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I
㏄Co1㎜ω
・ ㎏s榊○
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3
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6にnO1、一■1〜■榊・
肺叫
舳調■心胆9卵πn㎝
1㎜5，
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隻手・
Fig．3．1，1．EA−1RMSの原理図（左：水素同位体比分析の例）と、写真（右）
3．1．2．EA−lRMSによる分析の検量（キャリブレーション）
EA−1RMS内における、試料の分解や、ガスのイオン化等のプロセスの間に、同位体分別 が発生するため、単に試料だけを測定しても、正確な同位体比を得ることはできない。そこで、
予め同位体比の決定されているスタンダード試薬を用いて、同位体比の検量線を作成し、キ ャリブレーションを行うことで、試料の正確な同位体比を得る。
ここで、2．3．2．で述べた、GC−1RMSにおける検量と異なる点として、EA−lRMSにおける検 量線用のスタンダードは、測定対象試料と必ずしも同一の構造を持っている必要はないとい う点が挙げられる。これは、EA−1RMSでは有機分子の状態でのGC等による分離は行わな いため、熱分解または燃焼の効率が著しく異ならなければ、どのスタンダードを用いても同位 体比的1こは差が生じないためである。
従って、EA−lRMSによる分析では、まず、ラボごとに決められた複数個のスタンダートを測 定し、検量線を作成した後、実際に同位体比を分析したい試料を測定し、検量線を用いて同 位体比をキャリブレーションするという流れになる。また、検量線は測定日の気温や湿度、イ オンソースの状態等の影響を受け、測定日ごとに異なる。そのため、測定日が変わるたびに 新しい検量線を作成し、キャリブレーションを行う必要がある（Satoand Suzuki，2010；
Suzuki and Sato，2010）。
実際に当研究室で使用しているスタンダードとその同位体比をTable．3．1．2．1こ示す。スタン ダードの種類は、同位体比を測定する元素によって異なる。
Table．3．1．2．当研究室が使用しているEA−lRMS分析用スタンダード 測定対象元素 スタンダート 同位体比％。（Doal」olet値）
P◎1yethy1ene 一100．3 水素★
C36H74 一246．7 Histidine 一10．7
炭素 L−Alanine 一19．6
Glycine 一33．8 Histidine 一7．6
窒素 L−Alanine 20．O
G1ycine 1．3 Dibenzo−24−cr◎wn−8 26．8 Dibenzo−18−crown−6 12．9 酸素
β一D−Ga1act◎se 一〇．1
CloH11N04
一1515★現時点では、水素同位体比用のスタンダードが2種類しかなく、2点検量となっている。
3．2．EA−lRMSによる脂肪酸試薬および脂肪酸エステル試薬の水素同位体比分析
3．2．1．水素同位体比測定までの準備
・熱分解炉の作成
EA−1RMSによる水素同位体比分析では、試料をガスに分解するための高温炉を、分析者 自ら作成する必要がある。本研究では、長さ45cm、内径2cm程のセラミック管に、熱分解 炉専用のグラファイト試薬を詰めて、水素同位体比分析用の熱分解炉を作成した。これを EA−lRMSにセットし、14000Cで一夜べ一キングした。翌日、この温度で、そのまま分析を行っ た。この熱分解炉の中で、試料はH2に分解される。
・測定試薬
用いた測定試薬は、Table．2．3．2．に示したとおり、脂肪酸9種（飽和6種十不飽和3種）と、
GC−1RMSにおける分析に用いる検量線用の脂肪酸エステル試薬18種（メチルエステル9種 十エチルエステル9種）である。試薬は純度の高いものを入手し、厳密に封をして保管している ため、特に前処理は行わなかった。固体の試薬は、適宜、乳鉢ですりつぶし、O．1−0．3mgを 取り、銀製のフィルムに包み、液体の試料は、シリンジで0．1μ1取り、液体試料用の銀フィル ムに包んで、オートサンプラーにセットした。検量線用のスタンダードも、Table．3．1．2．に示し た水素同位体比用のものを、同様にオートサンプラーにセットした。
・リファレンスガスの。n！olfテスHこよる、安定性の確認
