ポリエチレンチューブによる心筋細胞活動電位の記 録

ポリエチレンチューブによる心筋細胞活動電位の記 録

著者 少作 隆子 , 野間 昭典

著者別表示 Shosaku Takako, Noma Akinori

雑誌名 日本生理学雜誌

巻 63

号 4

ページ 87‑91

発行年 2001‑04‑01

URL http://doi.org/10.24517/00064871

Creative Commons : 表示 ‑ 非営利 ‑ 改変禁止 http://creativecommons.org/licenses/by‑nc‑nd/3.0/deed.ja

ポリエチレンチューブによる心筋細胞活動電位の記録

二二隆子1）　野間昭典2）

1）金沢大学医学部第二生理　2）京都大学医学部第二生理

as　1．はじめに

　学生に活動電位というものを理解させる近道 は，活動電位を実際に見せることである．しかし，

活動電位の細胞内記録には，高価な装置が必要で あったり，あるいは，熟練した技術が必要であっ たりし，学生実習に不向きな場合が多い．ここで は，複雑な実験セットや熟練した技術などを必要 とせず，簡単に活動電位が記録できる実習を紹介

する．

　比較的口径の大きな吸引電極による活動電位の 記録は心臓から活動電位波形を記録するために古 くから行われてきた方法であり，その方法が簡単 であるため，学生実習にも応用することができる．

既にこの実習は，長年九画面学生理学教室におい て行われてきたものである．また，その後他のい ろいろな大学で取り入れられ，大学毎に独自の変 更がなされてきている．以下には，昨年金沢大学 の生理学実習で行われたバージョンを紹介する．

図3～9は，学生の実習レポートのトレースをコ ピーしたものである．あまり鮮明ではないが，ご 容赦願いたい．

隔　2．方法

く材料〉

　食用蛙の心臓を使用する．以下の手順で心臓の 摘出標本を作成する．

　1）脊柱を切断し，針金で脳および脊髄を破壊 　　する．

　2）背位に置き開胸し，心嚢を切開し，心臓を 　　露出させる．心室を吻側に持ち上げ，心室 　　を固定している腱を切断すると，その下に 　　下大静脈と心房の間に膨らみがあり，この

　　部分が最も速く収縮を開始しているのが観 　　察される．洞結節と呼ばれているカエル心 　　臓のペースメーカーである．

　3）大動脈1本と下大静脈を残し，あとの血管 　　はすべて結紮し，末梢側で血管を切断する．

　4）下大静脈の下に糸を通し，リンゲル液を満 　　たした灌流用チューブ先端の注射針を下大 　　静脈に挿入し，糸で血管の上から結紮し，

　　末梢側で血管を切断する．

　5）大動脈の残りの1本を心臓から少し離れた 　　位置で切断し，下大静脈より流したりンゲ 　　ル液が容易に排出されることを確認する．

　6）心臓を取り出し，底にシルガードを敷いた 　　シャーレに移し，ピンで固定する（図1）．

　7）心臓が規則的に収縮するように，灌流の流 　　量を調節する．

　体表面心電図の記録と活動電位を比較する場合 は，1～5の手順の後，心臓を取り出すことなく そのまま吸引電極による活動電位を記録する．心 電図の記録のためには，注射針をカエルの適当な 部位に刺し，これから電位を記録する．注射針は 3本用意し，それぞれ接地用，＋入力，一入力と

する．

〈生理的塩溶液組成〉

　・正常リンガー液…112NaCl，1．8　KCI，1．1 　　CaC12，2．4　NaHCO3（単位はmM）

　・高カリウム液・・KCI濃度を25～50　mMに上 　　げ，その分NaClを減らす．

　・無ナトリウム液…NaをTrisで置換する．

　　（コリンはムスカリン刺激を起こす．）

　・無カルシウム液…CaC12を除去する．

　・高マグネシウム液…20mM　MgC12を加え，

　　その分NaClを減らす．

シリーズ生理学実習法㊦　87

銀線N

　　　電位差を測定 　　　’　　　’

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　　一一一　一t　一一一一一一一一 接漕剤で隙聞を埋める

