本章では、GC−1RMSによる分析よって得られた同位体比について議論する。検量線を用 いて同位体比のキャリブレーションを行い、脂肪酸の誘導体化前後での同位体比の比較を
行う。
5．1．GC−1RMSによる同位体比分析
5．1．1．原理
GC−1RMSの原理は、4．1．で解説したとおりであるので、本章では割愛する。
5．1．2．検量線作成による同位体比のキャリブレーション
2．3．2．や3．4．5．で述べたように、GC−lRMSによる同位体比分析では、装置内で分子種ごと の同位体分別が発生するため、測定対象の分子と同一構造を持ったスタンダード1こよって、
同位体比の検量線を作成し、測定対象の分子の同位体比をキャリブレーションしなければ、
正確な同位体比を得ることはできない（カ石・大場，2008）。
本研究では、MCF・ECFを用いた誘導体化によって得られた、脂肪酸エステル（メチルエス テル9種十エチルエステル9種：計18種）が測定対象分子である。そこで、水素・炭素同位体 比をEA−lRMSによって決定した（3．3．4．および3．3．5．）、同一構造を持つ18種のメチル・エチ ルエステル試薬を、GC−lRMS用の検量線用スタンダード試薬とした。
検量線は、GC−lRMSによって得られた測定値を横軸にとり、EA−lRMSによって得られた 脂肪酸メチル・エチルエステル試薬の同位体比（真値）を縦軸にとることで作成した。この検量 線に、MCF・ECFによって誘導体化して得た脂肪酸メチル・エチルエステルの測定値を代入 することで、同位体比のキャリブレーションを行った。
検量線は測定日の気温や湿度、イオンソースの状態等の影響を受け、測定日ごとに異な る。そのため、測定日が変わるたびに新しい検量線を作成し、キャリブレーションを行う必要 がある。また、GC−lRMSの検量線は、サンプルの同位体比をキャリブレーションするためだ けでなく、ダイナミックレンジの把握や、装置の状態が測定に適した状態になっているかを知 るためにも利用することができる。すなわち、正確な測定ができていたときの検量線と、傾き や切片に著しい違いはないか、検量線のR2値は適切か等を、測定のたびに確認することで、
信頼度の高いデータを得ることができる（カ石・大場，2008）。
5．2．GC−lRMSによる脂肪酸試薬および脂肪酸エステル試薬の水素同位体比分析
5．2．1．水素同位体比測定までの準備
・熱分解炉の作成
GC−1RMSによる水素同位体比分析では、試料をガスに分解するための高温炉を、分析者 自ら作成する必要がある。本研究では、長さ30cm、内径2mm程のマイクロボリュームのセ ラミック管をGC−lRMSにセットし、14000Cに設定した。昇温後、GCと1RMSとの接続を切断 し、バックフラッシュを閉じた状態で、3μ1のヘキサンを3回に分けて1μ1ずつ炉に導入し、炉 内にグラファイトコーティングを施すことで作成した。当日、この温度で、そのまま分析を行っ
た。一ｱの熱分解炉の中で、試料はH2に分解される。
・測定試薬
用いた測定試薬は、Table．2．3．2．に示したとおり、脂肪酸9種（飽和6種十不飽和3種）と、
検量線用の脂肪酸エステル試薬18種（メチルエステル9種十エチルエステル9種）である。脂 肪酸試薬は、2．2．2．で示した操作によりMCF・ECFを用いた誘導体化を施し、得られた脂肪 睦メチル・エチルエステルをヘキサンに溶かして濃度を調整したものを、オートサンプルラー にセットした。検量線用の脂肪酸エステル試薬は、純度の高いものを入手し、厳割こ封をして 保管しているため、特に前処理は行わずに、ヘキサンに溶かして濃度を調節したものを、オ ートサンプラーにセットした。他の測定条件は、Table．4．1．5．のとおりである。
・リファレンスガスの◎n1O市テストによる、安定性の確認
3．1．1．で述べたように、lRMSによる同位体比分析では、試料由来のガスの同位体比は、
直前に1RMS内に導入されたリファレンスガスの同位体比を0％。とし、そこからの差分で算出 される。この際に用いられるリファレンスガスの安定性を、ガススプリットシステムの。n！ofrテ ストによって確認する。水素ガスの場合、10回連続の◎n！o竹テストにおける標準偏差が
1．0％。以内になるまで、テストを行う。本測定では、3度のテストで、基準奉クリアした。
・H3＋ファクターの補正
1RMSによる水素同位体比の分析では、1Eによるイオン化の際、H3＋イオンが発生し、m！x
＝3に干渉することで、試料やガスの導入量に対して、量依存性を示す。固体試料の導入質 量を厳密にコントロールすることは極めて困難であるため、水素リファレンスガスの導入量を 手動で切り替え、それぞれのピFクから算出される水素同位体比を補正する方法が、lRMS のプログラムの中に用意されている。本測定でもこのH3＋ファクターの補正を行い、補正値を プログラムに認識させた。
5．2．2．水素同位体比分析結果1：検量線
検量線用の脂肪酸メチル・エチルエステル試薬の水素同位体比のGC−1RMSにおける測
定値は、Fig．5．2．2．1．のようになった。
6D va1oes of FA・0 e STD by GC・lR S δD vaIoes of FA・◎I≡t S I−0by GC・lR S 0 。 一
ま ω； ・50 国
0−100
○ 宕
・・150
3 。 ◆
i）・200 0・0
．250
◆
5 ＝
◆
◆
◆ ◆
0
ま ω＝ ・50 雪
0−100
0首
。・150
≡；
至一200
s
．250
◆ ◆
