学位論文内容の要旨

     博 士 （ 獣 医 学 ） 安 井 博 宣 学 位 論 文 題 名

移植固形腫瘍における新規制がん剤エチニルシチジンに よる放射線誘発増殖抑制作用の増強効果に関する研究

学位論文内容の要旨

固 形 腫 瘍 に 対し て現在 まで の放 射線治 療が 十分 な治 療効果 を得 るこ との で き な い 原 因 と して 、多く の腫 瘍細 胞はが ん抑 制遺 伝子

の 変異 を持 っこ と や 固形 腫瘍 内に放 射線 抵抗 性低酸素細胞が存在する事が挙げられる。従って、

そ れら 抵抗 因子を 制御 する 様々な薬剤との併用療法が重要となってきている。

本 研 究 で 用 い た制 がん剤 エチ ニル シチジ ン(ECyd) は既 存の薬 剤と は異 なり 、 標 的 細 胞 のRNA 合 成 を 阻 害 す る 新 規 制 がん 剤 で あ る 。 本 研 究 の 目 的は 、

損 傷 を 作 用 機 序と する放 射線 とこ の新規 の制 がん 剤ECyd を組 み合 わせ た方 法 を 用い てin vitro およ び挧

における抗腫瘍効果を検討することを目的とし た。

様々 なTp53 status を有 するマウス由来およびヒト由来の固形腫瘍に対し、3 時 間 前 の

投与 によっ て、

のX 線照 射で 起こ る腫 瘍成長 抑制 は強 く増 強 さ れた 。ま た組織 学的 検討 から、この腫瘍成長抑制の増強効果にアポトーシス の 増強 と細 胞増殖 の抑 制が 関わっていることが明らかとなった。さらに、ECyd は アポ トー シス誘 導を 阻害 し、かつ細胞分裂を調節するsurvivin の発現を抑制 し て い た 。 次 に、 低酸素 細胞 に対 するECyd の 放射 線誘 発細胞 死へ の増 強効 果 をin vitro 実験系およびin vivo 実験系の両面から検討した。まず低酸素培養した ヒ ト胃 がん 細胞に 対し てECyd 処 理とX 線 照射の 併用 によ って、大気条件と同様 に

非 依 存 性に アポト ーシ ス誘 導の増 強が 観察 され た。ま た低 酸素 細胞 に お い て 、

処理 による 低酸 素誘 導性転 写因 子HIF‑la の発現 抑制 が明 らか と な った 。特 異的ア ンチ セン スオリゴヌクレオチドによる発現抑制系を用いた実 験 で、

発現 が抑 制さ れた 細胞に 対す るX 線照 射で アポトーシス誘導が増 強 され た。 この事 は、

によ る低酸 素細 胞に 対する

線誘導アポトーシスの 増 強効 果に おいて

が 重要な作用標的であること示唆するものであった。

またin vivo 実験系では、併用処置した腫瘍内の低酸素細胞にin vitro の結果と同 様 アポ トー シスが 誘導 され てお り、処 置12 日後 の低酸 素領 域は無処置群やX 線 単独照射群に比べ有意に縮小していた。

以上 の結 果から 、新 規制 がん剤ECyd がsurvivin の発現を抑制することで腫瘍

細胞に放射線誘発アポトーシスを増強し、細胞増殖についても阻害作用を示し た。また低酸素細胞に対しても、survivin 発現抑制に加えてHIF‑la の発現抑制 も関与して細胞死を誘導したものと結諭づけられる。その細胞死の結果、がん 細胞のTp53 status に関わりなく移植腫瘍の著しい成長抑制を引き起こしたも のと考えられる。

本研究で得られた知見は、固形腫瘍に対して新規制がん剤である

が放

射線による抗腫瘍効果を効率的に高め、低酸素細胞にも細胞死を誘導できる点

で有望な放射線増感剤となりうる可能性を示したものであり、その意味は非常

に大きいと考えられる。

学 位 論 文 審 査 の 要 旨 主査   教授   稲波   修 副査   教授   伊藤茂男

副査   教授   桑原幹典（横浜薬科大学）

副査   准教授   浅沼武敏

学 位 論 文 題 名

移 植 固 形 腫 瘍 に お け る 新 規 制 が ん 剤 エ チ ニ ルシ チ ジ ン に よ る 放 射 線 誘 発 増 殖 抑 制 作 用の 増 強 効 果に 関 す る 研究

