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博 士 論 文 概 要

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Academic year: 2022

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(1)早稲田大学大学院 先進理工学研究科. 博 士 論 文 概 要. 論. 文. 題. 目. 重層扁平上皮細胞シートの細胞採取組織の評価法の確立 およびモデル系を用いた接着後の挙動解析 Establishment of an evaluation method for epithelial tissue as cell source for stratified squamous epithelial cell sheets and examination of cellular events after cell sheet grafting by using in vitro model 申. 請. 者. 葛西. 善行. Yoshiyuki. KASAI. 生命医科学専攻 生命機能材料科学研究. 2016 年 5 月.

(2) 培養技術の進歩や生体組織の分子生物学的理解が進んだことにより、培養で作 製した組織を移植して生体の組織の再生を目指すという再生医療研究が進められ ている。本研究で対象とした「細胞シート」は、心臓や角膜など様々な組織に移 植され、ヒト臨床において良好な結果が得られている。申請者も従事した食道再 生のプロジェクトは、食道粘膜癌を組織の広範囲にわたって内視鏡的に切除 ( ESD) し た 後 の 創 傷 床 に 患 者 由 来 の 口 腔 粘 膜 細 胞 シ ー ト を 移 植 し 、 食 道 の 再 上 皮化を促進させると共に合併症となる食道の狭窄防止を目的した臨床研究であり、 画期的な治療法としての確立を目指している。しかし、この治療法における一連 の操作の中で特にシートの作製に用いる細胞やそれらを採取する組織が正常であ ることを簡便かつ正確に評価すること、ならびに移植した細胞シートの治療の過 程における挙動と治癒機構を明らかにすることが、安全な治療法の確立には必須 であるとの課題が存在している。そこで本博士研究では、ヒト重層扁平上皮の細 胞シートを対象として、これら二つの課題の解決を研究目的とした。まず、細胞 を採取する口腔粘膜上皮組織の正常性を低侵襲的に評価する手法の確立を行った。 また、上皮細胞から作製した重層扁平上皮細胞シートについて、各層の細胞の形 状や性状および動的な挙動変化を詳細に解析することで、移植治療における治癒 機構の解明を目指した。本論文は全四章から構成される。以下に詳細を述べる。 第一章では、本研究の背景と目的をまとめた。背景については、重層上皮組織 における細胞生物学および組織学上の知見や細胞シートの作製に用いる温度応答 性培養器材、ならびに細胞シートを用いた再生医療研究のこれまでの成果などに ついて記述した。また、研究チームの一員として参加した、細胞シートを移植し て食道上皮を再生させる臨床研究についても、研究の背景として記載した。 第二章では、細胞シート作製のための細胞を採取するのに重要な口腔粘膜上皮 について、上皮の組織および細胞の性状を低侵襲かつ精度よく診断する手法の研 究をまとめた。食道癌に対する自家細胞シート移植治療の研究が進められている が、患者が口腔癌や口腔前癌病変を併発していることが少なくなく、これら口腔 粘膜上皮組織から細胞を採取して細胞シートを作製した場合、移植した細胞シー トがあらたな癌の原発巣となる危険性がある。よって、口腔粘膜組織の性状の事 前診断が重要となる。しかし、多くの場合に口腔外科医が目視で診断をしている のが現状であり、この方法では診断が難しい前癌病変も存在するため精度に問題 が残る。切除により採取した組織の一部を免疫染色し、発現タンパク質を解析す る確定診断法もあるが、細胞シート作製のために再度組織を切除して細胞を採取 する必要があるため、患者の負担が大きく非現実的である。 ブラシバイオプシーは、歯ブラシで口腔粘膜上皮組織を擦過するだけの低侵襲 な細胞採取法である。しかし、細胞の診断は顕微鏡で形態を観察することのみが No.1.