14：0 16：0 18：0 18：1 18＝2 18＝3 20：0 22：0 24：0 14＝0 16：0 I8：0 18：1 18：2 18：3 20：0 22：0 24：0
南岬acid剛・0 o， 用岬acld剛・0EO
Fig．5．2．2．1．検量線用の脂肪酸メチル（左）・エチル（右）エステル試薬の水素同位体比
検量線用の脂肪酸メチル・エチルエステル試薬の水素同位体比測定によって得られた検 量線はFig．5．2．2．2．のようになった。横軸はGC−lRMSの測定値、縦軸はEA−1RMSによって 決定した同位体比である。
δD Ca1ibration1i■1e o■1GC−1R S （EA．lR S vs．GC−1R S）
一250 0
ま ω ＝≡
τ 話
宕 ＄ ミ
o 〉
0 10
、■一n■一■、■■一U1○・UU■．．、11．U〃
50
．200 ・150 ・100 ■y30．8107x−86．474
◆＝0． ◆
◆
◆
◆ ◆FA．0 eS1 D
◆FA．0EtSfD
5Dva1ues by GC・1R S％o
Fig．5．2，2．2．GC−lRMSによる水素同位体比分析の検量線
脂肪酸メチル・エチルエステルの同位体比を複合して検量線を作成しても、良好なR2値が 得られたため、この検量線でメチル・エチルエステル両方を検量可能であることがわかった。
以降、GC−lRMSによる誘導体化した脂肪酸試薬の水素同位体比測定では、Fig．5．2．2．2．
の検量線を用いた。
5．2．3．水素同位体比分析結果2：脂肪酸試薬MCFメチルエステル誘導体
Table．2．3．2．示した脂肪酸試薬9種（飽和6種十不飽和3種）を、MCFを用いて誘導体化し て得られた脂肪酸メチルエステルの水素同位体比は、Fig．5．2．2．2．の検量線を用いてキャリ ブレーションし、Table．5．2．3．およびFig．5．2．3．のようになった。
Table．5．2．3．脂肪酸試薬9種のMCFメチルエステル誘導体の水素同位体比
・140 ・160 ・180 ま・200
0
−o．220曲。240山 。260 ．280
脂肪酸メチル誘導体 水素同位体比（％。）
・萎。川蒙
榊帖φ∵ ∴享§2．2ポ
1610 一214．31
」線鮫㌻
1㍗1華螂6一㍗
1811（n−9） 一250．97
緊1・1 讐側、弱阯」圭
1813（n−3） 一198．83
、20：ポ ㍉16α35・！
22：0 一190．55
」24：01」」 ．、二燦、4q 一 一榊1
δD va−ues of derivatized■＝A一◎㎜e by GC・■R㎜S
．
◆
◆ ◆
◆◆
咄
◆
◆
14：0 16＝0 18＝0 18：1 18＝2 18：3 20：0 22：0 24：0
Fa吐y acids（0 e）
Fig．5．2．3．脂肪酸試薬9種のMCFメチルエステル誘導体の水素同位体比
5．2．4．水素同位体比分析結果3：脂肪酸試薬ECFエチルエステル誘導体
Table．2．3．2．示した脂肪酸試薬9種（飽和6種十不飽和3種）を、ECFを用いて誘導体化し て得られた脂肪酸エチルエステルの水素同位体比は、Fig．5．2．2．2．の検量線を用いてキャリ ブレーションし、Tab1e．5．2．4．およびFig．5．2．4．のようになった。
Tab1e．5．2．4．脂肪酸試薬9種のECFエチルエステル誘導体の水素同位体比 脂肪酸エチル誘導体 水素同位体比（％。）
14：0 一233．33
1610 一221．98
18：0 一215．42
1811（n−9） 一265．54
18：2（n−6） 一189．70
18：3（n−3） 一210．83
20：O 一179．52
22：0 一188．93
24：O 一199．24
・140 ・160 ・180 ま・200
0
−o−220 ，240 ，260 ．280δD values ofderivatized FA．0Et
■1Dy GC・lR1VlS
▲ ▲
▲
▲
▲
▲
14：0 16＝0 18：0 18＝1 18：2 18：3 20＝0 22：0 24：0 ■＝a誠y acids（・0一≡t）
Fig．5．2．4．脂肪酸試薬9種のECFエチルエステル誘導体の水素同位体比
5．2．5．元の脂肪酸とMCF・ECFエステル誘導体の水素同位体比の比較
元の脂肪酸と、MCFを用いてメチルエステル化した脂肪酸およびECFを用いてエチルエ ステル化した脂肪酸の水素同位体比をTable．5．2．5．にまとめ、比較をFig．5．2．5」こ示した。
Table．5．2．5．元の脂肪酸とMCF・ECFエステル誘導体の水素同位体比 脂肪酸
誘導体化前
?f同位体比（％。）
CF誘導体化後
?f同位体比（％。）
ECF誘導体化後
?f同位体比（％。）
、1帖ql、、
、1−
Q仏05
、圭一事4奉 圭換喜夷1610 一219．93 一214．31 一221．98
練1狛1q㌻ ∴、＾享狐狐1 、貞鱒呈鎮㌶
㌘郵胡2㌻
1811（n−9） 一264．16 一250．97 一265．54
嚢葦川 家終燃繊細1・
ﾋ桑蝉嚢gpい 薫頚臓線 掲載機
1813（n−3） 一199．83 一198．83 一210．83
書轡」三
11灘硬∵ ，新邸ギ 1報1穣窯㍗
22：0 一189．19 一190．55 一188．93
㌻幸鞭㍗
ζ勲籔篶
1」1期961砿1韓詞鎮鮒
δD va1ues of origina1＆derivatized FAs before mass valance correction
一140 −160 ・180