博博博博 士士士士 論論論論 文文文文 概概概概 要要要要

博 博 博

博 士 士 士 士 論 論 論 論 文 文 文 文 概 概 概 概 要 要 要 要

論 論 論

論 文 文 文 文 題 題 題 題 目 目 目 目

両生類生殖腺の雌化遺伝子 CYP19 の 発現機構に関する研究

Promotion of CYP19 expression during feminization of indifferent gonads in the frog Rana rugosa

申 請 者

大島 裕希

Yuki Oshima

生命理工学専攻 分子生殖生物学研究

2007 年 12 月

Ｎｏ.1

脊 椎 動 物 は 多 く の 場 合 、 受 精 時 に そ の 染 色 体 の 組 み 合 わ せ に よ り 遺 伝 的 に 性 が 決 定 さ れ る 。 そ の 後 、 そ の 性 に 依 存 し て 、 性 分 化 関 連 遺 伝 子 群 が 働 き 、 未 分 化 生 殖 腺 を 精 巣 ま た は 卵 巣 へ と 分 化 さ せ る 。 こ の 過 程 に 関 す る 研 究 は 、 こ れ ま で に 主 に 哺 乳 類 ・ 鳥 類 ・ 魚 類 を 中 心 と し て な さ れ て お り 、 関 連 す る 遺 伝 子 が 多 数 同 定 さ れ て き た 。 し か し な が ら 、 両 生 類 に お け る こ の 分 野 に 関 す る 報 告 は 多 く な く 、 解 析 も 不 十 分 で あ る 。 本 研 究 は 両 生 類 ツ チ ガ エ ル(Rana rugosa)を 用 い 、特 に 卵 巣 分 化 機 構 に 注 目 し て 研 究 を 行 な っ た 。 卵 巣 分 化 に は エ ス ト ラ ジ オ ー ル が 重 要 で あ る こ と が 知 ら れ て い る 。 エ ス ト ラ ジ オ ー ル を テ ス ト ス テ ロ ン か ら 合 成 す る 反 応 を 触 媒 す る 酵 素 遺 伝 子 が CYP19 で あ る 。 卵 巣 分 化 は こ の 遺 伝 子 の 発 現 調 節 が 重 要 で あ る と 考 え ら れ て い る た め 、 本 研 究 は こ の 遺 伝 子 の 転 写 調 節 機 構 を 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し た 。

第 1 章 で は 、 性 決 定 ・ 性 分 化 機 構 に つ い て 、 哺 乳 類 ・ 鳥 類 ・ 魚 類 を 中 心 に 得 ら れ て い る 研 究 成 果 を も と に 、 卵 巣 分 化 過 程 に お け る CYP19 の 働 き と 、 そ の 転 写 調 節 に 関 わ る と 推 測 さ れ る 遺 伝 子 と し て SF-1, FoxL2, Sox3 に つ い て 概 説 す る 。 さ ら に 、 卵 巣 分 化 研 究 に お け る 本 研 究 の 位 置 づ け を 示 し 、 目 的 と 意 義 に つ い て 述 べ て い る 。 ま た 、 本 研 究 の 実 験 動 物 で あ る ツ チ ガ エ ル に つ い て 、 そ の 実 験 動 物 と し て の 特 徴 と 雌 雄 判 定 法 、 発 生 段 階 分 期 法 に つ い て 説 明 し て い る 。

