IRUCAA@TDC : Expression and localization of aqua-glyceroporins AQP３ and AQP９ in rat oral mucosa.

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Posted at the Institutional Resources for Unique Collection and Academic Archives at Tokyo Dental College, Available from http://ir.tdc.ac.jp/

Title

Expression and localization of aqua-glyceroporins

AQP３ and AQP９ in rat oral mucosa.

Author(s)

Poveda, Marlene

Journal

歯科学報, 114(6): 616-617

URL

http://hdl.handle.net/10130/3520

Right

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論文内容の要旨１．研究目的アクアポリン（AQP）は６個の疎水性の膜貫通α ヘリックスで構成された小さな複合蛋白のファミリーで，水に対する高い選択性を持つ小孔を，細胞の内側と外側とをつなぐ膜貫通ドメインが取り巻いている。このファミリーには，水だけではなく水よりも分子径の大きいグリセロールなどの分子を通過させるアクアグリセロポリンがあり，AQP３，AQP７，AQP９はこのグループに属している。また，口腔上皮は口蓋や舌，頬粘膜などの角化あるいは錯角化重層扁平上皮と，口腔底などの非角化重層扁平上皮によって被覆されており，これらの重層扁平上皮においては，上皮表層あるいは顆粒層上部で，狭小となった細胞間隙に MCG（membrane coating granules）が放出され，その中に含まれているセラミドなどの脂質により細胞間隙が閉鎖されて生理学的透過性関門が構成されていると考えられている。本研究では，口腔重層扁平上皮における水の透過性調節にアクアグリセロポリンが関与するかどうかを明らかにするために，AQP３，AQP７，AQP９の発現とその局在を，RT-PCR 法，Western Blot 法，免疫蛍光法，金コロイド凍結免疫電顕法により検索した。２．研究方法実験動物は体重約２００g の SD 系雄ラット６０匹を用い，チオペンタールによる腹腔内麻酔下に，口蓋，頬，舌，口腔底の粘膜組織を摘出し，DispaseⅠ酵素にて処理後，粘膜上皮を剥離して，RT-PCR 法および Western Blot 法にて AQP３，AQP７，AQP９の発現を解析した。免疫染色のためには，粘膜組織を摘出後，ただちに 液体窒素にて急速凍結を行い，６μm の凍結切片を作成し，AQP３，AQP７，AQP９に対するウサギポリク ローナル抗体を用いて免疫蛍光染色をおこない蛍光顕微鏡にて観察した。免疫電顕法のためには，４％パラフォルムアルデヒドおよび０．２％グルータルにて灌流固定の後，液体窒素にて急速凍結して凍結超薄切片を作成し，一次抗体を反応させた後，１０nm の金コロイドにて標識し，透過型電子顕微鏡にて観察した。３．研究成績および結論

RT-PCR 法および Western Blot 法により，口蓋，頬，舌，口腔底の口腔粘膜上皮には，AQP３および AQP９の遺伝子および蛋白の発現が認められたが，AQP７についてはどちらも明らかなバンドは認められなかった。免疫蛍光染色において，AQP３の蛍光標識は基底細胞の細胞質に強く認められ，有棘層から顆粒層あるいは表層への分化にともなって，細胞膜に限局するようになり，最表層の角質層では，反応が消失していた。氏名（本籍）ポヴェダマルレネ

Poveda

Marlene

（ベネズエラ）学位の種類博士（歯学）学位記番号第１７４５号（甲第１０２０号）学位授与の日付平成２０年３月３１日学位授与の要件学位規則第４条第１項該当

学位論文題目 Expression and localization of aqua-glyceroporins AQP３ and AQP９ in rat oral mucosa.

