た}

婦 人^に

^は

適

用

^でき^にく^い2),

そ

^こ

で

こ の

よ う な

婦 人

に

も 適 用

で

き

る

治 療 法

と し て

^ヒ

ト

体 外 受 精

^{お よ び}

胚 移 植 法 (

^{H u m a n i n}

‑

^{V i}

^t

^{r o f e r}

^t

^{ili z a}

^t

^{i o n a n d e m b r}

y

o

t

_{r a n s} f e r

, ヒ

ト

ⅠV F

^‑

E T

法)^{3 )}

が

普

及 し つ つ

あ

る

^.

しか し

^{こ の}治 療 法^の成 功 率

が 1 0

^‑

2 0

%

^に

す ぎ

な

^い現 状^{4 )}

^{で ほ}

, 公 衆 衛 生 学見 地

か ら ほ 不

妊 症 対策

と し て

の ヒ ト

ⅠV F

‑

^{E T}

法

が

完 成

し て

い

る と は

言^い

が た

い.

し た が

っ

て

こ の治 療 法^の成 功 率^の向

^{上 を}

計

^る

^こ

^{と が}

重 要

な

課 題

で

あ

る

^.

と

^こ

ろ で ヒ ト ⅠV F

^‑

E T

法^の低 成 功 率^の原 田

^は

移 植 胚^の低 着 床 率^にあ

る

^.

ま た

こ の低 着 床 率

は

, 母 体の ホ ル モ

ン

環 境, 移 植 胚^の質, 胚 移 植^の時 期

な ど

^に

お

け

る

難 点^{5】6 )}

や

, 胚 体 外 培 養 中^の 発 生遅 延^に

^{よ る}

胚 ^･ 子 宮 内峡 間^の位 相のず れ⁷⁾

な ど に

原 因が^あ

る

と

さ

れ

る

^. 加 う

る

に頸 管

を

通

し て

子 宮 腔^へ移 植 ( 経 頸 管 的 胚

移 植)

さ れ た

^{ヒ ト}胚

^が

着 床

を

開 始 す

る ま

で の

子

宮

と

の相

互

作 用

が

未 解 明

と

いう 問題 も 考

え ら れ る が

, こ の間 題

^{を 調}

^べ

^る

^に

^ほ

動 物^モ

^デ

^ル

が 必

要

^で

あ

^る

^. す

な わ ち

, 動 物^モ

^{デ ル}

^に

お

け

る

経 頸 管 的 移 植 胚^の着 床 率

と

, 卵 管 内^への経 腹 壁 的 移 植

(

経 腹 壁 的 卵 管 内移 植)

^{お よ び}

子 宮 壁

^を

貫^い

^た

子 宮 腔^への経 腹 壁 的 移 植

(

経 腹 壁 的

子

宮 内移 植) 胚^の着 床 率

と を

比 較 検 討 す

る

こ

と

^に

よ

っ

て

,

問題 解

^明

^の糸^口

^が

見^い

だ さ れ る 可

能 性

^が

あ

^る

^.

さ て

^マ

ウ ^ス 子

宮の頸 管

は

狭 小

^{で ほ}

あ

る が

, 経 頸 管 的 胚 移 植^で 良好

な

着 床 率

を

得

た と

^い

う M o l e r ら

⁸⁾の報 告^に着

^{目 し}

, 本 研 究

で

ほ

経 頸 管 的 胚 移 植

^モ デ

^ル

と して

^マ

ウ ス を

選 択

し た

^.

ま

ず^マ

ウ

ス

胚 経 頸 管 的^･移 植^に

お

け

る

最 適 条 件

を

決 定

し

,

そ

^の際^の着 床 率

を

経 腹 壁 的 移 植 胚^の着 床 率

と

比 較

^した

^.