シリコンチューブ

ノ

チューブ・三方活 栓・注射器を接続 し、陰圧をかける

ディスポーザブル注射筒

N

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A　　　　　　ピン

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i難iliiil懇iiliii§擁…灘iiil

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1 ・　　■　　　’， ＼　　喝1 シルガード

　　　1　　’　、摘出心臓　　　　　　注射針　シャーレ 　、

Vリコンチューブ 図1，心臓摘出標本の門流とポリエチレンチューブ電極の模式図

　・テトロドトキシン液…1～5μMtetrodotox－

　　inを加える．

〈電極〉

　先端を熱処理により細くしたポリエチレンチュ ーブを使用する．心臓の拍動により電極がはずれ ることがないようにシャンクの長さを十分にと り，先端の直径は0．5～1mmになるようにする．

電極内にはリンゲル液を満たし，また，電極内を 陰圧にできるように注射筒を接続する（図1）．

〈測定〉

　ポリエチレンチューブ電極の先端を心臓に当て 細胞外記録を行うと，心電図様の波形が記録され る（図4上）．また，電極先端を心臓に押し付け た後，チューブ内に強い陰圧をかけると，吸引さ れた筋細胞が一部機械的に破壊され，しかも電気 遮蔽抵抗が増大するので，細胞内記録に近い状態 となり，振幅50mV程の活動電位が記録できる

（図4下）．これは損傷電位（lnj　ury　Potential）記 録と考えることができる．

臨　3e機器

　機器として最低限必要なものは，2チャンネル のオシロスコープとXYプロッタ（XYレコーダ，

チャートレコーダなどでもよい）である．測定系 の抵抗は十分に低いため，細胞内記録を行う際に 通常用いる高入力抵抗の増幅器を用いる必要はな い（図2）．刺激装置は不応期を調べる実験のみ で使用するので，無くても差し支えない．

88　⑳日生誌　Vol．63，　No，4　2001

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一＼詣

tufizz2　／ ^{X．yプロッタ}

図2．装置の接続

隔4．実習の進め方

　以下の順序で波形を記録する．

1）細胞外記録から細胞内記録になる過程を観察 　電極先端を心室に押しあて，活動電位の細胞外 記録を行う．次に，電極内圧を陰圧にすると，図 3のように電位が下がり，振幅数10mVの活動電 位波形が記録できる．図3はデジタルオシロスコ ープのロール・モードを使用し，細胞外記録から 細胞内記録への移行期の波形をセーブし，プロッ ターで紙に記録したものである．これにより，学 生は，細胞内電位が負であることを理解する．

2）細胞外と細胞内の同時記録

　心室の細胞内記録を続けながら，もう1本の電 極を心室に当て細胞外記録を行う．図4は，2チ ャンネルのオシロスコープを用いて2つの波形を 画面に表示し，紙に記録したものである．これに より，学生は，細胞外記録で見られる2つの波

（心電図のQRSとT波に相当）が，活動電位の開 始と終了にそれぞれ対応していることを確かめる

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心窒

（細胞外→綱三内》

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2sec 図3．細胞内記録になる過程

図5．不応期を調べる 刺激

心画面胞内

」ユ・mV

1　sec

図4．細胞内外同時記録

細胞外《心幽）

細胞内（二丁）

J　io　mv

O，5　sec

図6．高カリウム液の効果

心病細胞内

J　io　mv

5　sec

ことができる．心室のどの部分から記録しても活 動電位の立ち上がりは必ずQRS波形と重なる．

3）不応期を調べる

　心室筋の細胞内記録を行いながら，刺激電極を 用いて心室を電気刺激する．活動電位発生周期の さまざまな時期に刺激を加え，活動電位の誘発で きる時期，誘発できない時期を調べる．刺激を加 えた時点がわかるように，刺激装置からのモニタ ー波形をオシロスコープに表示させ（図5の上の 波形），活動電位波形と共に紙に記録する．図5 の例では，1番目の刺激では活動電位は誘発され ず，2番目の刺激で誘発されている．これにより，

学生は，活動電位の不応期の存在およびその時期 を知ることができる．

4）高カリウム液の効果

　心室筋の細胞内記録を行いながら乱流液を高カ リウム液に置換すると，静止膜電位が徐々に浅く なり，ついには活動電位が消失し，拍動が止まる．

オシロスコープの時間軸を5sec／div程度に設定

すると，変化の全貌を1画面に収めることができ，

静止膜電位が脱分極する様子がよくわかる（図 6）．この実験により，学生は，静止膜電位がカリ

ウムイオンの濃度勾配に強く依存していること，

および，持続的脱分極により活動電位の発生が抑 制されることを理解する．正常リンガー液を再び 灌流すれば，活動は回復する．しかし，拍動が止 まると液交換ができなくなるため，手で心臓をも みながら灌流を助ける必要がある．