(3) 行われ、精度に課題があった。本研究では、このブラシバイオプシーにタンパク 質 の 発 現 解 析 で あ る ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ ( WB) を 組 み 合 わ せ て 、 分 子 レ ベルでの高い精度で口腔粘膜上皮組織の性状を評価する手法の確立を行った。 非角化重層扁平上皮である頬粘膜と口唇ならびに角化重層扁平上皮である歯肉 と口蓋の 4 か所の口腔粘膜部位を対象とし、ブラシバイオプシーにより無麻酔か つ 無 出 血 で 4 人 の ド ナ ー か ら 上 皮 細 胞 を 採 取 し て WB で 解 析 し た 。 ま ず 、 粘 膜 上 皮 の 分 化 マ ー カ ー で あ る Keratin( K) 4 と K13 が 全 て の 部 位 で 発 現 し て い る こ と を 示 し 、 こ れ よ り 、 ブ ラ シ バ イ オ プ シ ー が 低 侵 襲 的 な が ら も WB 解 析 に 十 分 量 の細胞試料を採取できることを証明した。続いて、角化組織に特異的なマーカー タ ン パ ク 質 で あ る K1 と K10 を 分 析 し 、 こ れ ら は 角 化 組 織 で あ る 歯 肉 と 硬 口 蓋 で の み 検 出 さ れ る こ と を 示 し た 。 さ ら に 、 基 底 層 マ ー カ ー で あ る K14 と K15 が 頬 粘膜、歯肉、口唇で検出されないことから、ブラシバイオプシーが上層の細胞の みを採取する手法であることを示した。以上より、本研究で開発したブラシバイ オ プ シ ー と WB を 組 み 合 わ せ る 組 織 解 析 手 法 は 、 特 定 の 組 織 の 性 状 の 違 い を 低 侵 襲的かつ正確に解析できることを明らかにした。これに加えて、口腔癌の培養細 胞 に 発 現 し て い る マ ー カ ー タ ン パ ク 質 の 解 析 を 行 い 、 K4、 K8、 K17 は 正 常 上 皮 組織との比較において発現に差異があることを示した。既往の病理学研究による と 、 口 腔 上 皮 組 織 の 病 変 に よ り 、 本 研 究 で 分 析 対 象 と し た K1、 K4、 K8、 K10、 K14、 K17 を 含 む 複 数 の マ ー カ ー タ ン パ ク 質 の 発 現 が 変 化 す る こ と が 知 ら れ て い る。よって、本手法によりこれらマーカータンパク質を解析することで、正常と 病変の組織を高い精度で判別し得ると考えられる。 第三章では、重層扁平上皮細胞シートの移植治療における治癒機構の解明を目 指し、創傷床のモデルとしたハイドロゲル上に細胞シートを接着させた後の経時 的な挙動変化について、詳細に解析した研究をまとめた。患者に移植した重層扁 平上皮細胞シートの治癒過程における挙動については、シートを患部から回収し て解析試料とすることの侵襲性が高く非現実的であるため、十分な知見が得られ て い な い 。ま た 、 i n v i v o で の 直 接 の 解 析 は 、創 傷 床 に 存 在 す る 様 々 な 細 胞 や サ イ トカインが複雑に影響を及ぼし合い、困難となると予想される。そこで本研究で は、食道癌切除後に露出する結合組織に着目し、その主要タンパク質である I 型 コ ラ ー ゲ ン の ハ イ ド ロ ゲ ル を 用 い た シ ン プ ル な in vitro モ デ ル 実 験 系 を 考 案 し た 。 こ こ に ヒ ト 表 皮 角 化 細 胞 ( NHEK) の 重 層 扁 平 上 皮 細 胞 シ ー ト を 貼 付 し て 培 養 を 行い、細胞シートの形状や細胞の遊走挙動ならびに遺伝子発現や各層のタンパク 質の発現パターンを経時的に解析した。 まず、シート組織の切片を用いて様々なタンパク質の免疫染色を施し、細胞シ ー ト が 6 ― 10 層 か ら な る 構 造 を 有 し 、 細 胞 間 接 着 に 関 わ る E-cadherin と β-catenin な ら び に 上 皮 細 胞 に 特 異 的 な 中 間 径 フ ィ ラ メ ン ト で あ る Keratin を 全 No.2.