3．1．1．で述べたように、lRMSによる同位体比分析では、試料由来のガスの同位体比は、
直前に1RMS内に導入されたリファレンスガスの同位体比をO％。とし、そこからの差分で算出 される。この際に用いられるリファレンスガスの安定性を、ガススプリットシステムの。n！◎lfテ ストによって確認する。水素ガスの場合、10回連続の。n！olfテストにおける標準偏差が 1．0％。以内になるまで、テストを行う。本測定では、10度のテストで、基準をクリアした。
・H3＋ファクターの補正
1RMSによる水素同位体比の分析では、lEによるイオン化の際、H3＋イオンが発生し、m／x
＝3に干渉することで、試料やガスの導入量に対して、量依存性を示す。固体試料の導入質 量を厳密にコントロールすることは極めて困難であるため、水素リファレンスガスの導入量を 手動で切り替え、それぞれのピークから算出される水素同位体比を補正する方法が、1RMS のプログラムの中に用意されている。本測定でもこのH3＋ファクターの補正を行い、補正値を プログラムに認識させた。
3．2．2．水素同位体比分析結果1：検量線
検量線用のスタンダードの水素同位体比測定によって得られた検量線はFig．3．2．2．のよう になった。
5D calibratio■11iI1e on EA．1R S
幸○
。
o
＝
o
〉0
10…≡…
岸
一250
50
．200 ・150 一100 ・50y＝0，861x・66．2：■。：I−
@ R24
easored5D va．oes IlDy EA・．R S％o
Fig．3．2．2．EA−lRMSによる水素同位体比分析の検量線
現状では、Tab1e．3．1．2．に示したように、水素同位体比分析の検量は2点検量となってい る。これは、水素同位体比測定用のスタンダードには、交換性水素の持たないもので、さらに その同位体比がある程度の幅（200％。程度）を持っていなくてはならないため、当研究室では 現在、3つ目のスタンダードを確立できていないためである。そのため、EA−lRMS自体の状 態が極端に悪化した場合等は、本手法では対応できない可能性がある。そこで、検量線用ス タンダードとまでは言えないが、交換性水素を持たないn一アルカン試薬を同時に測定し、測定 値に著しい差が生じていないことを確認している。これまでこの方法で2点検量を採用してき たが、不正確なデータを与えたことはない。従って経験的には、本方法でも現状は問題ないと 考えられる。
加えて現在、当研究室では、上記のn一アルカンを検量線用のスタンダードに組み込むため に、繰り返し測定による安定性を調査している。検量線用のスタンダードが3つ以上となれば、
より確実な測定が可能になると考えられる。
以降、EA−lRMSによる脂肪酸試薬および脂肪酸メチル・エチルエステル試薬の水素同位 体比測定では、Fig．3．2．2．の検量線を用いた。
3．2．3．水素同位体比分析結果2：脂肪酸試薬
Tab1e．2．3．2．示した脂肪酸試薬9種（飽和6種十不飽和3種）の水素同位体比は、Fig．3．2．2．
の検量線を用いてキャリブレーションし、Table．3．2．3．およびFig．3．2．3．のように決定された。
Tab1e．3．2．3．脂肪酸試薬9種（飽和6種十不飽和3種）の水素同位体比
脂肪酸 水素同位体比（％。）
@ o＝5平均
1σ標準偏差（％。）
@ 11＝5
14：O 一241．05 O．68
16二0 一219．93 0．36
18：0 一211．11 0．52
18：1（n−9） 一264．16 2，86
18：2（hτ9） 一184，90 0−54
1813（n−3） 一199．83 1．16
20：0 一161．49 0．34
22＝0 一189．19 0．61
24：O 一200．92 1．00
δD va1ues of original FAs by EA．lRMS
■140 ・160 ・180 ま・200
0 0．220
，240 ，260 ．280
◆
◆
o■■一川■
◆
◆
14：0 16：0 18：0 18：1 18：2 18：3 20＝0 22：0 24：0 ■＝atty acids（o■ igi■1a■）
Fig．3．2．3．脂肪酸試薬9種（飽和6種十不飽和3種）の水素同位体比
3．2．4．水素同位体比分析結果3：脂肪酸メチルエステル試薬
伯b1e．2．3．2．示した脂肪酸メチルエステル試薬9種（飽和6種十不飽和3種：GC−lRMS測 定における検量線用試料）の水素同位体比は、Fig，3．2．2．の検量線を用いてキャリブレーショ ンし、伯ble．3．2．4．およびFig．3．2．4．のように決定された。