5）テトロドトキシンの効果

　再び心室筋の細胞内記録を行い，灌流液をテト ロドトキシンを含む液に置換すると，活動電位が 消失し，拍動が止まる（図7）．この場合は高カ リウム液で見られたような脱分極は生じない．こ れにより，学生は，活動電位の発生に電位依存性 ナトリウムチャネルが必要であることを理解す る．波形を記録後，心臓マッサージにより回復さ せる．テトロドトキシンの代わりに，無ナトリウ ム液を使うこともできる．この場合，いわゆる無 シリーズ生理学実習法嚇　89

心1細施内

Jiomv

6　sec

図7．テトロドトキシンの効果

心室細胞内

J　io　mv

5sec 図8．高マグネシウム液の効果

心9（細胞内）

心湯（細胞内）

J　io　mv

O．5　sec

図9．心房と心室の同時記録

ナトリウム拘縮を観察することもできるし，心室 細動を観察することも可能である．

6）高マグネシウム液の効果

　再び心室筋の細胞内記録を行い，灌流液を高マ グネシウム液に置換すると，テトロドトキシンの 場合と同様に，活動電位が消失し拍動が止まる

（図8）．これにより，学生は，心筋活動電位発生 90　鑛日生誌　Vo1．63、　No．4　2001

におけるカルシウムチャネルの重要性を理解す る．波形を記録後，心臓マッサージにより回復さ せる．また，無カルシウム液を与えると，活動電 位は持続するが，収縮が微弱になるのを観察する ことができる．活動電位プラトー相が抑制される ことから，プラトー相へのCa電流の関与を示唆 することができる．カルシウムを加えれば逆の反 応を見ることができる．

7）心房と心室からの同時記録

　2本の電極を用い，心房と心室から同時に細胞 内記録を行い波形を記録する（図9）．これによ

り，学生は，心房の活動電位と心室の活動電位が 交互に発生し，それに伴い収縮も交互に起こって いることを確かめることができる．

隔5．注意すべき点

　本実習においては以下の点について注意する．

　1）電極で心房をつついていると，拍動が起こ 　　らなくなる場合があるため，心房の細胞内 　　記録は実習の最後に行うことが望ましい．

　2）心停止から心臓マッサージまでの期間は，

　　液の灌流圧を低くする．さもないと，心臓 　　が過伸展される．この場合，筋長と発生張 　　力の関係から予測されるように，心筋の収 　　縮力は著しく減弱し，灌流液の循環が遷延 　　する．灌流圧を少し下げ，拍動が続く程度 　　にすると良い．

　3）電極先端の直径は適度なものを使用する．

　　細い場合は，細胞内記録になりにくいが，

　　心臓への負担は小さい．逆に，太い場合は 　　細胞内記録が容易にできるが，記録部位の 　　損傷が大きく，場所を変えて何度も記録す 　　ることがむずかしくなる．

職　6e応朋

　この実習は，以下のようにさまざまなバージョ ンで行うことができる．

　1）摘出心臓ではなく，in　vivoで同様の実習を 　　行う．

　2）活動電位記録と同時に，張力トランスデュ 　　ーサを用いて心臓の収縮変化を観察する．

3）アセチルコリンやアドレナリンなどの薬物 　の効果を調べる．

4）スタニウスの結紮と組み合わせる．特に，

　心摘出前に洞結節に拍動が始まり，心房，

　心室と拍動が順序よく起こるのを観察する 　と良い．

5）無カリウム液を灌流すると，活動電位，収 　縮とも著しく変化し，この機序を応用編と 　して考察することができる．

6）灌流液の温度を変えると心拍数が著しく変 　北するのを観察することができる．この際，

　活動電位の持続時間が変化するのを観察す 　ることができる．

職7．実習後の討論

　実習後には，学生の記録した波形を見ながら，

主に以下の点について討論する．

1）静止膜電位の成因

2）活動電位発生のイオン機構 3）活動電位の不応期の原因 4）心筋の興奮と心電図との対応 5）心臓の自動能と興奮伝導系

陥　8eおわりに

　吸引電極による活動電位の記録は，心筋細胞が ギャップジャンクションでつながり，機能的合胞 体を形成し，吸引電極による少々の損傷に耐える ことができるため，初めて可能である．心臓の自 動能，活動電位発生と筋収縮など，臓器の活動を 学生が目の当たりにし，しかも科学的に記録観察 できるよい機会となることができるのではないか と考えられる．学生自ら全ての実験操作をこなす ことができるのもこの実習の特徴である．

シリーズ生理学実習法●　91