  固 形 腫瘍 に 対 して 放 射 線 治療 の 治 療効 果 を 妨げ る1つの 要 因 とし て 固形 腫瘍内 に 放射 線 抵 抗性 低 酸 素細 胞 が 存 在す る 事 が挙 げら れる。従 って、 低酸素で 誘導さ れる 放射 線 抵 抗性 因 子 を制 御 す る 様カ な 薬 剤と の併 用療法の 開発が 現在強く 望まれ てい る。 エ チ ニル シ チ ジン(ECyd)は 従来 の 薬 剤と は 異 なり 、 標 的と し てRNA合成系 を阻 害す る 新 規制 が ん 剤と し て 近 年、 開 発 され た新 規制がん 剤であ る。申請 者は放 射線 照射 と こ のECyd投 与 を 組 み合 わ せ た方 法 を 用いて培 養細胞 系および 移植腫 瘍系にお け る 抗 腫 瘍 効 果 、 特 に 低 酸 素 細 胞 へ の 効 果 を 中 心 に 検 討 し た 。   マ ウ ス 由 来 大 腸 が んColon26細 胞 お よ び ヒ ト 胃 腺 が ん 由 来MKN45細 胞 （ 野 生 型 Tp53)とMKN28細胞 （変異 型Tp53)に おいて 、照射3時間前 にECydの腹 腔内投与すると、

1〜2 GyのX線 照 射に よ っ て誘 導 さ れる 腫 瘍 成長 抑 制 効 果を 強 く 増強 す る こと が 示 され た 。 また 組 織 化学 的 手 法 を用 い た 解析 によ って、こ の腫瘍 成長抑制 の増強 効果 にアポト ーシス 増強と細 胞増殖 抑制が関 わって いること が明らか となっ た。さらに、

ECydはアポ トーシス 誘導を 阻害する タンパク 質であ るsurvivin、増 殖を調節するりン 酸 化ERKな ら び に り ン酸 化AKTの 発 現を 有 意 に抑 制 す る こと も 明 らか と な った 。 次 に、申請 者は低 酸素細胞 に対す るECydの放射 線誘発 細胞死へ の増強 効果を検討した。

低酸 素 培 養し た ヒ ト胃 が ん 細 胞に 対 し てECyd処 理 とX線 照 射 の併 用 処 置を 行うこと で、 大 気 条件 と 同 様にTp53非 依 存 性ア ポ ト ーシス誘 導の増 強が観察 された 。また本 研究 に お いて 、ECyd処 理 は低 酸 素 誘導 性 転 写因子HIF‑laの発現抑 制をお こすこと が 明ら か に され た 。HIF‑laが ア ポ トー シ ス 誘導 に対して 抑制的 に働くこ ともア ンチセ ンス オ リ ゴヌ ク レ オチ ド を 用 いた 実 験 から 明ら かにされ た。以 上の事は 、ECydによ る低 酸 素 細胞 に 対す るX線誘導ア ポトー シスの増 強効果に おいて 、HIF‑laが重 要な作 用標 的 で ある こ と を示 し て い る。 ま たMKN45細 胞 の マウ ス 移 植腫 瘍 を 用い た実験で 併用 処 置 した 腫 瘍 内の 低 酸 素 細胞 に ア ポト ーシ スが誘導 されて おり、低 酸素領 域は 無処 置 群 やX線 単 独照射 群と比べ 有意に 縮小して いた。ま た、ECydは 腫瘍内 のHIF‑la 発現 領 域 の縮 小 を 起こ す こ と も示 さ れ た。 以上 の結果か ら、新 規制がん 剤ECydは移 植腫 瘍 の 低酸 素 細 胞に つ い て も培 養 系 と同 様にHIF‑laの発現 抑制を介 したTp53非 依 存的 放 射 線誘 発 ア ポト ー シ ス 増強 と 細 胞増 殖阻 害作用を 引き起 こすと結 論づけ られ た。

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  本研究で得られた知見は、固形腫瘍に対して新規制がん剤であるECydが放射線に よる抗腫瘍効果を効率的に高め、低酸素細胞にも細胞死を誘導できる点で有望な放 射線増感剤となりうる可能性を示したものであり、その意味は非常に大きいと考え られた。よって審査員一同は、上記博士論文提出者安井博宣の博士論文は、北海道 大学大学院獣医学研究科規定第6条の規定による本研究科の行う博士論文の審査等 に合格と認めた。

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