(4) 層にわたり発現するという重層扁平上皮組織に特徴的な性質を持つことを示した。 温度応答性培養基材から剥離回収した後の細胞シートは全体的に収縮し、これは 上 層 に 発 現 す る P - M L C が 関 与 す る バ リ ア 機 能 に 由 来 す る と 考 え ら れ た 。さ ら に 、 基 底 層 で は L a m i n i n 5 や I n t e g r i n な ど が 発 現 し 、シ ー ト が 細 胞 外 マ ト リ ッ ク ス に 接着する能力を持つことが示された。 細胞シートをコラーゲンゲルに貼付すると基底層に発現するタンパク質が働き、 1 時間後にはシェイカーによる強い振盪に耐えられる強度の接着が形成された。 接 着 1 日 後 に は 、 Integrin 陽 性 の 基 底 層 に お い て E-cadherin と β-catenin の 減 少 と Vi m e n t i n の 発 現 が 観 察 さ れ 、 上 皮 組 織 の 細 胞 間 接 着 が 減 少 し て 遊 走 能 を 獲 得 す る と い う 上 皮 間 葉 系 移 行 ( EMT) が 起 こ っ た と 考 察 さ れ た 。 こ の EMT を 詳 細 に 解 析 す る た め に 、阻 害 剤 添 加 や 定 量 P C R の 実 験 を 行 っ た が 、マ ー カ ー 分 子 の 遺 伝 子 発 現 の 明 確 な 変 化 は 得 ら れ な か っ た 。こ れ よ り 、細 胞 シ ー ト の 基 底 層 で は 、 遊走能は獲得したものの間葉系に完全に移行したのではないという、上皮細胞と 間 葉 系 細 胞 の 中 間 的 な 状 態 で あ る Partial EMT が 起 こ っ た と 考 え ら れ た 。 Partial EMT を 起 こ し て い る 細 胞 シ ー ト を タ イ ム ラ プ ス 顕 微 鏡 に よ り 経 時 的 に 観察すると、細胞シートの縁で細胞遊走が実際に観察された。粒子イメージ流速 計 測 法 ( PIV) に よ り 遊 走 の 方 向 や 速 度 を 定 量 的 に 解 析 す る と 、 上 層 の 収 縮 挙 動 に抗して基底層の細胞が遊走して被覆面積を拡大していること、同方向に遊走す る細胞が群を形成して基底層内にいくつかの群が観察されること、細胞シート先 端 で の 細 胞 の 遊 走 速 度 が 最 大 で 約 47 µm/h に 達 す る こ と 、が 分 か っ た 。こ の よ う に上皮細胞シートの基底層と上層がそれぞれの独自の機能を発揮していることを 見出した。最後に、コラーゲンゲルに線維芽細胞を包埋して生体の創傷床の環境 により近づけたモデル系を用いて細胞シートの貼付実験を行ったところ、細胞遊 走 速 度 が 約 6 7 µ m / h ま で に 増 大 し 、被 覆 面 積 も 顕 著 に 増 大 す る こ と が 見 出 さ れ た 。 これより、臨床治療において創傷床へ細胞シートを移植すると、線維芽細胞と相 互作用することで被覆作用が亢進し、創傷治癒が効率的に進むと考察された。 第四章では本博士研究の全体を総括し、今後の課題と展望について述べた。 研究対象とした重層扁平上皮細胞シートは、生体組織と比べて薄くはあるもの の上層と基底層では異なる形状や性状さらに運動性を示す細胞から構成され、そ の異なる細胞の特性は細胞シートを貼付することで顕著に発現することが本研究 で 明 ら か に な っ た 。特 に 、接 着 後 の 細 胞 シ ー ト の 基 底 層 で P a r t i a l E M T が 起 こ り 、 創傷治癒に有効に機能することを示唆する知見が得られたことは、今後、治療効 果を増大させるためのプロトコルの開発に繋がると期待される。また、低侵襲的 な ブ ラ シ バ イ オ プ シ ー に よ る 上 層 の 細 胞 の 採 取 と WB を 組 み 合 わ せ た 組 織 診 断 法 の確立もあわせて、本研究は基礎研究としてのみならずトランスレーショナルリ サーチとしても価値があると考えられる。 No.3.

