博士（医学）河口泰之 学位論文題名
In vivo effects of isolated implantation of salmon‑derived crosslinked atelocollagen sponge into an osteochondral defect
（鮭由来アテロコラーゲンスポンジの充填が関節骨軟骨欠損に与える in vivo 効果）
学位論文内容の要旨
【背 景 と 目 的 】
整 形 外 科 領 域 に お い て 、 関 節 軟 骨 の 磨 耗 や損 傷 は 関 節 痛を 惹 起 し 、 広範 囲 の 損 傷 は変 形 性 関 節 症 の 原 因 と な る 。 関 節 （ 硝 子 ） 軟 骨 は 自 己修 復 能 に 乏 しく 、 再 生 す る こと は な い 。 した が っ て 関 節 軟 骨 欠 損 に 対 す る 現 在 の 先 端 治 療 戦略 と し て 、 正常 な 軟 骨 を 病 変部 に 移 植 す る骨 軟 骨 移 植 術 や 、 軟 骨 細 胞 あ る い は 幹 細 胞 移 植 を用 い た 組 織 工学 的 再 生 軟 骨 移植 が お こ な われ て い る 。 後 者 の 戦 略 に はscaffoldが 重 要 な 役 割 を 果 た し て お り 、 ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン は 代表 的 なscaf foldで あ る 。 ア テ 口 コ ラ ー ゲ ン は 優 れ た 対 細 胞 特 性 、 低 い 抗 原 性、 高 い 生 体 内分 解 性 を 有 し 、 有 用 な 医 療 材 料 で あ る 。 し か し 、そ の 由 来 は 牛や 豚 な ど の 家 畜の 骨 や 皮 膚 であ り 、BSE、 手 足 口 病 な ど の 人 獣 共 通 感 染 症 の り ス ク を 含 む 点 が 、 大 き な問 題 と し て 認識 さ れ てい る 。 そ こ で 近年 ・ ヽ ヒ ト ヘの 伝 染 性 疾 患が な い と さ れる 魚 類 由 来 ア テロ コ ラ ー ゲ ンがそ の 代 用 と し て 注 目 さ れ て い る 。 我 々 の 研 究 グ ル ープ は 、 鮭 皮 由来 ア テ 口 コ ラ ーゲ ン 分 子 間 に架 橋 を 施 す 独 自 の 技 術 を 開 発 し 、19℃ で あ っ た 変 性 温 度 を47℃ ま で 上 げ る こ と に 成 功 し た 。 そ れ に よ り 、 変 性 す る た め に 不 可 能 と さ れ て い た ヒ ト ヘ の 応 用 が 原 理 的 に 可 能 と な っ た。
我 々 は 、 こ れ ま で に 報 告 し たin vitroの 研 究 を 基 礎 と し て 、 以 下 の 仮 説を 立 て た 。 （1） 架 橋 を 施 し た 鮭 皮 由 来 ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン ス ポ ン ジ （ 以 下cs)の 家 兎 膝 関 節 骨 軟 骨 欠 損 部 へ の 充 填 は 、 豚 由 来CS充 填 と の 比 較 に お い て 、 関 節 に 有 害 な 効 果 を 与 え な い 。 （2） 鮭 皮 由 来架 橋CSの 充填 は 充 填 後12週 でin vivo軟骨 再 生 を 促 進す る 。
本 研 究 の 目 的 は 、 こ れ ら の 仮 説 を 検 証 し 、 鮭 皮 由 来 架 橋csのin vivo軟 骨 再 生 に お け る scaf foldと し ての 基 礎 的 特 性を 評 価 す る こと で あ る 。
【材料 と方法 】 1．材 料