掲載雑誌名 The Bulletin of Tokyo Dental College 第５５巻１号１−１０頁

２０１４年２月論文審査委員（主査）櫻井薫教授（副査）山根源之教授井上孝教授川口充教授下野正基教授歯科学報 Vol．１１４，No．６（２０１４）６１６ ― ８４ ―

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一方，AQP９の蛍光標識は AQP３のものと比較して基底細胞および傍基底細胞の細胞質辺縁により強く認められた。免疫電顕像では，AQP３の局在を示す金コロイド粒子は，基底層から有棘層では細胞膜下の細胞質に存在し，顆粒層上部や中間層上部では，細胞間隙に面する細胞膜上に局在していた。一方，AQP９の金コロイド粒子は，基底細胞や有棘層では細胞膜下の細胞質や細胞膜に多くみられた。これらの結果から，水やグリセロールを通過させるアクアグリセロポリンの AQP３および AQP９がラット口腔粘膜上皮の基底細胞から顆粒層上部あるいは中間層上部に存在することが明らかとなった。そして，これらが上皮細胞間および細胞内を通過する浸透圧性の水の輸送・調節に重要な役割を果たしていることが示唆された。さらに，口腔粘膜上皮の顆粒層上部や中間層上部におけるセラミドやグリコシルセラミド等を含む MCG の放出による生理学的透過性関門の構築には AQP３が関与すると考えられた。また，基底細胞からのグリセロールの取り込みには AQP ９が何らかの機能を果たしている可能性が示唆された。論文審査の要旨本研究は，口腔重層扁平上皮における水の透過性調節にアクアグリセロポリンが関与するかどうかを明らかにするために，AQP３，AQP７，AQP９の発現とその局在を，RT-PCR 法，Western Blot 免疫蛍光法および金コロイド凍結免疫電顕法を用いて検索したものである。SD 系雄ラット６０匹を用い，口蓋，頬，舌，口腔底の粘膜組織を摘出し，RT-PCR 法および Western Blot 法にて，AQP３，AQP７，AQP９の発現を解析するとともに，凍結切片を用いた免疫蛍光染色による検討と，凍結超薄切片を用いた金コロイド標識免疫電顕法によりこれらの免疫局在を検討した。本研究の結果に示すように，RT-PCR 法および Western Blot 法では，口蓋，頬，舌，口腔底の口腔粘膜上皮では，AQP３および AQP９の遺伝子および蛋白の発現が認められたが，AQP７については明らかな反応は認められなかった。また，免疫蛍光染色において，AQP３は基底細胞では細胞質にみられ，有棘層から顆粒層あるいは表層では細胞膜に限局し，最表層の角質層では消失していた。AQP９は基底細胞および傍基底細胞の細胞質辺縁に強く認められた。免疫電顕像では，AQP３は基底層や有棘層の細胞膜下の細胞質に存在し，顆粒層上部や中間層上部では細胞間隙に面する細胞膜上に局在しており，AQP９は，基底細胞の細胞膜にも多く認められた。このことから，水やグリセロールを通過させる AQP３や AQP９が，上皮細胞間および細胞内を通過する浸透圧性の水の輸送・調節に重要な役割を果たしている可能性があると考えられた。さらに，口腔粘膜上皮の顆粒層上部や中間層上部の細胞間隙への，セニミドやグリコシルセラミド等を含む MCG （membrane coating granules）の放出による生理学的透過性関門の構築に AQP３が関与すると共に，基底細

胞からのグリセロールの取り組みには AQP９が何らかの機能を果たしている可能性が示唆された。本審査委員会では，１）粘膜組織採取の術式について，２）上皮の角化様式と AQP３／AQP９の発現の違いについて，３）上皮の厚さと部位による AQP３／AQP９の発現の違いについて，４）AQP３／AQP９と MCG との関連について，５）AQP３／AQP９の欠損と口腔粘膜疾患との関連について，６）グリセロールの膜透過機序について，７）AQP の細胞内輸送経路と機能発現などについての討議および質疑がなされ，概ね妥当な回答が得られた。また，文章および写真の表現などについても適切な指摘があり，修正がなされた。本研究の知見は，歯科医学の進歩発展に寄与するところ大であり，学位授与に値するものと判定された。歯科学報 Vol．１１４，No．６（２０１４）６１７ ― ８５ ―