第 2 章 で は 、 卵 巣 分 化 過 程 に 関 与 し て い る と 考 え ら れ る 遺 伝 子 の 発 現 解 析 に つ い て 示 し て い る 。ツ チ ガ エ ル に お い て FoxL2 cDNA 配 列 は 得 ら れ て い な か っ た た め 、最 初 に こ の 遺 伝 子 の 単 離 を 行 な っ た 。こ の 結 果 、1587 bp の ツ チ ガ エ ル FoxL2 cDNA 配 列 を 決 定 し 、 こ の 配 列 か ら 302 残 基 の ア ミ ノ 酸 配 列 が 推 定 さ れ た 。 次 に 、 こ れ ら の 遺 伝 子 に 特 異 的 な プ ラ イ マ ー を 作 製 し 、 成 体 各 組 織 に お け る 発 現 を 調 べ た 。 そ の 結 果 、3 つ の 遺 伝 子 は 卵 巣 で 強 く 発 現 し て い る こ と が 分 か っ た 。 さ ら に 、 こ れ ら の 遺 伝 子 の 発 生 過 程 に お け る 発 現 を リ ア ル タ イ ム RT-PCR 法 を 用 い て 解 析 し た 。SF-1 ^{は 卵 巣 分 化} の 開 始 時 期 st.25~Ⅲ に お い て 、 雌 雄 差 は 見 ら れ な か っ た が 、CYP19, FoxL2, Sox3 に つ い て は 生 殖 腺 の 形 態 的 分 化 の 起 こ る 前 の 時 期 st.25 か ら す べ て の 段 階 で 雌 生 殖 腺 に 強 い 発 現 を 示 す こ と が 明 ら か と な っ た 。さ ら に in situ hybridization法 に よ り 、CYP19 と Sox3 に つ い て 、st.I の 生 殖 腺 で 発 現 解 析 を 行 な い 、 共 に 雌 生 殖 腺 の 体 細 胞 に 見 ら れ た 。 リ ア ル タ イ ム RT-PCR 法 に よ り 、FoxL2 及 び Sox3 が CYP19 と 同 様 に 卵 巣 分 化 に 先 立 っ て 雌 生 殖 腺 に お い て 強 い 発 現 が 見 ら れ 、 特 に Sox3 ^{に つ い て は} in situ hybridization法 に よ り 、st.I雌 生 殖 腺 の 体 細 胞 に お い て CYP19と 共 発 現 を し て い た 。 こ の こ と か ら 、Sox3 と CYP19 の 相 互 作 用 が 期 待 さ れ た 。

第 3 章 は ツ チ ガ エ ル ゲ ノ ム DNA ラ イ ブ ラ リ ー の 作 製 と CYP19 遺 伝 子 の ス ク リ ー ニ ン グ に つ い て 述 べ て い る 。CYP19 の 転 写 調 節 機 構 を 解 析 す る に あ た り 、そ の プ ロ モ ー タ 領 域 の 単 離 は 不 可 欠 で あ る た め 、 ゲ ノ ム DNA ラ イ ブ ラ リ ー の 構 築 を 行 な っ た 。 ゲ ノ ム DNA は ZZ 型 成 体 オ ス よ り 抽 出 し 、 約 40 kbp に 断 片 化 し て 精 製 し 、 ゲ ノ ム ラ イ ブ ラ リ ー の 作 製 に 用 い た 。ラ イ ブ ラ リ ー は 192 本 の グ リ セ ロ ー ル ス ト ッ ク と し て 保 存 し て お り 、 こ の ラ イ ブ ラ リ ー に は 理 論 上 、 ツ チ ガ エ ル ゲ ノ ム の 99%が 網 羅 さ れ て い る

と 推 測 さ れ る 。 次 に 、 作 製 し た ラ イ ブ ラ リ ー を 用 い て CYP19 遺 伝 子 の ス ク リ ー ニ ン グ を 試 み た 。 手 法 と し て は 、CYP19 特 異 的 プ ラ イ マ ー を 用 い た コ ロ ニ ーPCR 法 に よ る 段 階 的 ス ク リ ー ニ ン グ を 行 な い 、最 終 的 に CYP19 標 的 配 列 を 含 む ゲ ノ ム DNA ク ロ ー ン を 得 る こ と に 成 功 し た 。得 ら れ た ク ロ ー ン は 約 40 kbpの ゲ ノ ム DNA断 片 を 含 み 、 塩 基 配 列 を 解 析 し た と こ ろ 、CYP19 の 翻 訳 開 始 点 を 含 む 第 2 エ ク ソ ン 及 び そ の 下 流 の 第 3 エ ク ソ ン が 含 ま れ て い る こ と が 確 認 さ れ た 。 ヒ ト お よ び マ ウ ス を 用 い た 研 究 に よ り 、CYP19 に は 組 織 特 異 的 バ リ ア ン ト が 複 数 存 在 し て い る こ と が 報 告 さ れ て い る 。そ れ ら は 、 そ れ ぞ れ 特 異 的 第 1 エ ク ソ ン と プ ロ モ ー タ を 持 ち 、 翻 訳 開 始 点 を 含 む エ ク ソ ン(第 2 エ ク ソ ン)以 下 を 共 通 で 持 つ 。さ ら に 、卵 巣 型 CYP19 は 第 2 エ ク ソ ン を 転 写 開 始 点 と し て お り 、第 1 エ ク ソ ン を 持 た な い 。ツ チ ガ エ ル で 既 に 単 離 さ れ て い た CYP19 cDNA は 卵 巣 由 来 の も の で あ り 、 そ の 転 写 開 始 点 と 翻 訳 開 始 点 が 同 一 の エ ク ソ ン で あ っ た こ と か ら 、こ の エ ク ソ ン を 第 2 エ ク ソ ン と し た 。ま た 、脳 に お い て CYP19 cDNA の 単 離 を 試 み た と こ ろ 、 卵 巣 型 CYP19 よ り も 長 い 5’非 翻 訳 領 域 が 得 ら れ た 。 こ の 領 域 を 得 ら れ た CYP19 遺 伝 子 断 片 に お い て 検 索 し た と こ ろ 、 第 2 エ ク ソ ン の 上 流 11.8 kbp の 位 置 に 存 在 す る こ と が わ か っ た た め 、 こ の エ ク ソ ン を 第 1 エ ク ソ ン と し た 。 本 研 究 で は 卵 巣 型 CYP19 の 転 写 調 節 機 構 に 注 目 し て い る た め 、第 2エ ク ソ ン の 上 流 17.8 kbp に つ い て 、SF-1, FoxL2, Sox3 の DNA 認 識 配 列 を 検 索 し た 。 そ の 結 果 、SF -1 結 合 サ イ ト が 3 箇 所 、FoxL2 結 合 サ イ ト が 4 箇 所 、Sox3 結 合 サ イ ト が 4 箇 所 存 在 す る と 推 定 さ れ た 。