鮭 皮 ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン は 、 ペ プ シ ン 処 理に よ っ て テ ロペ プ チ ド を 除 去し 、 抗 原 性 を低 下 さ せ た 天 然 シ 口 サ ケ 皮 由 来 の コ ラ ー ゲ ン で あ る 。以 下 の 方 法 でコ ラ ー ゲ ン 分子 問 に 架 橋 を施 し た 。 凍 結 乾 燥 し た 鮭皮 由 来 ア テ 口 コラ ー ゲ ン に0． 5;KHCl (pH3）100mlを 加 え 、 鮭 皮由 来 ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン 溶 解 液 を 作 製 す る た め に4℃ で 一 晩 混 濁 し た。 次 に 、 鮭 皮由 来 ア テ ロ コラ ー ゲ ン 溶 解 液lrulを 組 織 培 養 の た め プ レ ー 卜 に 移 し （ ア サ ヒ テ ク ノ グ ラ ス 東 京 日 本 ） 、 そ の 後 、 ー70℃ で12時 間 凍 結 し た 。 凍 結 し た プ レ ー ト は24時 間 凍 結 乾 燥 機 に 入 れ(FDU−830 東 京 理 化 器 械 東 京 日 本 ） 、 得 ら れ た 通 気 性 の あ る 鮭 皮 ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン を 、 架 橋 剤 で あ るI%EDC（1→ethyl一3−（3―dimethyl一aminOProPYl） ーcarbodiimide，hydrochloride)存在下、
4M NaCl溶 解 液 に 浸 し （ ド ジ ン ド 東 京 日 本 ） 、24時 間4℃ で コ ラ ー ゲ ン 線 維 を 再 形 成 さ せ 、 線 維 化 と 架 橋 を 同 時 に 引 き 起 こ し た 。 鮭 皮由 来 架 橋 コ ラー ゲ ン 材 料 は水 で 洗 浄 し た後 、 再 び 凍 結 乾 燥 す る こ と に よ り 、 鮭 コ ラ ー ゲ ン ス ポ ン ジ が 作 製 さ れ た 。 架 橋 豚CSは 、豚 コ ラ ー ゲ ン （ 新 田 ゼ ラ チ ン 大 阪 日 本 ） を 購 入 し 、 上 記 と 同 様 の 方 法 で 作 製 し た 。 鮭 皮 由 来架 橋 CS、 豚 由 来 架 橋CS、 豚 由 来 非 架 橋csの3夕 イ プ の ス ポ ン ジ か ら 、 直 径4．5mm、 高 さ3mruの 円筒状 プ口ッ クを作 製した 。
2.家兎膝 関節骨 軟骨 欠損cs充 填モデ ルの 作製
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実 験 動 物 と し て 日 本 白 色 家 兎32羽 （ 体 重3．9土0． 5kg)を 使 用 し た 。 手 術 は 無 菌 下 、 お よ び 静 脈 麻 酔 下 （ ペ ン ト パ ル ピ タ ー ル2 5mg/kg)に 行 っ た 。 各 動 物 の 両 膝 蓋 大 腿 関 節 の 大 腿 骨 側 に ド リ ル を 用 い て 直 径4． 3mu、 深 さ3Duuの 骨 軟 骨 欠 損 を 作 製 し 、 各 動 物 の 両 膝 計64膝 を 無 作 為 に4群 （ 各 群n=16)に 分 け 、I群 で は 鮭 皮 由 来 架 橋CSを 欠 損 部 に 充 填 し た 。II群 で は 豚 由 来 架 橋CSを 欠 損 部 に 充 填 し た 。III群 で は 豚 由 来 非 架 橋csを 欠 損 部 に 充 填 し た 。IV 群 で は 欠 損 部 に 何 も 充 填 し な か っ た 。 術 後 は 膝 の 固 定 を 行 わ ず 、 ゲ ー ジ 内c3iox 550X320mm) で 活 動 制 限 を 設 け ず 飼 育 し た 。 術 後4週 お よ び12週 で16羽 ず っ 屠 殺 し 、 各 群8膝 の う ち6 膝 を 肉 眼 的 ・組 織 学 的 評 価に2膝 をRT―PCR評価 に 供 し た 。
3.肉 眼 的・ 組 織 学 的 評 価
