変 討 球動 態 肝 病 検 小腸移植 後 移植片対 宿 病 け

ラ ッ ト小 腸移 植後^の移 植 片対宿^主病^{に お}ける リ ^{ン パ} 球 動態^{お よ び}肝病_変^の検討

金沢 大学 医 学 部 外科 学 第

^二

講 座 (主任

^:

宮 崎達 夫教 授)

桝 谷 博 孝

小 腸 移 植術 後 早 期

^に

お

^こ

る急 性 移植 片 対 宿主病(

g r a

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ト V e r S u S

^‑h

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d i

s e a s e

,G V H D)

^の

際

に

, 移 植 片か ら宿^主

^の

体 内

^に

移 行 した T 細 胞^が宿主

^の

阻 織を認 識^し, さ ら

に

攻 撃 する ま で

の

変 化を 明確

^に

す^{る た め}

^に

,

ラ

ッ

ト

を用

^い

て, 小腸 移 植 後

^の

G V H D

^に

よ る皮 膚, 小 腸 粘膜 病 変が最 も 顕 著

^に

見ら れ る移 植 後1 4 日 目

^の

宿主

^の

脾臓と腸 間膜リ

ン パ

節な ら び

^に

血液 中

^に

浸 潤 ある

^い

は遊 走 す^{る T} 細 胞 分 画

^の

比 率^{を G V H D} 群^と免疫 抑 制 剤 (^{F K‑5 06}) 投 与 群

^で

比 較検 討^{し た. そ}

^の

結 果, 浸 潤^{し て}

^い

^{る T} 細胞

^の

うち^ヘ

ル パ

^ー T 細胞

^の

し め る割 合は, 平 均し て脾 臓で約6 6% , リ

^{ン パ}

節

^で

約6 6% , 血中で約7 3% と

い

ずれも^ヘ

^{ル パ}

^ー T細胞が優 位

^で

あった. ま た肝臓

^の

血管 内 皮 細 胞

^に

リ

ン パ

球が接 着 する現 象と肝 臓

^の

細胆管

^{に リ} ン パ

球^が浸潤 す^る現 象^{は G V H D} 群^で著 明^で あった が, 免 疫 抑制 剤 投 与 群

^で

^は明ら か

^に

抑 制さ れ て

い

た. し た がって,F K‑^{5 0 6 は宿主抗 原}

^の

^{認識を抑 制 する}事が 示 さ れ, 急 性 G V H D

に

よ る宿 主

^の

攻 撃が最 も 著 明な時 期

^に

も 宿主抗 原

^の

認 識は続

^{い て い}

るも

^の

と考え られ た^. すな わ ち, 小 腸 移植

^に

お

い

て は移 植 片 由 来

^{の リ ン パ}

球

^に

^{よ る}宿^主抗原

^の

認 識, 攻撃^{ほ 一}連

^の

反 応

^で

^はなく, 同時

^に

進 行す^る反 応

^で

あ^る

^こ

と が 示 さ れ,

脾 臓と

リ ン パ

節お よ び肝 臓

^に

お け る変 化は, 臨 床 小 腸 移植

^に

お

い て

も 急 性 G V H D

の

診断, 治療

^の

指標と な る と考え ら れ た^.

K

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_, F K‑^{5 0 6}

近 年, 短 腹 症 侯 群

の

症 例を対 象に小 腸 移 植ま た は肝^･ 小 腸 同 時移 植が行な わ れ て

^い

る^{‑ ).} 小 腸 移 植

^に

お

^い

て は移 植 片 中

^の

^リ

ン パ

組 織

^に

含まれる移植 片 由 来

^{の リ} ン パ

球が宿主

^の

肝 臓や皮膚 等^を標 的 臓 器^{と し て}障 害 す^る移 植 片 対 宿主病 (

g r a

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^,V

e r S u S

‑

h

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, G V H D) が発 生 する 可能 性がある^. G V H D ほ ^一 旦 発 症 す^{る と}致 命 的^となる. し た がって, そ