さ ら

^に最 適 条 件 以 外^で

の移 植 胚^の着 床 率 低 下^の原 因^{に つ い}

て

移 植 胚^の子 宮 内動 態

と

い

う 観 点

^{か ら}

解^明

^を

試

^み

, こ の低 着 床 率

^が

薬 物 投 与

^{に よ}

^っ

^て

改 善

さ

れ

る 可

能 性

を

検 討

^した

^{. こ}

^れ

らの実 験 結 果^に基

づ

き! ヒ

ト

ⅠV F

^‑

E T

法

に お

け

る

低 着 床 率^の原 困 と 対 策

^に

^{つ い}

^て

, 移 植^ヒ

^ト

A b br evi ^a

^t

i

o

n s : G IF T,

g ^a

^{m a}

t e

in

t

r a^‑fallo

p

ia n

t

r a n sfe r

;

H C G , hu m

a

n

c

ho rio

n

ic

g

^{o n a}do

t

r o

p

in ; ⅠV F^‑E T,

i

n ^‑Vi

t

r o fe r

t

iliz a

t

io n a nd

e

mbr

y

^o

t

r a n sf_{e r ;} m ^‑W m ediu m , m Odifi^ed W hi

t t

ingh ^{a m 's m}

^e

^{d i}

^u

^m

^;

^{P Gs,}

p

^{r o s}

t

a

g

la nd in s

;

P M S,

p

^{r e}

g

^{n a n}

t

m a r e S e ru m

胚^の子宮 内動 態

と

いう 観 点

^{か ら}

考 察

し た

^.

材 料

^{お よ}

び 方 法

Ⅰ

. 材 料

受 精 胚

を

提 供 す

^{る ド}

^{ナ ー}(

^{d o n o r}

)

と し

て体 重

1 0

‑

^{1 5}

g の

7

‑

⁸

週 齢^の灰 黒 色^の

B D F

l雌^マ

ウ ^ス

(

三

協^ラ

ボ

サ ^ー ビ

ス

_, 東 京

^{) を}

, 胚 移 植

^を

受

^{け る レ シ}

^{ピ ア}

^ン

^ト

( ^{r e c} i

p

i e n

t

) と し て

体 重

^{1 0}

‑

^{1 5}

g の

7

‑

⁹

^{適 齢の白 色の}

^{I C R}

^雌マ

^{ウ ス (}

^三協ラ

^ボ

^{サ ー}

^{ビ ス}

⁾

^を

^使

^{用 L}

た

. こ

れ ら

^のマ

ウ ス を

人

工

昼 夜 ( 昼 時 間

^{0 7 : 0 0}

‑

^{1 9 : 0 0}

^{, 飼 育室}

温 2 0 ℃

), 自 由 摂 餌^一 摂 水^のも

と

で

1

週間飼 育

し た

後^に実 験^に 供

し た

^.

Ⅲ

. 実 験 方 法

1

^{. マ}

ウ ^ス

胚^の採 取

1

)

ド

ナ ^{ー マ}

ウ ス

の作 製

マ

ウ ス

過 排 卵 処 理の常 法^g､通

り

,

1 6

時^に妊 馬

血

清

(

p

r e

g

n a n

t

m a r e s e r u m

^･

P M S ) (

帝 国臓 乳 東 京

) 5

^.

0 Ⅰ

.

U

.

を

,

そ

^の

4 8

時 間 後^に絨 毛性 性 腺 刺 激^ホ

^ル

^モ

^ン

(

h u m a n c h o

r

i o n i c

g

o n o d o r

t

r o

p

i n

.

H C G ) (

帝 国 臓 器

) 2

,

5 Ⅰ

^.

U

^.

を B D F

灘^マ

^{ウ ス}

^の腹 腔 内^に注

入 し

^. 同 系^の雄^マ

^{ウ ス と}

同居

さ せ た

^.

翌

朝 膣 栓

( P l

ug

)

形 成^に

よ り

交尾

を

確 認

した

^マ

ウ ^ス を ド

^{ナ ー}

と し

,

そ

^の

日 を そ

の

ド

ナ ^{ー マ}

ウ ス

の

交尾 後 第

1 日 目 と

定 義

^{し た}

^.

2

) 卵 管 内の胚の採取

常 法⁹¹通

り

交 尾 第

^{1 日}

目^の

^ド

^{ナ ー マ}

^{ウ ス} (

第

1 日 ド

ナ ^ー

) を

頸 椎 脱 臼 法^で屠 殺

し て

卵 管

を

採 取

し

, 卵 管 膨 大 部 壁

を

解 剖針^で破 壊

し

卵 管 内^{に 一}塊

を な し

て い

る

^マ

ウ ス

胚

^を

引 き 出

^{し た}

^.

