キャピラリー電気泳動を利用する分子間相互作用の速度解析法の開発
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(2) ※ ホームページ等で公表します。 （様式２－１） 立教ＳＦＲ－個人－報告. 研究成果の概要（図･グラフ等は使用しないこと。） 【背景】 分子間相互作用の解析は、化学や生物学分野等における様々な機能や現象の特徴や機構 を解明する上で非常に重要な研究課題である。このため各種の解析法が開発され、その一 部 は 溶 質 － リ ガ ン ド 間 に お け る 分 子 間 相 互 作 用 の 反 応 速 度 定 数（ 会 合 速 度 定 数 ka と 解 離 速 度 定 数 kd） の 測 定 に も 利 用 さ れ て い る 。 し か し 、 こ れ ら 既 往 の 速 度 解 析 法 で は 、 分 子 の 固 定化や化学修飾（蛍光標識化等）が必要であり、分子間相互作用速度の解析結果に対する このような分子の固定化や化学修飾の影響が懸念される。 そ こ で 当 研 究 室 で は こ れ ま で に 、 キ ャ ピ ラ リ ー 電 気 泳 動 （ CE） 法 と モ ー メ ン ト 解 析 理 論 を組み合わせ、溶質やリガンドの固定化や化学修飾が不要であり、かつ分子間相互作用の 平衡情報だけではなく速度情報をも測定できる分子間相互作用解析法を開発した。すなわ ち、キャピラリー内に外圧を印加して溶質－リガンド会合体の動きを停止させるクロマト グ ラ フ ィ ッ ク キ ャ ピ ラ リ ー 電 気 泳 動 （ CCE） 法 を 開 発 し た 。 こ の 時 、 キ ャ ピ ラ リ ー 内 に お ける溶質分子の物質移動挙動はクロマトグラフィー系のそれと類似した状態となる。この CCE 法 の 導 入 に よ り CE 溶 出 ピ ー ク 形 状 の モ ー メ ン ト 解 析 が 可 能 に な り 、 反 応 （ 会 合 ・ 解 離 ）速 度 定 数 を 解 析 的 に 求 め る こ と が 可 能 に な っ た 。 し か し 、CE 装 置 の 性 能 上（ 印 加 圧 力 の刻み）の制限からキャピラリー内に印加する外部圧力を微妙に調節することができない た め 、 CCE 条 件 下 で CE 実 験 を 行 う こ と は 実 際 に は 難 し い 。 そ こ で 、 外 圧 を 段 階 的 に 変 化 さ せ て 実 測 し た 溶 出 ピ ー ク 情 報 を 解 析 し て 目 的 の 速 度 定 数 を 決 定 す る 現 実 的 な CE 実 験 法 およびデータ解析法を開発した。 そこで本研究では、本解析法の完成度の向上と適用範囲の拡大を図るため、ドラッグデ リバリーシステムを意識した実験系として界面活性剤ミセルをリガンド（分離媒体）とし て使用する実験系を取り上げ、以下のような研究課題を設定した。 (1 ) C C E 法 に よ る 溶 質 － 界 面 活 性 剤 ミ セ ル 間 相 互 作 用 の 速 度 解 析 (2) 界 面 活 性 剤 ミ セ ル － 複 数 の ア ミ ノ 酸 間 の 各 相 互 作 用 の 一 斉 解 析 【 CCE法 に よ る 溶 質 － 界 面 活 性 剤 ミ セ ル 間 相 互 作 用 の 速 度 解 析 】 ド デ シ ル 硫 酸 ナ ト リ ウ ム（ S D S ）ミ セ ル を リ ガ ン ド と し て 利 用 す る C E 系 に 本 解 析 法 を 適 用 し 、 SDS ミ セ ル － 溶 質 分 子 間 の 相 互 作 用 の 速 度 解 析 を 行 っ た 。 溶 質 お よ び 電 気 浸 透 流 （ E O F）マ ー カ ー と し て 、チ モ ー ル（ 2 . 0 m m o l d m - 3 ）お よ び ジ メ チ ル ス ル ホ キ シ ド（ D M S O ） （ 0 . 