の

予防

^の

^{た め}

^の

免疫 抑 制 剤や抗リ

^{ン パ}

球 抗 体

の

投 与が必 要

で

あり, 免 疫 抑 制 剤

^の

効 果判 定と抗リ

ン パ

球 抗 体

^の

投 与 時 期

^の

決 定な ど を 可能

^に

する た め

に

は, 宿主

^{の リ ン パ}

系臓 器や肝 臓 等

^の

生 検しやす

^い

臓器

^の

移 植 後 早 期

^の

変 化を 正確

^に

把 握 する

こ

と が 必要と思わ れ る^. し か し, 急 性^{G V H D}

^の

際

^の

移 植 腸 管^{か ら}移 行^{し た}

^{リ ン パ}

球

^に

^{よ る} 宿主

^の

組 織 抗 原

^の

認 識お よ び宿主組 織^へ

^の

攻 撃^が移植 後^ど

^の

^よ う な時 期

^に

起

^こ

る

^の

か, ま た そ れ ら が 同時

^に

起

^こ

る

^の

か別

々 の

時期

^に

起

^こ

^る

^の

^{か は}十 分

^に

明ら か

^に

さ れ て ほ

い

な

^い

^. そ

^{こ で}

^, 小腸 移 植 後

^に

発 生 する急 性 G V H D

の

際

^の

宿主臓器

^に

おける リ

ン パ

球 動 態^を明ら か

^に

す^る

^こ

と を 目的

^に

,

ラ

ッ

ト の

小 腸 移 植後

の

G V H D

の

際

の

宿主

の

脾 臓と腸 間 膜リ

^{ン パ}

節

^に

浸 潤 する リ

^ン

パ

球 分 画を免 疫 鼠 織 染 色

に て

分 析し, さ ら

に

, 標 的臓^{器 で}ある 肝 臓^{に お}け^る移 植 後 早 期

^の

変 化を免 疫 抑 制 剤 投与 群と非 投 与群 と で比 較 検 討し た^.

材 料 お よび方 法

Ⅰ. 実 験^{モ デ ル の}作 成

体 重^{25 0 〜}3 0 0

g の

雄 性

^ル

イ

^ス

系

ラ

ッ

ト

を ド

ナ

^ー と し, 同 条件

の ル

イ

ス ×

ブ

ラ

ウ

ン

^･

ノ ル

ウ^{ェ ー} Fl を

レ シ ピ

^エ

ン ト

と し て 用

い

た^. ド

^ナ

^ー と

^{レ シ ピ}

^エ

^ン ト

は共

に

術 前

の

絶 食は 2 4時 間と し,

麻 酔ほ

^ベ ン

ト

^パ ル

ビ

タ

^ー

ル の

筋 注

^に

よ り行なった^. 移 植 手技ほ す

^べ

^て手術 用顕 微 鏡を用

^{い て}

行なった.

1 ^. ド

ナ

^ー 手 術

移 植 片^{と し}

^て

空 腸起 始 部よ り 回腸 末 端^ま

^{で の}

小 腸^{を 上}勝 間険 動 脈 根 部

の

上下

の

大動 脈(腹腔 動 脈か ら左 腎 動 脈^{ま で ) を}動 脈 茎, 肝 門 部ま

で の

門脈を静 脈茎と し

て

切 離し た. 移 植 腸 管

の

内 腔ほ 2 0

^m

l

の

冷 生 食を緩 徐

^に

注入 し

^て

洗 浄し, 腹 部 大 動 脈 内

に

刺入 し た注 射 針よ り 1 0

m

I

の

^ヘ

パ リ ン

加冷 生理食塩水 を緩徐

^に

注^{入 し}

^て

潅 流^{し た}後摘 出^{し た.}

2 ^.

^{レ シ ピ}

^エ

^ン ト

手術

M

o n c

h ik‑^Ru

^{s s e}

^{ll 法2 一}

^に

^{準じ た異 所性全}小 腸 移 植^を施行^{し た.} 移 植 片

^の

動 脈 茎は末梢 側を結 集し, 中枢 側を

^{レ シ ピ}

^エ

^ン

ト

^の

腹 部 大 動 脈(右 腎 動 脈

^の

末 梢)

^に

端 側 縫 合し, 静 脈茎ほ

^レ シ ピ

^エ

ン ト の

下 大静 脈 ( 右 腎 静脈

^の

末梢)

^に

端 側 縫合^{し た.} 移 植 腸 管

^{の 口}

側ほ結 致し, 肛 側ほ右 腹 壁

^に

縫 合し

て

腸 療と し た^. 術 直 後

^の

水 分 補 給

^の

^目的で, 閉腹 時

^に

約^{2 0}

^m

^l

^の

生理食 塩水^を腹 腔 内

^に

注 入 し た^.

3 . 術後 管 理

移 植 後2 4時 間^は水 分

^の

み経

^口

摂取可 と し, そ れ以降は術前と 同 様

^の

固形 飼 料を与え た^. 抗 生 物質は投 与し な かった.

Ⅱ. 実 験 群

実 験 群を以下

^の

³群

^に

分 けた^.