Tab1e．3．2．4．脂肪酸メチルエステル試薬9種（飽和6種十不飽和3種）の水素同位体比 脂肪酸メチル 水素同位体比（％。）
@ n＝3平均
1σ標準偏差（％。）
@ ■1＝3 14：O−OMe 一238．93 O．19 16＝0−OMe 一203．53 1．73 18：0−OMe 一213．03 O．42
18：1（n−9）一〇Me 一272．93 0．13
！8：2（・二6）卸・ 一187．17 1．37
18：3（n−3）一〇Me 一229．59 1．23
20：0−OMe 一237．62 1．13
22：0−OMe 一187．50 0．11 24：O−OMe 一20β．25 1．68
δD values of FA．O e STD by EA−1RMS ・160
・180 ，200
妻
0・220
10
，240 ，260 ．280
◆ ◆
◆ ◆
◆
◆
14：0 16：0 18：0 18：1 18：2 18：3 20：0 22：0 24：0 ■＝atty acids（・0 e）
Fig．3．2．4．脂肪酸メチルエステル試薬9種（飽和6種十不飽和3種）の水素同位体比
3．2．5．水素同位体比分析結果4：脂肪酸エチルエステル試薬
Table．2．3．2．示した脂肪酸エチルエステル試薬9種（飽和6種十不飽和3種：GC−lRMS測 定における検量線用試料）の水素同位体比は、Fig．3．2．2．の検量線を用いてキャリブレーショ ンし、伯b1e．3．2．5．およびFig．3．2．5．のように決定された。
Tab1e．3．2．5．脂肪酸エチルエステル試薬9種（飽和6種十不飽和3種）の水素同位体比 脂肪酸エチル 水素同位体比（％。）
@ n＝3平均
1σ標準偏差（％。）
@ 11＝3
14：0−OEt 一233．58 1．04
16＝0−OEt 一216．21 0．88
18：0−OEt 一206．58 0．96
18：1（n−9）一〇Et 一228．75 1．14
181ク（n16）二〇Et 一165．88」 3．77
1813（n−3）一〇Et 一230．47 3．92
20：0−OEt 一154．37 1．30
22＝O−OEt 一185．59 1．75
24：0−OEt 一192．13 O，68
δD values of FA−O一≡t STD by一≡A−1R1V1S ・130
，150 ・170
幸●
・190
0
10・210 ，230 ．250
◆
◆
◆
14：0 16二0 18：0 18：1 18：2 18：3 20＝0 22：0 24：0 I＝a岨y acids（．0Et）
Fig．3．2．5．脂肪酸エチルエステル試薬9種（飽和6種十不飽和3種）の水素同位体比
3．3．EA−1RMSによる脂肪酸試薬および脂肪酸エステル試薬の炭素同位体比分析
3．3．1．炭素同位体比測定までの準備
・燃焼炉の作成
EA−1RMSによる炭素同位体比分析では、試料をガスに分解するための高温炉を、分析者 自ら作成する必要がある。本研究では、長さ45cm、内径2cm程のガラス管に、燃焼炉専用 の酸化クロム試薬を詰めて、炭素同位体比分析用の燃焼炉を作成した。これをEA−lRMSに セットし、100ぴCで一夜べ一キングした。翌日、この温度で、そのまま分析を行った。この燃焼 炉の中で、試料はC02に分解される。
・測定試薬
用いた測定試薬は、Tab1e．2．3．2．に示したとおり、脂肪酸9種（飽和6種十不飽和3種）と、
GC−lRMSにおける分析に用いる検量線用の脂肪酸エステル試薬18種（メチルエステル9種 十エチルエステル9種）である。試薬は純度の高いものを入手し、厳密に封をして保管している ため、特1こ前処理は行わなかった。固体の試薬は、適宜、乳鉢ですりつぶし、0．8−1．0mgを 取り、スズ製のフィルムに包み、液体の試料は、シリンジでO．3μ1取り、液体試料用のスズフイ ルムに包んで、オートサンプラーにセットした。検量線用のスタンダードも、Table．3．1．2．に示 した炭素同位体比用のものを、同椥こオートサンプラーにセットした。
・リファレンスガスの◎n！O市テストによる、安定性の確認
3．1．1．で述べたように、lRMSによる同位体比分析では、試料由来のガスの同位体比は、
直前にlRMS内に導入されたリファレンスガスの同位体比をO％。とし、そこからの差分で算出 される。この際に用いられるリファレンスガスの安定性を、ガススプリットシステムの◎n／O市テ ストによって確認する。二酸化炭素ガスの場合、10回連続の。n／o市テスHこおける標準偏差 が0．2％。以内になるまで、テストを行う。本測定では、10度のテストで、基準をクリアした。