3 3 % , v / v ）（ い ず れ も 電 気 的 中 性 ） を 用 い た 。 泳 動 液 は 、 2 0 m m o l d m - 3 リ ン 酸 緩 衝 水 溶 液 （ pH 7.1） と メ タ ノ ー ル と の 混 合 溶 液 （ 80/20, v/v） に SDS を 15.4 mmol dm-3（ CMC 以 上 の 濃 度 ）溶 解 し て 調 製 し た 。シ リ カ 溶 融 キ ャ ピ ラ リ ー（ 内 径 7 5 μ m 、外 径 3 7 5 μ m 、全 長 4 0 . 2 c m、 有 効 長 3 0 c m ） を 使 用 し 、 3 7 0 V c m - 1 の 電 位 勾 配 を 印 加 し て 電 気 泳 動 実 験 を 行 っ た 。 ま た 、 キ ャ ピ ラ リ ー に 印 加 す る 外 部 圧 力 を - 0.1～ 0.1 psi の 範 囲 で 変 化 さ せ た 。 測 定 し た チ モ ー ル お よ び D M S O の 溶 出 ピ ー ク か ら C C E 条 件 下 に お け る 溶 出 ピ ー ク の 一 次 、二 次 モ ー メ ントを求め、それらの値を解析した。 チ モ ー ル お よ び DMSO の 一 次 モ ー メ ン ト 値 を 逐 次 近 似 法 に よ っ て 解 析 し た 結 果 、チ モ ー ル － SDS ミ セ ル 会 合 体 を キ ャ ピ ラ リ ー 内 で 停 止 す る た め に 印 加 す る 外 部 圧 力 は - 0.082 psi で あ っ た 。 ま た 、 会 合 平 衡 定 数 は 6 . 3 5 x 1 0 3 d m 3 mo l - 1 で あ っ た 。 一 方 、 二 次 モ ー メ ン ト.
(3) ※ ホームページ等で公表します。 （様式２－２） 立教ＳＦＲ－個人－報告. 研究成果の概要（つづき） 解 析 に つ い て は 、 先 ず CE 実 験 と 同 じ 条 件 下 で の キ ャ ピ ラ リ ー 内 泳 動 液 中 に お け る DMSO の 拡 散 係 数 を DMSO ピ ー ク の 二 次 モ ー メ ン ト 値 か ら 求 め た 。 次 に 、 同 条 件 下 に お け る チ モ ー ル の 拡 散 係 数 を 上 記 の DMSO の 拡 散 係 数 か ら 、両 者 の 分 子 サ イ ズ の 差 異 を 考 慮 し て 求 め た。さらに、チモールの拡散係数に基づきチモールピークの二次モーメント値に対する拡 散の寄与を求めた。二次モーメントの実測値からこの拡散の寄与を差し引いて、チモール － SDS ミ セ ル 間 相 互 作 用 の 寄 与 を 求 め た 。 そ の 結 果 、 チ モ ー ル － SDS ミ セ ル 間 相 互 作 用 の 会 合 速 度 定 数 お よ び 解 離 速 度 定 数 の 測 定 値 は 各 々 5.6 x 104 dm3 mol-1 s-1 お よ び 8.7 s-1 で あ った。 以 上 の よ う に 、 SDS ミ セ ル を リ ガ ン ド と し て 利 用 す る CE 系 に 本 解 析 法 を 適 用 し 、 チ モ ー ル － SDS ミ セ ル 間 相 互 作 用 の 会 合 平 衡 定 数 、 会 合 速 度 定 数 お よ び 解 離 速 度 定 数 を 測 定 し てその有用性を実証した。 【界面活性剤ミセル－複数のアミノ酸間の各相互作用の一斉解析】 二 種 類 の ア ミ ノ 酸 と SDS ミ セ ル と の 間 の 各 々 の 相 互 作 用 を 同 時 に 解 析 す る 一 斉 解 析 法 に つ い て 検 討 を 行 っ た 。 溶 質 と し て L-ド ー パ お よ び L-チ ロ シ ン 、 ま た EOF マ ー カ ー と し て DMSO を 用 い た 。 