平 成⁵ 年^{1 1}月^{1 6 日}受 付, 平 成⁵ 年^{1 2}月^{2 4 日}受 理

A b b

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1 ^. G V H D 群(

n

⁼8 )

移 植 後 免 疫 抑 制 剤を投 与

^せ

ず^, 術 後1 4 日 冒

^に

犠死 さ せ た^. 2 ^. F K 群 (

n

⁼9)

移 植 直後^{か ら 0.3 2}

^m g

/^k

g の

F K‑5 0 6 (F R 90 0 5 0 6, 藤 沢 薬 品^工 業, 大 阪) を連日筋 注し, 術 後1 4 日 目

に

犠死 さ

せ

た^.

3 . 対 照 群 (

n

⁼ 7)

開腹 術

^の

み を施 行し, 免 疫抑 制 剤を投 与せず, 術後1 4 日 目

に

犠死 させ た^.

Ⅲ. 検 査 項 目お よび 方 法 1

∴

組織 標 本

^の

作 成

レ シ ピ

ェ

ソ ト

は下 大 静 脈^{か ら}

^の

採^血

^に

^{よ り}脱血 死 さ せ,

レ シ ピ

^エ

ン

ト側

^の

腸 間 膜

^{リ ン パ}

節, 脾 臓お よ び肝 臓を摘 出し, リ

ン パ

節ほ単 離^し肺 臓お よ び肝 臓は約3

m m

厚^さ

^{に ス ラ}

^イ

^ス

^し

^て

!

い

ずれも0 ℃

の ア セ ト ン に

てすみ や か

^に

固定し た^, 約1 2時 間

^の

固 定

^の

あと, A M E X 液^{3 )}

^に

て処 理し た^.

2 . 阻織 標 本

^の

染 色

組 織 標 本を脱

^{パ ラ フ} ィ ン

化し, 水 素 化

^ほ

う 素

^ナ

ト リ ウ

ム

_, 過 よう 素 酸, 過酸 化 水 素 加

^{メ タ ノ}

^ー

^{ル に}

^{よ り}内 因性

^ペ

^ロキ

^シ

^{ダ ー}

ゼ

を十 分

に

抑制した後, 以下

の

リ

^{ン パ}

球表 面 抗 原

^に

対 する

モ ノ ク

^{ロ ー}

ナ ル

抗 体 (S

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い

て

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ビ デ

ィ ソ

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ビ

オ

チ ン

複 合体 (

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^idi

ⁿ

^{b i}

^{o t}

ⁱ

^{n c o m} p

l

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,A B C) 法³⁾

^に

よ り免 疫 組 織 染 色し た^.

B

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1) ^{W 3}/^{2 5}

ラ

ッ ト

の

^ヘ

ル パ

^ー/^イ

^ン

^{デ ュ ー}

^サ

^ー T 細 胞

^の

表 面 抗 原 2) O X 8

ラ

ッ

ト の サ

イ ト ト キ

^シ

ッ

ク

/

^サ

^ブ

^レ

^ッ

^サ

^{ー T}細 胞

^の

表 面抗 原 3 ^. 組 織 標 本

^{の リ} ン パ

球 比 率

^の

測 定

脾 臓

^の

^T 細 胞 領 域

^で

ある動 脈 傍

リ ン パ

観 織 鞘, 腸 間膜リ

^{ン パ}

節

^の

T 細 胞 領 域である傍 皮 質 領 域, 肝 臓

の

門 脈 域

に

おける全リ

ン パ

球 数^{と W 3}/^{2 5} な ら び

^に

0 Ⅹ8 陽 性 細 胞 数を光 学 顕 微 鏡で 4 0 0倍 拡 大 時

^の

^一 視 野 あた り で計 測し, さ ら

^に

全

^リ ン パ

球

^に

対 する W 3/^{2 5 と O X 8} 陽 性 細 胞

^の

比 率^を計 算^し, G V H D 群と対 照 群と

で

比 較し た^.

4 ^. 肝 病 変

^の

検 討

G V H D 群と F K 群

^の

血管 壁^へ

^の

リ

^{ン パ}

球 接 着 所 見^{お よ び}小 阻 管壁^へ

^{の リ} ン パ

球 浸 潤所 見を比 較し た^{t 9 卜 2 7)}

1) ^血管 壁^へ

^の

^リ

^{ン パ}

球 接 着 (

^{e n}

^d

^{o t}

^h

^e

^li

^a

^li

^t

ⁱ

^s

) 所 見

レ シ ピ

^エ

ン ト の

肝 臓

^の

^一切 片 あた り

の

門 脈 枝, 肝 静 脈 枝

^の

う ち,

リ ン パ

球

^の

接 着を認^{め る 血}管 数(

^a

), そ れ ら

の

血管

^に

接 着^し

て い

る

リ ン パ

球

^の

総 数( b) を計 測し, 平 均 接着 細 胞 数 (^b/

^a

) を 求め た^.

