博 士 （ 獣 医 学 ） フ ァ ン ノ ヽ ン ミ ン
学 位 論 文 題 名
Genetic analyslSanddeVelopmentof
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（ ニ ュ ー カ ッ ス ル 病 ウ イ ル ス の遺 伝子 解析 と新 規診 断法 の開 発）
学位論文内容の要旨
ニ ュ ー カ ッ ス ル病(ND)は ト リ パ ラ ミ ク ソ ウ イ ル ス1型 で あ る ニ ュ ー カ ッ ス ル 病 ウ イ ル ス(NDV)に よ っ て 引 き 起 こ さ れ る 伝 播カ の 強 い 鶏 の 感 染 症 で あ る 。 近 年 で も 世 界 各 地 でNDの 発 生 が 数 多 く 報 告 さ れ て お り 、NDVの 迅 速 診 断 法 の 開 発 及 ぴ分 子疫学 調査 は、 将来 的に 起こ るNDの発 生を 制御 する 上で も重要 である。以 上 の 理 由 よ り 、 本 研 究で は日 本で 分離 され た種 々のNDV株 の系 統樹 解析 を行 い、
さらに3種類の新規分子診断法の開発を行った。
NDVのnucleocapsid蛋 白(NP)遺 伝 子 全 長 を 用い た 系 統 樹 解 析 の 結 果 、 日 本 で 分 離 さ れ たNDV篠(1970年 代 以 前 の 古 い 株 及 ぴ1980年 代 以 降 の 新 し い 株 ） は 、 大 きく2つの グル ープ 、即 ち病 原性 の株で 構成されるグループと非病原性のグルー プ 、 に 分 類 さ れ た。 ま た 制 限 酵 素 を 用 い た 解 析 の 結 果 、 病 原 性NDVのNP遺 伝 子 よ り 増 幅 さ れ たPCR産 物 は 、PstIに よ り 消 化 さ れ な い が 、 非 病 原 性NDV由 来 の PCR産物 は 消 化 さ れ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 こ の よう なPstlを 用い たRT‑PCR‑
制 限 酵 素 断 片 長 解析(RFLP)は 、NDV株 の 病 原 型推 定 の た め の 一 次 ス ク リ ー ニ ン グ法として使用できることが示された。
次に簡便な遺伝子増幅法である、Loop‑mediatedisothermalamplification (LAMP) 法 のND診 断 へ の 応 用 を 検 討 し た 。NDVのfusion蛋 白(F)遺 伝 子 を 標 的 と し て 設 計 し た プ ラ イ マ ー 群 を 用 い たLAMP法 に よ り 、 通 常 の 恒温 水槽 ある いは ヒー トブ ロ ッ ク を 使 用 す る だ け で 、2時 間 以 内 に 臨 床 材 料 よ りNDVを特 異的 に検 出す るこ と が で き た 。 さ ら に こ のLAMP法 はnested PCR法 と 同 程度 の感 度・ 特異 性を 示し た 。 以 上 の 結 果 より 、 こ のLAMP法 が 迅 速 ・ 簡 便 で 高 感 度 、 経 済 的 なNDV同 定 法 であることが示された。
高 感 度 で 特 異 的 なNDVの 病 原 型 推 定 法 と し て 、F遺 伝 子 を 標 的 と し たSYBR GreenIを 用 い た り ア ルタ イムRT‑PCR法 とmelting‑curve解 析法 を開 発し た。 この 方 法 で は 、PCR産 物 の 電 気 泳 動 に よ る 解 析 ス テッ プ を 必 要 と せ ず 、 感 度 は 通 常 RT．PCRの100倍 であ り 、 感 染 鶏 由 来 組 織 材 料 よ り 直 接NDVを 検 出 で き た 、 即 ち 強毒株（verogenic）では89．23士0．27℃で、中等毒株では90．17士O．35℃で弱毒株 ilent0畢enic）では91．25士O．14°Cであった。NDVの病原型は、PCR産物の解離温 度 よ り 稚 定 す る こ と がで き、NDVの病 原型 のスク リー ニン グ法 とし て優 れて いる と考えられた。