試 料 溶 液 中 の 両 ア ミ ノ 酸 の 濃 度 は 各 々 1.5 mmol dm-3 で あ り 、 DMSO 濃 度 は 上 記 と 同 様 で あ る 。泳 動 液 は 、3 0 m m o l d m - 3 酢 酸 緩 衝 水 溶 液（ p H 5 . 5 ）に S D S を 1 5 0 m m o l dm-3 溶 解 （ CMC 以 上 の 濃 度 ） し て 調 製 し た 。 シ リ カ 溶 融 キ ャ ピ ラ リ ー （ 内 径 75 μm、 外 径 375 μm、 全 長 31 cm、 有 効 長 20.8 cm） を 使 用 し 、 323 V cm-1 の 電 位 勾 配 を 印 加 し て 電 気 泳 動 実 験 を 行 っ た 。 ま た 、 キ ャ ピ ラ リ ー に 印 加 す る 外 部 圧 力 を - 0.1～ 0.1 psi の 範 囲 で 変 化 さ せ た 。 両 ア ミ ノ 酸 の 混 合 溶 液 を 注 入 す る 場 合 （ 混 合 系 ） お よ び L-ド ー パ だ け を 注 入 す る 場 合（ 単 一 系 ）に つ い て 、各 ア ミ ノ 酸 と D M S O の 溶 出 ピ ー ク か ら C C E 条 件 下 に お け る 溶 出 ピ ークの一次、二次モーメントを求め、上記と同様にしてそれらの値を解析した。 各 ア ミ ノ 酸 お よ び DMSO ピ ー ク の 一 次 お よ び 二 次 モ ー メ ン ト 値 を 解 析 し た 結 果 、ア ミ ノ 酸 － SDS ミ セ ル 会 合 体 を キ ャ ピ ラ リ ー 内 で 停 止 す る た め に 印 加 す る 外 部 圧 力 は 何 れ の 場 合 も - 0 . 0 8 8 p s i で あ っ た 。 ま た 、 会 合 平 衡 定 数 （ K A ）、 会 合 速 度 定 数 （ k a ） お よ び 解 離 速 度 定 数 （ kd） の 測 定 値 は 以 下 の 通 り で あ っ た 。 L - ド ー パ － S D S ミ セ ル （ 混 合 系 ）： K A = 1 . 1 x 1 0 2 d m 3 m o l - 1 、 k a = 1 . 3 x 1 0 3 d m 3 mo l - 1 s - 1 、 k d = 11 s - 1 L - チ ロ シ ン － S D S ミ セ ル （ 混 合 系 ）： K A = 2 . 2 x 1 0 2 d m 3 m o l - 1 、 k a = 4 . 8 x 1 0 3 d m 3 mo l - 1 s - 1 、 kd = 22 s-1 L - ド ー パ － S D S ミ セ ル （ 単 一 系 ）： K A = 1 . 2 x 1 0 2 d m 3 m o l - 1 、 k a = 1 . 2 x 1 0 3 d m 3 mo l - 1 s - 1 、 kd = 10 s-1 上 記 の よ う に 、混 合 系 の 二 種 類 の ア ミ ノ 酸 と S D S ミ セ ル と の 間 の 各 々 の 相 互 作 用 を 同 時 に 解 析 す る こ と が で き た 。 ま た 、 L-ド ー パ － SDS ミ セ ル 間 の 相 互 作 用 に 関 す る 解 析 結 果 が 混 合 系 と 単 一 系 と で 良 く 一 致 し て お り 、 共 存 成 分 （ 本 研 究 で は L-チ ロ シ ン ） の 影 響 を 受 け る こ と な く 目 的 成 分（ 本 研 究 で は L - ド ー パ ）の 相 互 作 用 挙 動 を 解 析 で き た 。以 上 の よ う に 、 本解析法による分子間相互作用の一斉解析の可能性が明らかになった。 ※ この（様式２）に記入の、成果の公表を見合わせる必要がある場合は、その理由及び差し控え期間 等を記入した調書（Ａ４縦型横書き１枚・自由様式）を添付すること。.