第 4 章 で は 、 得 ら れ た CYP19 プ ロ モ ー タ の 解 析 に つ い て 、 転 写 因 子 と の 相 互 作 用 を 中 心 に 述 べ て い る 。CYP19 ^{の 第} 2 エ ク ソ ン の 上 流-2730 bp を プ ロ モ ー タ コ ン ス ト ラ ク ト と し て 用 い 、SF-1, FoxL2, Sox3 の 各 転 写 因 子 の 転 写 促 進 効 果 に つ い て 検 討 し た 。 そ の 結 果 、SF-1 で は 転 写 促 進 が 殆 ど 見 ら れ な か っ た の に 対 し 、FoxL2 で 2.2 倍 、 Sox3 で 5.5 倍 の 促 進 が 見 ら れ た 。 そ こ で 特 に 促 進 効 果 の 強 か っ た Sox3 に 注 目 し 、 CYP19 プ ロ モ ー タ の 長 さ を 変 え 転 写 量 を 調 べ た 。そ の 結 果 、プ ロ モ ー タ の 長 さ を-187 bp ま で 削 除 し て も 転 写 量 が 変 わ ら な い こ と が 確 認 さ れ た 。CYP19 の 第 2 エ ク ソ ン の 上 流-187 bp ま で の 間 に は 、Sox3 結 合 サ イ ト が-53 bp の 位 置 に 1 箇 所 推 定 さ れ た 。そ こ で 、こ の 領 域 を 変 異 さ せ た プ ロ モ ー タ コ ン ス ト ラ ク ト を 作 製 し て 解 析 を し た と こ ろ 、 Sox3 に よ る 促 進 効 果 が 消 失 し た 。 さ ら に Sox3 に つ い て 、 そ の 内 部 に あ る DNA 結 合 領 域 の HMG-box を 欠 失 し た 変 異 タ ン パ ク 質 を 合 成 す る 発 現 ベ ク タ ー を 構 築 し 、 同 様 に CYP19 プ ロ モ ー タ と の 相 互 作 用 を 調 べ た と こ ろ 、 促 進 効 果 が 失 わ れ る こ と が 分 か っ た 。 以 上 の こ と か ら 、Sox3 は そ の HMG-box に よ っ て CYP19 プ ロ モ ー タ の-53 bp に 存 在 す る Sox3結 合 サ イ ト に 結 合 し 、CYP19 の 転 写 を 促 進 す る こ と が 示 さ れ た 。Sox3 遺 伝 子 は 性 染 色 体 上 に 存 在 す る こ と が 分 か っ て い た の で 、 そ の 塩 基 配 列 に つ い て 比 較 検 討 す る た め 、卵 核 性 二 倍 体 発 生 法 に よ り ZZ 胚・WW 胚 を 作 製 し 、性 染 色 体 上 の Sox3 遺 伝 子 に つ い て そ れ ぞ れ 解 析 を 行 な っ た 。そ の 結 果 、タ ン パ ク 質 コ ー ド 領 域 に お い て 、 8 箇 所 の 塩 基 配 列 の 違 い が 確 認 さ れ た が 、 そ の い ず れ に お い て も ア ミ ノ 酸 の 置 換 を 引 き 起 こ す も の で は な い こ と か ら 、 性 染 色 体 上 の そ れ ぞ れ の Sox3 遺 伝 子 か ら 発 現 す る