(5) No.1. 早稲田大学 博士(理学) 氏 名. 葛西 善行. 学位申請 研究業績書. 印 (2017 年. 種 類 別. 題名、. 発表・発行掲載誌名、. 発表・発行年月、. 3月. 現在). 連名者(申請者含む). 【論文】○ ・Yoshiyuki Kasai, Naoya Takeda, Ryo Takagi, Shinichiro Kobayashi, Masayuki Yamato. “Cellular events and behaviors after grafting of stratified squamous epithelial cell sheet onto a hydrated collagen gel”, FEBS Open Bio, 2017, in press, DOI: 10.1002/2211-5463.12213. 【論文】○ ・Yoshiyuki Kasai, Hiroaki Sugiyama, Ryo Takagi, Makoto Kondo, Toshiyuki Owaki, Hideo Namiki, Teruo Okano, Naoya Takeda, Masayuki Yamato. “Brush biopsy of human oral mucosal epithelial cells as a quality control of the cell source for fabrication of transplantable epithelial cell sheets for regenerative medicine”, Regen Ther, 2016, 4: 71-7. 【論文】. ・Ryo Takagi, Shinichiro Kobayashi, Masayuki Yamato, Toshiyuki Owaki, Yoshiyuki Kasai, Takahiro Hosoi, Yusuke Sakai, Kengo Kanetaka, Tokutaro Minamizato, Asuka Minematsu, Makoto Kondo, Nobuo Kanai, Naoyuki Yamaguchi, Kazuhiro Nagai, Yasushi Miyazaki, Naoya Takeda, Fumio Fukai, Izumi Asahina, Taiga Miyazaki, Shigeru Kohno, Masakazu Yamamoto, Kazuhiko Nakao, Susumu Eguchi, Teruo Okano. “How to prevent the contamination with Candida albicans during the fabrication of transplantable oral mucosal epithelial cell sheets”, Regen Ther, 2015, 1: 1-4.. 【論文】. ・Shinichiro Kobayashi, Nobuo Kanai, Takeshi Ohki, Ryo Takagi, Naoyuki Yamaguchi, Hajime Isomoto, Yoshiyuki Kasai, Takahiro Hosoi, Kazuhiko Nakao, Susumu Eguchi, Masakazu Yamamoto, Masayuki Yamato, Teruo Okano. “Prevention of esophageal strictures after endoscopic submucosal dissection”, World J Gastroenterol, 2014, 20: 15098-109.. 【講演】. ・○葛西 善行, 武田 直也, 高木 亮, 大和 雅之. “コラーゲンゲル接着による重層扁平上皮 細胞シートの EMT 挙動解析”, 第 16 回 再生医療学会総会, O-25-3, 宮城. 2017 年 3 月. (口頭発表). 【講演】. 【講演】. ・○Yoshiyuki Kasai, Ryo Takagi, Shinichiro Kobayashi, Teruo Okano, Naoya Takeda, Masayuki Yamato. “In vitro studies on the mechanistic details of adhesion and wound healing of epithelial cell sheet therapy”, JSPS A3 foresight international symposium on nano-biomaterials and regenerative medicine, Tokyo, Japan. March, 2016.(Oral) ・○Yoshiyuki Kasai, Ryo Takagi, Shinichiro Kobayashi, Teruo Okano, Naoya Takeda, Masayuki Yamato. “In vitro studies on the mechanistic details of adhesion and wound healing of epithelial cell sheet therapy”, JSPS A3 foresight international symposium on nano-biomaterials and regenerative medicine, Tokyo, Japan. August, 2015.(Oral).