2) 小 胆 管 壁^へ

^の

^リ

^{ン パ}

球 浸潤 (

^{e m} p e r

i

p o r e s

i

s

) 所 見

レ シ ピ

エ

ン ト の

肝 臓

^の

^一切 片 あた り

^の

直 径1 0 0 ^〜2 0恥

^の

小 胆 管数 (

c

) と, そ れ ら

の

う ち^一 個 以^上

^{の リ ン パ}

球^{が 上}皮 層 内

^に

浸 潤し

^{て い}

る胆 管

^の

数( d) を計 測し,

リ ン パ

球 浸潤 率( d/

^c

) を 求め た^.

5 . 血液 標 本 作 成 法

全血中

^{の リ ン パ}

球 比 率 測 定 用

^に

術後3,

7

_,1 4 日 目

^に

尾 動 脈よ り約²

^m

^l 採^{血 し た. ま た}, 血液 生 化 学 検 査用

^に

, 屠 殺 時

^に

下大 静 脈よ り約1 0

m

l 採血 し, 3 0 0 0 回転

^で

1 5分 間遠心分 離し, 血清 を ^‑8 0 ℃

で

凍 結 保 存した.

1) 全血中

^の

^リ

^{ン パ}

球 比 率 測 定

採取し た 血液 中

^の

全リ

ン パ

球

^に

対 する W 3/^{1 3, W 3}/^{2 5, O X 8} 陽 性 細 胞

^の

比 率^を,

フ

ロ ^ー

サ

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ト メ ト リ

ー^{F A C S}

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^. U^.S^.A^.)

に て

測 定し た^.

2) 血液 生 化 学

血清 中

^{の ア ル}

^ブ

^{ミ ン}

を ブ^ロ

^{モ ク レ}

ゾ ^ー

ル

グ

リ

^ー

ン

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3 凌 慧 6 ア 1 0 t l

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^,B C G) 法^{5 )}, 総^ビ

^{リ ル}

^ビ

^ン

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ゾ

ビ

リ

ル

ビ

ン

法⁶⁾, グ

ル タ ミ ン

酸

^{ピ ル}

ビ

ン

酸ト

ラ ン ス ア ミ ナ

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ゼ

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,G P T) ^を紫 外 線 吸 光 光 度 分 析 (

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_, U V) 法^7}( ド イ

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臨 床 化 学 会 (G

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s t _r y

,G S C C) 法 準 拠) ^を用

^い

て測 定し た^.

Ⅳ^. 統計 学 的検 討

測 定 値ほす

べ て

平 均 値土標 準偏 差であら わ し た^. 測 定 値

^の

比 較は S

^{t u}

d

e n t

'

s t

検 定を 用

い

, 危 険 率⁵ % 未満^をも^って有意 差 あり と し た^.

成 績

1 . 肉 眼 的 変化

G V H D 群

^の

小 腸 移 植後^{1 4 日}目^{で ほ}1 脱 毛, 湿 疹 等

^の

皮膚 変 化 と下 痢

^に

伴う体 重 減少が著明 であ^った( 図1)^.

2 . 皮 膚

^の

顕 微 鏡所 見

G V H D 群

で

は, 上皮 層^へ

^の

著 名な リ

^{ン パ}

球 浸潤, 上皮細 胞

^の

空砲 変 性を認め た

^{の に}

対し, F K 群

^で

は そ れ ら

^の

変 化ほ見ら れ なか った( 図²)^.

3 ^. 免 疫 臓器

^の

変 化

G V H D 群

^の

脾 臓^は著 名^に腫 大^し, 平 均 重 量ほ 正常 動 物

の

約 3倍^であ^った(図 3 )^.

^{レ シ ピ}

^エ

^{ン ト の}

腸 間膜

^{リ ン パ}

節 も 同様

^に

腫 大^し, 鼠 織 学 的

^に

ほ, リ

ン パ

ろ胞

^の

消 失お よ び T 細 胞 領域

^で

F i

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^.1^. M

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^.

F i

_g

.5 A

あ^る傍皮 質 領 域

^に

^おけ^る著 明な リ

^{ン パ}

球 浸潤を認め た (図4)^. 肺 臓

^の

T細 胞 領 域である動脈 周 囲

^{リ ン パ}

組 織 輪

^に

お

い

ても 著 明 な リ

ン パ

球 浸 潤 所見^が認^{め ら れ た.}

4 ^. 紅 織 標 本

^{の リ ン パ}

球比 率 1) 腸 間膜

^リ ン パ

節

^の

リ

ン パ

球 分 画

腸 間膜^リ

^{ン パ}

節

^の

傍 皮 質領 域

^の

強 拡 大^一 視 野 あた り

^の

全 細胞

ヽ畷

覧‥ 曽ギミ^さ土^ニミ妄

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