Ｎｏ.3

Sox3 タ ン パ ク 質 に は 機 能 的 な 差 が 無 い こ と が 推 測 さ れ た 。

第 5 章 で は 、CYP19 遺 伝 子 の 転 写 調 節 に お け る cAMP の 影 響 に つ い て 述 べ て い る 。 ヒ ト や マ ウ ス を 用 い た 研 究 か ら 、cAMP が CYP19 の 転 写 調 節 に 重 要 な 役 割 を し て い る こ と が 既 に 報 告 さ れ て い る 。 ツ チ ガ エ ル CYP19 プ ロ モ ー タ 上 に お い て も cAMP-response element (CRE)が 4 箇 所 推 定 さ れ て お り 、cAMP に よ る CYP19 の 転 写 調 節 が 推 測 さ れ た 。 そ こ で 、CYP19 プ ロ モ ー タ-2730 bp を 用 い て プ ロ モ ー タ ー 解 析 を 行 な っ た と こ ろ 、cAMP を 培 地 に 加 え る こ と で そ の 転 写 活 性 が 約 1.5 倍 に 上 昇 す る こ と が 明 ら か に な っ た 。生 殖 腺 に お け る cAMP シ グ ナ ル 経 路 の 上 流 に は 濾 胞 刺 激 ホ ル モ ン 受 容 体(FSHR)及 び 黄 体 形 成 ホ ル モ ン 受 容 体(LHR)の 存 在 が 予 想 さ れ る の で 、そ れ ら の cDNA 配 列 の 単 離 を 試 み た 。こ の 結 果 、FSHR ^{で は} 11 68 bp、LHR ^{で は} 79 4 bp の cDNA 部 分 配 列 が 得 ら れ 、そ れ ぞ れ 389 残 基 、264 残 基 の ア ミ ノ 酸 配 列 が 推 定 さ れ た 。 得 ら れ た 配 列 を も と に そ れ ぞ れ に 特 異 的 な プ ラ イ マ ー を 作 製 し て 発 生 過 程 の 生 殖 腺 に お け る 発 現 を リ ア ル タ イ ム RT-PCR 法 で 解 析 し た 。そ の 結 果 、LHR の 発 現 に 雌 雄 差 が 見 ら れ な か っ た が 、FSHR ^は CYP19, FoxL2, Sox3 と 同 様 、 生 殖 腺 が 形 態 的 に 分 化 す る 以 前 の st.25 か ら 雌 生 殖 腺 に お い て 強 い 発 現 が 見 ら れ た 。 こ の こ と か ら FSHR は cAMP 経 路 を 介 し て CYP19 遺 伝 子 の 転 写 を 調 節 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 第 6 章 で は 、 本 研 究 で 得 ら れ た 結 果 を も と に 、 卵 巣 分 化 過 程 に お け る CYP19 ^{遺 伝} 子 の 転 写 調 節 機 構 に つ い て 考 察 し て い る 。本 研 究 に お い て 、Sox3 は 生 殖 腺 の 形 態 分 化 に 先 立 っ て 、CYP19 と 同 様 に 雌 生 殖 腺 に お い て 強 く 発 現 す る こ と を 明 ら か に し た 。加 え て プ ロ モ ー タ 解 析 に お い て 、Sox3 は CYP19 遺 伝 子 の 転 写 を 促 進 す る こ と を 明 ら か に し た 。 こ れ ら の 結 果 か ら 、Sox3 ^は CYP19 遺 伝 子 の 発 現 を 調 節 す る こ と で 卵 巣 分 化 に 重 要 な 役 割 を 持 っ て い る 可 能 性 を 世 界 で 初 め て 示 し た 。 ま た 、 こ の 遺 伝 子 は Z 及 び W 性 染 色 体 上 に 存 在 し て い る の で 、Z 型 及 び W 型 Sox3 遺 伝 子 に つ い て 比 較 検 討 を 試 み た 。こ の 結 果 か ら 、性 染 色 体 上 の Sox3 遺 伝 子 か ら 発 現 す る Sox3 タ ン パ ク 質 に は 機 能 差 が 無 い こ と が 推 測 さ れ た 。 今 後 、 性 染 色 体 上 の Sox3 遺 伝 子 の プ ロ モ ー タ ー を そ れ ぞ れ 単 離 し 、 そ の 配 列 と プ ロ モ ー タ 活 性 に つ い て 検 討 し て い く 必 要 が あ る 。 こ の 他 に プ ロ モ ー タ ー 解 析 に お い て 、FoxL2 で 2.2 倍 、cAMP で 1.5 倍 の CYP19 ^{遺 伝 子 の 転} 写 促 進 効 果 を 確 認 し た 。 ま た 、 発 生 過 程 に お け る 発 現 解 析 で は FoxL2, FSHR と も CYP19 と 同 様 に 生 殖 腺 の 形 態 分 化 に 先 立 っ て 、雌 生 殖 腺 に 強 く 発 現 す る こ と が 示 さ れ た 。従 っ て 、Sox3 ^{だ け で な く} FoxL2, FSHR な ど の 因 子 も 関 わ っ て 、CYP19 ^{遺 伝 子 の} 転 写 が 調 節 さ れ て い る こ と が 推 測 さ れ た 。今 後 、FoxL2 及 び FSHR に つ い て も そ の プ ロ モ ー タ を 解 析 し 、 雌 生 殖 腺 に お い て 強 く 発 現 す る 機 構 に つ い て 調 べ て い く 必 要 が あ る 。