(6) No.2. 早稲田大学 博士(理学) 種 類 別. 題名、. 発表・発行掲載誌名、. 学位申請 研究業績書 発表・発行年月、. 連名者(申請者含む). 【講演】. ・○葛西 善行, 大和 雅之, 高木 亮, 小林 慎一朗, 杉山 洋章, 江口 晋, 武田 直也, 岡野 光夫. “上皮細胞シートの ESD 創面への生着と創傷治癒機構の ex vivo モデルによる解 析”, 第 14 回 日本再生医療学会総会, O-12-3, 神奈川. 2015 年 3 月.(口頭発表). 【講演】. ・小林 慎一朗, 金井 信雄, 細井 孝洋, 葛西 善行, 高木 亮, 大和 雅之, 江口 晋. “再生 医療本格化に向けた食道領域における組織工学的治療戦略と前臨床研究での検討”, 第 14 回 日本再生医療学会総会, O-40-2, 神奈川. 2015 年 3 月.(口頭発表). 【講演】. ・○葛西 善行, 大和 雅之, 高木 亮, 小林 慎一朗, 武田 直也, 岡野 光夫. “Ex vivo studies on the mechanistic details of adhesion and wound healing of epithelial cell sheet therapy”, 私立大学戦略的基盤形成支援事業ストレス応答制御に基づく次世代型 健康寿命科学の研究拠点形成 第 3 回 成果報告会, #16, 東京. 2015 年 3 月.(ポスター発 表). 【講演】. ・○Yoshiyuki Kasai, Ryo Takagi, Shinichiro Kobayashi, Susumu Eguchi, Teruo Okano, Naoya Takeda, Masayuki Yamato. “Ex vivo studies on the mechanistic details of adhesion and wound healing of epithelial cell sheet”, The 16th joint symposium between the University of Bonn and Waseda University, Tokyo Japan. February, 2015.(Oral). 【講演】. ・○Yoshiyuki Kasai, Masayuki Yamato, Ryo Takagi, Shinichiro Kobayashi, Naoya Takeda, Teruo Okano. “In vitro studies on the mechanistic details of adhesion and wound healing of epithelial cell sheet therapy”, JSPS A3 Foresight international symposium on nano-biomaterials and regenerative medicine, P42, Tokyo, Japan. October, 2014.(Poster). 【講演】. ・○Yoshiyuki Kasai, Masayuki Yamato, Hiroaki Sugiyama, Ryo Takagi, Makoto Kondo, Shinichiro Kobayashi, Naoya Takeda, Teruo Okano. “The molecular mechanism of cell sheet adhesion”, International symposium on integration of chemistry and bioscience, P34, Tokyo, Japan. January, 2014.(Poster). 【講演】. ・○葛西 善行, 大和 雅之, 杉山 洋章, 高木 亮, 近藤 誠, 並木 秀男, 武田 直也, 岡野 光夫. “ブラシバイオプシー法を用いたヒト口腔上皮組織におけるケラチンの網羅的発現 解析”, 第 36 回 日本分子生物学会年会, #1012, 神戸. 2013 年 12 月.(ポスター発表). 【講演】. ・○Yoshiyuki Kasai, Masayuki Yamato, Hiroaki Sugiyama, Ryo Takagi, Makoto Kondo, Hideo Namiki, Naoya Takeda, Teruo Okano. “Western blot analysis of keratin expressions in human oral mucosal epithelial cells collected by brush biopsy”, TERMIS-AP 2013, #111, Shanghai and Wuzhen, China. October, 2013. (Poster).

(7) No.3. 早稲田大学 博士(理学) 種 類 別. 題名、. 発表・発行掲載誌名、. 学位申請 研究業績書 発表・発行年月、. 連名者(申請者含む). 【講演】. ・大脇 敏之, 高木 亮, 近藤 誠, 葛西 善行, 細井 孝洋, 堺 裕輔, 江口 晋, 大和 雅之, 岡野 光夫. “輸送後の細胞シートの品質安定性”, 第 12 回 再生医療学会, H-3-2, 神奈川. 2013 年 3 月.(ポスター発表). 【講演】. ・○葛西 善行, 杉山 洋章, 高木 亮, 近藤 誠, 大和 雅之, 並木 秀男, 岡野 光夫. “頬粘膜 上皮細胞シートの品質管理を目的とした抗体 AE5 の解析”, 第 22 回 バイオマテリアル若 手研究会, A16, 東京. 2011 年 11 月.(ポスター発表). 【その他】 ・○葛西 善行. “大学院生としての再生医療研究への取り組み”, 未来医学 特集 III 未来医 学研究会のいま, No. 29, 2016 年 3 月. 【その他】 ・○葛西 善行. “市民講座 聴講報告”, 未来医学 特集 III 未来医学研究会の活動, No. 28, 2015 年 3 月.. 以下余白.

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