大 腿 骨 顆 部 の 再 生 組 織 部 分 を 肉 眼 的 ・ 組 織 学 的(HE染 色 、Saf ranin−0染 色 、II型 コ ラ ー ゲ ン 免 疫 染 色 ） に 評 価 し 、Wayneら の 報 告 し た 評 価 ス ケ ー ル を 用 い て 定 量 化 し た 。 4. RT−PCR評価
欠 損 部 に 再 生 し た 組 織 を 採 取 し 、 リ ア ル タ イ ムPCRに よ っ てII型 コ ラ ー ゲ ン 、aggrecan、 SOX9の 発 現 を 定 量 的 に 評 価 し た 。RNA抽 出 はRNesay mini kit (Qiagen社 製 ） を 使 用 し て 行 し ゝ 、RT−PCRは 、SYBR Premix Ex TaqTM II (Takara Bio)お よ 乙 ドThermal Cycler Dice TP800 (Takara Bio)を 使 用 し て 行 っ た 。 こ れ ら の 結 果 は 、Thermal Cycler Diceの ソ フ ト ウ ェ ア ー を 使 用 し て 評 価 し 、 GAPDHプ ラ イ マ ー を デ ー タ の 標 準 化 に 使 用 し た 。 5． 統 計 解 析評 価
各 群 間 の 比 較 に はANOVAを 用 い 、post hocmultiple比 較 に はFischer PLSD testを 用 い た 。 有 意 水準 は5％ と した 。
【 結 果 】 1． 肉 眼 的 評 価
い ず れ の 膝 に お い て も 、 炎 症 ・ 病 的 所 見 は 認 め な か っ た 。 術 後4週 で は 、 各 群 と も 欠 損 部 は 白 色 の 線 維 性 組 織 で 満 た さ れ て い た 。 術 後12週 で は 、Iお よ びII群 の 欠 損 部 は 白 色 不 透 明 な 弾 カ の あ る 組 織 で 満 た さ れ て お り 、IIIお よ びIV群 の 欠 損 部 は 赤 色 斑 状 の 再 生 組 織 を 認 め た 。Wayne scoreに 関 し て は 、12週 に お い てI群 がIV群 よ り 有 意 に 高 値 で あ っ た (p=0. 0051)が 、 II群 、 III群 は Iv群 と 比 較 し て 有 意 差 は 認 め な か っ た 。 2． 組 織 学 的 評 価
4週 で は 、 い ず れ の 群 に お い て も 欠 損 部 は 線 維 性 組 織 で 満 た さ れ て い た が 、I群 で は 少 量 のProteoglycanを 認 め た 。12週 で は 、I群 お よ びII群 でProteoglycanに 富 む 組 織 を 認 め 、 そ こ で はII型 コ ラ ー ゲ ン の 発 現 も 認 め た 。 し か し 、 そ の 組 織 の 厚 さ は 正 常 関 節 軟 骨 の お よ そ 半 分 程 度 で あ っ た 。III群 お よ びIV群 の 欠 損 部 は 線 維 性 お よ び 骨 組 織 で 満 た さ れ て お り 、 II型 コ ラ ー ゲ ン の 発 現 は ほ と ん ど 認 め な か っ た 。Wayne scoreに 関 し て は 、12週 に お い てI 群 はIIIお よ びIV群 よ り 有 意 に 高 値(p=0. 0196)で あ り 、 ま たII群 はIV群 よ り 有 意 に 高 値 (p− − 0． 0021） で あ っ た 。 III群 と IV群 の 間 に 有 意 差 は 認 め な か っ た 。 3．RT―PCR
リ ア ル タ イ ムPCR分 析 に お い て 、 有 意 差 は 認 め な か っ た が 、II型 コ ラ ー ゲ ン 、aggrecan、 SOX9の 発 現 は 、 I群 お よ び II群 が 他 群 に 比 べ て 高 い 傾 向 が 認 め ら れ た 。
【 考 察 】