早稲田大学 早稲田大学 早稲田大学

早稲田大学 博士 博士 博士 博士（ （ （ （理 理 理学 理 学 学） 学 ） ） ） 学位申請 学位申請 学位申請 学位申請 研究業績書 研究業績書 研究業績書 研究業績書

氏 名 大島 裕希 印

（２００７年１１月２８日 現在）

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

論文

○

○

○

(1)Expression of Lhx9 isoforms in the developing gonads of Rana rugosa. Zoolog. Sci. 2007;Aug;24(8);798-802

Oshima Y Oshima Y Oshima Y

Oshima Y, Noguchi K, and Nakamura M.

(2)Expression of DMRT genes in the gonads of Rana rugosa during sex determination.

Zoolog. Sci. 2007;Jan;24(1):95-9.

Matsushita Y, Oshima YOshima YOshima Y, Nakamura M. Oshima Y

(3)Promoter activity and chromosomal location of Rana rugosa P450 aromatase (CYP19) gene.

Zoolog. Sci. 2006;Jan;23(1):79-85.

Oshima Y Oshima Y Oshima Y

Oshima Y, Kato T, Wang DS, Murakami T, Matsuda Y, Nagahama Y, and Nakamura M.

(4)Molecular cloning and expression in gonad of Rana rugosa WT1 and Fgf9. Zoolog. Sci. 2005;Sep;22(9):1045-50.

Yamamura Y, Aoyama S, Oshima YOshima YOshima Y, Kato T, Osawa N, Nakamura M. Oshima Y

(5)Molecular cloning of Dmrt1 and its expression in the gonad of Xenopus. Zoolog. Sci. 2005;Jun;22(6):681-7.

Osawa N, Oshima YOshima YOshima Y, Nakamura M. Oshima Y

(6)Wnt4 expression in the differentiating gonad of the frog Rana rugosa. Zoolog. Sci. 2005;Jun;22(6):689-93.

Oshima Y Oshima Y Oshima Y

Oshima Y, Hayashi T, Tokunaga S, Nakamura M.

講演

(1)無尾両生類における FSHR 遺伝子の単離と発現解析 第 56 回日本動物学会関東支部会(東京) 2004 年 3 月 大島裕希, 中村正久

(2)アフリカツメガエルにおける FSHR 遺伝子及び LHR 遺伝子の単離と発現解析 第 75 回日本動物学会(神戸) 2004 年 9 月

大島裕希, 中村正久

(3)Promoter activity and chromosomal location of the P450 aromatase (CYP19) gene in the frog Rana rugosa.

FOURTH INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON THE BIOLOGY OF VERTEBRATE SEX DETERMINATION April 10-14, 2006, Kona, Hawaii, USA

Y. Oshima, T. Katou, D. Wang, T. Murakami, Y. Matsuda, Y. Nagahama, and M. Nakamura