3

) 子宮 脛 内^の胚^の採 取

常法⁹⁾通

り 2

,

3

,

4

,

5 日 ド

ナ ^ー

を

頸 樵 脱 臼 法

^で

屠 殺

^し

^, 卵 管 付 き^の子 宮

^を

採 取

^し

^て

^{3 0}

^ケー

^ジ

^の注射 針

^を

卵 管 端^に挿

入 し

,

修

正 ウ イ

ッ テ

ィ ン ガ ^ム

の 培 養 液^{1 0〉}

( m o d ifi e d W hi

t t

i n

g

h a m

,

s m e d i u m

.

m

‑

^{W m e d i u m} ) を

卵 管

か ら 子

宮 腔^へ注

入

す

る と

,

マ

ウ

ス 胚 が 子

宮 断 端

よ り

流 出 す

る (fl u s h

法

)

. こ

れ ら

の胚

を

培 養 液 中^に移

し

炭 酸^ガ

ス

培 養

^器

内

(3 7 ℃

,

5

% 炭 酸

^{ガ ス}

十

9 5

% 空 気

)

^で 保 存

^{し た}

^.

2

^{. マ}

ウ ^ス

胚^の移植

1

) レ シ ピ ア

ン ト

^マ

ウ ス

の作 製

常 法㌣通

り

^エ

^ス

テ

ル ス ( e s

t

e

r u

s )

期^の

^{I C R}

雌^マ

^{ウ ス} を

精 管結 紫

を

施

し た I C R

雄^マ

^{ウ ス と}

同居

さ せ

, 翌 朝腱 栓 形成^に

^{よ り}

交 尾

を

確 認

^し

, こ の偽 妊 娠^マ

ウ ^ス を レ シ

ピ ア

ン ト と し た

.

ま た そ

の

日 を そ

の

レ シ

ピ ア

ン

ト の交尾 後第

1 日 目 と

定 義

^{し た}

^.

2

) ^マ

ウ ス

胚^の経 腹 壁 的卵 管 内移 植

常 法^{9 )}通

り

, レ

シ ピ

ア

ン ト

の体 重

^{1 0}

g あ

た り 0

^.

5 m

g の

ベ ン

ト パ

_ル

ビ タ ^ー

ル (

大

日

製薬, 大 阪

) を

腹 腔 内^に注

入 し

て麻 酔

^し

^, 側 背 部^の切 開 創

よ り

卵 管

を

引 き 出

^し

, 胚

を

浮 遊

さ せ た ガ

ラ

ス

細 管 製^の移植 用器 具^の先端

を

実 体 顕 微 鏡 下^で卵 管 采 部

よ り

卵 管 膨 大 部^に挿

入 し

胚

を

移 植

し た

.

3

) ^マ

ウ ^ス

胚^の経 頸 管 的 移植

i

) ^マ

ウ ス

胚^の経 頸 管 的移 植に使 用す

る

器 具^の製 作

2 6 ゲ

^ー

ジ

の腰 椎 穿 刺 針 (八光 社, 長野 県 戸 倉

町

)

^{を 3}

‑

^{5 c m}

^の 長

さ に

切 断

し て

切 断 面

を

滑 ら

^{か に}

研 磨

し

, 滑

り

止

め と し て

内針

に

軽 く 折

れ 目 を

つけ

た

^. こ

れ を

経 頸 管 的 胚 移 植 時^にマ

^{ウ ス}

胚

を

保 持

^し

移 植 す

る た め

の器 具 ( 経 頸 管 的 胚 移 植 用 器 具)

^{と した}

^{. マ}

ウ ス

用の小腹 鏡

は

^パ

^ス

^{ツ ー} ル

ピ ^ペ

ッ

ト を

利 用

し て

作 製

^{し た}

^.

ii

) ^マ

ウ

ス胚 経 頸 管 的移 植 手 技

卵管内胚 移 植^の場 合

と

同様^の麻酔

を

施

し て

レ

シ

ピ ア

ン ト を

手

術 台^に固 定 す

^る

^, 実 体 顕 微鏡 下で胚 移 植

用

器 具^の内針

を

引 き

つ つ

5^‑

1 5

個^{の マ}

ウ ^ス

胚

を

吸 引

し た

後l 小腱 鏡

^を

用^い

て

強 照 明 下

で

胚 移植 用器 具^の先 端

を

外 子 宮^口

^か

ら 子 宮 膣^へ 挿

入 し

, 次^{い で} 胚 移 植

用 器

具^の内針

を

外簡^に押

し

込

ん

で胚

を

子 宮腔^へ移 動

^{さ せ} た

( 図

1 )

^.