NDV遺 伝 子 増 幅 法 は 、 通常 の培 養に よる ウイル ス分 離法 の代 替法 とは なら ない が 、 そ れ ぞ れ 異 な っ たNDV遺 伝子 を標 的と した分 子診 断法 を複 数併 用す るこ とで よ り優 れた診 断法 とな る。 本研 究で 示し た3種類の分子診断法は、いずれも迅速・
高 感 度 で 安 全 性 も 高 く経 済的 なNDV株 の検 出・同 定法 であ り、 また それ ぞれ 検査 室 の設 備に応 じて使用可能であると同時に、将来において優れたルーチン検査法と なる可能性も持っている。
学 位論文審査の要旨 主査
副査 副査 副査
教授 教授 助教授 助教授
小 沼 操 喜 田 宏 大 橋 和 彦 迫 田 義 博
学位論文題名
Genetic analyslSanddeVe10pmentof
neWdiagnOStiCaSSaySOfNeWCaStlediSeaSeViruS
（ニューカッスル病ウイルスの遺伝子解析と新規診断法の開発）
ニューカッス/1/病(ND)はトリパラミクソウイノレス1型のニューカッスノレ 病ウイルス(NDV)によって引き起こされる伝播カの強い鶏の感染症である。
近年でも世界各地でNDの発生が数多く報告されており、NDの迅速診断法の開 発及び分子疫学調査は、将来的に起こるNDの発生を予防する上でも重要であ る。本研究では日本で分離された種々のNDV株の系統樹解析を行い、さらに3 種類の新規分子診断法の開発を行った。
NDVのnucleocapsid蛋白(NP)遺伝子全長を用いた系統樹解析の結果、日 本で分離されたNDV株（1970年代以前の古い株及び1980年代以降の新しい株）
は、大きく2つのグループ、即ち病原性の株で構成されるグループと非病原 性のグループ、に分類された。また制限酵素を用いた解析の結果、病原性NDV のNP遺伝子より増幅されたPCR産物は、PstIにより消化されないが、非病原 性NDV由来のPCR産物は消化されることが明らかとなった。このようなぬtI を用いたRTーPCR一制限酵素断片長解析(RFLP)は、NDV株の病原型推定のため の 一 次 ス ク リ ー ニ ン グ 法 と し て 使 用 で き る こ と が 示 さ れ た 。 次に簡便な遺伝子増幅法である、Loop―mediatedlsothermal amplification (LAMP)法 のND診 断へ の 応 用 を 検 討した 。NDVのfusion蛋 白(F)遺 伝子 を 標的として設計したプライマー群を用いたLAMP法により、通常の恒温水槽あ るいはヒートブロックを使用するだけで、2時間以内に臨床材料よりNDVを特 異的に検出することができた。さらにこのLAMP法はnested PCR法と同程度 の感度・特異性を示した。以上の結果より、このLAMP法が迅速・簡便で高感 度、経済的なNDV同定法であることが示された。
高感度で特異的なNDVの病原型推定法として、F遺伝子を標的としたSYBR GreenIを用いたりアルタイムRTーPCR法とmelting―curve解析法を開発した。
この方法では、PCR産物の電気泳動による解析ステップを必要とせず、感度は 通常RT−PCRの100倍であり、感染鶏由来組織材料より直接NDVを検出できた。
この方法によりNDVの病原型は、PCR産物の解離温度より推定することができ、
NDVの 病 原 型 の ス ク リ ー ニ ン グ 法 と し て 優 れ て い る と 考 え ら れ た 。 これら3種類の分子診断法は、いずれも迅速・高感度なNDVの検出・同定 ‑ 1427−
法であり、優れた検査法であることが明らかとなった。よって、審査委員一 同は、ファン・ハン・ミン君の博士論文は、北海道大学大学院獣医学研究科 規程第6条の規定による本研究科の行う博士論文の審査等に合格と認めた。