本 研 究 は 、 家 兎 膝 関 節 骨 軟 骨 欠 損 部 へ の 鮭 皮 由 来 架 橋CSの 充 填 が 、 豚 由 来 架 橋CSお よ び 非 架 橋CSの 充 填 と 同 様 に 膝 関 節 に 免 疫 学 的 な 有 害 な 効 果 を 与 え な い こ と 、 お よ び 鮭 皮 由 来 架 橋 CSの 充 填 は 、 豚 由 来CSと 同 様 に12週 で 骨 軟 骨 欠 損 部 に お け る 硝 子 軟 骨 再 生 を 促 進 す る こ と を 明 ら か に し た 。
【 結 諭 】
鮭 由 来 架 橋 コ ラ ー ゲ ン は 人 獣 共 通 感 染 症 の り ス ク の 回 避 、 良 好 な 軟 骨 再 生 誘 導 能 、 高 い 生 体 吸 収 性 、 お よ び 経 済 的 生 産 性 等 の 見 地 に お い て 有 望 な 組 織 工 学 的 軟 骨 再 生 用Scaffoldで あ る 。
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学位論文審査の要旨 主 査 教 授 三浪 明男 副 査 教 授 山本 有平 副 査 教 授 安田 和則
学 位 論 文 題 名
In vivo effeCtSOfiSOlatedimplantationofSalmon ― deriVed CrOSSlinkedate10C011agenSpongeintoanOSteOChondraldefeCt
（ 鮭 由 来 ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン ス ポ ン ジ の 充 填 が 関 節 骨 軟 骨 欠 損 に 与 え る invivo 効 果 ）
関節軟骨欠損に対する先端治療戦略として、軟骨細胞あるいは幹細胞移植を用いた組織 工学的再生軟骨移植が研究されている。アテロコラーゲンはその代表的なscaffold である。
しかし、その由来は牛や豚などの家畜の骨や皮膚であり、BSE 、手足ロ病などの人獣共通感 染症のりスクが大きな問題として認識されている。そこで申請者の研究グループは、 ヒト への伝染性疾患がない魚類由来コラーゲンに注目し、独自の架橋技術を開発して19 ℃であ った鮭皮由来アテロコラーゲンの変性温度を47 ℃まで上げることに成功し、不可能とされ ていたヒトヘの応用を原理的に可能とした。そこで申請者は、鮭由来架橋アテロコラーゲ ンスポンジ（以下CS) のin vivo 軟 骨再生における scaffold としての基礎的特性を評価す る研究を行った。
シロサケ皮に由来する鮭アテロ コラーゲン溶解液Iml をプレートに移し、‑70 ℃で12 時 間凍結した後、 24 時間凍結乾燥し た。これを架橋剤(1%EDC) 存在下に 4M NaCl 溶解液に浸 し、24 時間4 ℃でコラーゲンの線維化と架橋を同時に引き起こした。洗浄の後、再び凍結 乾燥することにより鮭由来架橋CS が作製された。豚コラーゲンでも同様の方法により、豚 由来架橋CS およぴ豚由来非架橋CS を作製した。これらの3 タイ プのcs から直径4 ．5mm 、 高さ 3mm の円簡状ブロックを作製した。
実験動物として日本白色家兎32 羽を使用した。静脈麻酔下に、各動物の両膝蓋大腿関節 の大腿骨側に直径4 ． 3mm 、深さ3mm の骨軟骨欠損を作製し、各動物の両膝計64 膝を無作為 に 4 群 （各群 n=16) に分けた。 I 群では鮭由来架橋CS を欠損部に 充填した。 II 群では豚由 来架橋 CS を欠損部に充填した。III 群では豚由来非架橋CS を欠 損部に充填した。IV 群で は欠損部に何も充填しなかった。術後は膝の固定を行わず、ゲージ内で飼育した。術後 4 週お よぴ 12 週で 16 羽 ずつ 屠殺 し、 各群 8 膝のうち6 膝を 肉眼的・組織学的評価に2 膝 を RT‑PCR 評価に供した。