4

) 移植

し た

^マ

ウ ^ス

胚の着 床^の判 定

胚 移植^の

1 0 日

後^に

レ

シ ピ ア

ン ト を

頸椎 脱 臼法

^で

屠 殺

^し

, 子 宮 内^に発 生

^{し た}

胎 仔 数

及 び そ

^の発 育 状 況

を

観 察

し た

^.

3

^. 経 頸 管 的 移 植^マ

ウ ス

胚

が

高 率に着床 す

^る

条 件^の検 討

1

) 自 然 排 卵

^周

期

^{I C R}

雌^{マ ウ}

^ス

^の妊 草 性

4

^〜

6 匹

^の自 然 排卵

^周

期^の

I C R

雌^マ

ウ ス と 1

匹^の

I C R

堆^マ

ウ ス を

同 居

さ せ

^て毎 朝観 察

^し

, 腱 栓 形成^に

よ り

交尾

が

確 認

さ れ た

雌^マ

^{ウ ス} を

他^の

^ゲ

^ー

^ジ

^に隔 離

^{し た}

^. 交尾 後 第

1 0 日 目

^に雌^マ

ウ

ス を

屠 殺

し て

子宮 内^に発 生

L た

胎 仔数

^を

確 認

^{し た}

^.

2

) ^マ

^{ウ ス}

胚^の経 頸 管 的 移植に使 用す

る

器 具

4

^･

1

/

2 日 ド

ナ ^ー

か ら

採 取

し た

胞 胚

を

交 尾 後 第

³

^･

¹

/

2 日 目

の

レ

シ ピ ア

ン

ト^マ

ウ ス ( 3

^･

1

/

^{2 日 レ}

^{シ ピ ア}

^{ン ト}

) ( 以 下, こ の

よ う な

組

み

合

わ せ を 4

^･

1

/

²

^→

³

^･

1

/

^{2 と}

^{記す) に} , 経 腹 壁 的 胚 移 植

で

使

用 さ れ る ガ

ラ ス細 管 製

お よ び

自 棄^に

よ る

腰椎 穿 刺 針 製^の

2

種^の胚 移 植 用

器

具

を

用^い

て

経 頸 管 的

に

移 植

し

着床 率

を

比 較

し た

^■

な お

以後^{のマ ウ}

ス

胚の経 頸 管 的移 植

^{で は}

腰 椎 穿 刺 針 製^の胚 移植 用器 具

を

使 用

し た

^.

3

)

ド

ナ ^ー

と

レ シ

ピ

ア

ン ト

の組

み

合

わ

せ

ド

ナ^ー

と

レ シ ピ ア

ン

ト

を 2

^･

1

/

²

^→

²

^･

¹

/

²

,

3

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0

^→

3

･

0

,

3

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1

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²

^→

²

^･

¹

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²

,

3

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1

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2

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3

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1

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²

.

4

^･

1

/

²

^→

³

^･

1

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²

,

4

^･

1

/

²

^→

⁴

^･

¹

/

²

,

5

^･

1

/

²

^→

⁴

^･

¹

/

2

,

と

組

^み

合

わ せ

て胚

を

経 頸 管 的^に移植

し

, 各

^々

^の場 合^の着 床 率

を

求

め た

^.

4

) 経 頸 管 的 胚 移植

用 器

具 内に胚

を

浮 遊

さ

せ

る

培 養液 量

4

^･

1

/

2

^→

3

^‑

1

/

2

^の組

み

合

わ せ を 剛

^､,

1

.

0

^‑

1

.

5

/^∠

1

,

3

･

0

〃

1

,

お よ び 4

.

5

/^∠

l

の培 養液^に浮遊

^{し た1 0}

^‑

^{1 5}

個^{のマ ウ}

^ス

胚

F i

g^.

1

^.

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^{n s c e r v i c a l}

^t

^{r a n s 王 e r o f m o u s e}

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F i v e

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m O u S e e m b r

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o o l m a d e o f 26

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^{t y}

^{V i a}

C e r V i c a l c a n a l a n d

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寧

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