いずれの膝においても、炎症・病的所見は認めなかった。12 週の組織学的評価では、I 群およぴII 群でProteoglycan に富 む組織を認め、そこでは豊富なII 型コラーゲンの発現 も認めた。 III 群およびIV 群の欠損部は線維性およぴ骨組織で満たされており、II 型コラ ーゲンの発現はほとんど認めなかった。Wayne score に関しては、12 週においてI 群はIII
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お よ びIV群 よ り 有 意 に 高 値(p=0. 0196)で あり 、 ま たII群 はIV群よ り 有 意 に 高 値(p:ニ0．0021) で あ っ た 。III群 とIV群 の 聞 に 有 意 差 は 認 め な か っ た 。 リ ア ル タ イ ムPCR分 析 に お い て 、 有 意 差 は 認 め な か っ た が 、II型 コ ラ ー ゲ ン 、aggrecan、SOX9の 発 現 は 、I群 お よ びII群 が 他 群 に 比 べ て 高 い 傾 向 が 認 め ら れ た 。
本 研 究 は 、 家 兎 膝 関 節 骨 軟 骨 欠 損 部 へ の 鮭 由 来 架 橋CSの 充 填 が 、 豚 由 来 架 橋CSお よ ぴ 豚 由 来 非 架 橋csの 充 填 と 同 様 に 、 膝 関 節 に 免 疫 学 的 有 害 効 果 を 与 え な い こ と 、 お よ ぴ 鮭 由 来 架 橋CSの 充 填 は 、 豚 由 来 架 橋CSと 同 等 以 上 に12週 で 骨 軟 骨 欠 損 部 に お け る 硝 子 軟 骨 再 生 を 促 進 す る こ と を 明 ら か に し た 。
口 頭 発 表 の 後 、 副 査 の 山 本 有 平 教 授 か ら 、 鮭 由 来 非 架 橋 コ ラ ー ゲ ン ス ポ ン ジ の 群 が 詮 い 理 由 、 哺 乳 類 、 魚 類 以 外 の 生 物 由 来 の コ ラ ー ゲ ン の 現 状 、 等 に つ い て 質 問 が あ っ た 。 次 に 主 査 の 三 浪 明 男 教 授 か ら 、 鮭 コ ラ ー ゲ ン の 医 療 へ 認 可 の 現 状 、 そ の 安 全 性 試 験 、Cell−free 軟 骨 再 生 の 可 能 性 、 種 の 差 に よ る コ ラ ー ゲ ン の 差 、 等 に つ い て 質 問 が あ っ た 。 最 後 に 副 査 の 安 田 和 則 教 授 か ら 鮭 コ ラ ー ゲ ン の 社 会 経 済 的 意 義 、 鮭 由 来 架 橋 コ ラ ー ゲ ン ス ポ ン ジ を 用 い た 今 後 の 研 究 の 方 向 性 に つ い て 質 問 が あ っ た 。 い ず れ の 質 問 に 対 し て も 申 請 者 は 、 自 己 の 研 究 結 果 と 文 献 的 考 察 に 基 づ い て 概 ね 妥 当 な 回 答 を 行 っ た 。
本 研 究 は 、 世 界 初 の 鮭 由 来 架 橋 ア テ ロ コ ラ ー ゲ ン ス ポ ン ジ を 開 発 し て 、 そ のin vivo軟 骨 再 生 に お け るscaffoldと し て の 基 礎 的 特 性 を 初 め て 明 ら か に し た 。 こ の 生 体 材 料 は 人 獣 共 通 感 染 症 の り ス ク の 回 避 、 良 好 な 軟 骨 再 生 誘 導 能 、 高 い 生 体 吸 収 性 、 お よ び 社 会 ・ 経 済 性 等 の 見 地 に お い て 有 望 な 軟 骨 再 生 用Scaffoldで あ り 、 こ の 領 域 の 今 後 の 研 究 に 貢 献 す る こ と が 期 待 さ れ る 。 審 査 員 一 同 は 、 こ れ ら の 成 果 を 高 く 評 価 し 、 申 請 者 が 博 士 （ 医 学 ） の 学 位 を 受 け る の に 十 分 な 資 格 を 有 す る も の と 判 定 し た 。
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