(4) ※ ホームページ等で公表します。 （様式３） 立教ＳＦＲ－個人－報告. 研究発表 （研究によって得られた研究経過・成果を発表した①～④について、該当するものを記入してください。該当するものが多い 場合は主要なものを抜粋してください。 ） ①雑誌論文（著者名、論文標題、雑誌名、巻号、発行年、ページ） ②図書（著者名、出版社、書名、発行年、総ページ数） ③シンポジウム・公開講演会等の開催（会名、開催日、開催場所） ④その他（学会発表、研究報告書の印刷等）. ①雑誌論文 1 . M i y a b e , K . ; Ta k a h a s h i , R . ; S h i m a z a k i , Y. “ K i n e t i c S t u d y o f I n t e r a c t i o n b e t w e e n S o l u t e Molecule and Surfactant Micelle”, Anal. Sci., 31, 2015, 1019-1025. 2 . M i y a b e , K . ; S h i m a z a k i , Y. “ M o m e n t A n a l y s i s o f A ff i n i t y k i n e t i c s i n In c l u s i o n C o m p l e x S y s t e m b e t w e e n T h y m o l a n d S u l f a t e d -β - c y c l o d e x t r i n b y C h r o ma t o g r a p h i c C a p i l l a r y E l e c t r o p h o r e s i s ( C C E ) ” B u l l . C h e m . S o c . J p n . , 8 8 , 2 0 1 5 , 1 6 0 3 - 1 6 11 . ④その他 1 . K. M i y a b e , Y. S h i m a z a k i , “ C h r o m a t o g r a p h i c C a p i l l a r y E l e c t r o p h o r e s i s ( C C E ) : A S t r a t e g y f o r K i n e t i c S t u d y o f I n t e r mo l e c u l a r I n t e r a c t i o n ” , T h e 3 9 t h I n t e r n a t i o n a l S y m p o s i u m o n C a p i l l a r y C h r o m a t o g r a p h y ( I S C C 2 0 1 5 ) ( Fo r t Wo r t h , T X U S A ) , 2 0 1 5 年 5 月 1 9 日 2. 宮 部 寛 志 ・ 島 崎 裕 紀 ， “キ ャ ピ ラ リ ー 電 気 泳 動 を 利 用 す る 分 子 間 相 互 作 用 の 速 度 解 析 法 の 開 発 ” ， 第 7 5 回 分 析 化 学 討 論 会 （ 甲 府 市 ）， 2 0 1 5 年 5 月 2 4 日 3 . 宮 部 寛 志 ・ 島 崎 裕 紀 ， “ ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ッ ク キ ャ ピ ラ リ ー 電 気 泳 動 （ C C E ）： 分 子 間 相 互 作 用 の 速 度 解 析 法 ” ， 第 1 3 回 ホ ス ト ・ ゲ ス ト 化 学 シ ン ポ ジ ウ ム （ 仙 台 市 ）， 2 0 1 5 年 6 月 6 日 4. K. Miyabe, “Chromatographic Capillar y Electrophoresis (CCE): A Strategy for Analyzing Equilibrium and Kinetic Characteristics of Intermolecular Interaction ”, T h e 42nd International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Te c h n i q u e s ( H P LC 2 0 1 5 ) ( G e n e v a , S w i t ze r l a n d ) , 2 0 1 5 年 6 月 2 2 日 5. 宮 部 寛 志 ， “キ ャ ピ ラ リ ー 電 気 泳 動 を 利 用 す る 分 子 間 相 互 作 用 の 速 度 解 析 法 ”， 第 28 回 バ イ オ メ デ ィ カ ル 分 析 科 学 シ ン ポ ジ ウ ム （ 長 崎 市 ）， 2 0 1 5 年 8 月 2 1 日 6. 宮 部 寛 志 ， “非 固 定 化 か つ 非 化 学 修 飾 状 態 に お け る 分 子 間 相 互 作 用 の 速 度 解 析 法 ”， イ ノ ベ ー シ ョ ン ジ ャ パ ン 2 0 1 5 （ 東 京 都 江 東 区 ）， 2 0 1 5 年 8 月 2 7 日 ～ 2 8 日 7 . K. M i y a b e , Y. S h i m a z a k i , “ C h r o m a t o g r a p h i c C a p i l l a r y E l e c t r o p h o r e s i s ( C C E ) : A S t r a t e g y f o r K i n e t i c S t u d y o f I n t e r m o l e c u l a r I n t e r a c t i o n ” , T h e 2 2 n d In t e r n a t i o n a l S y m p o s i u m o n E l e c t r o - a n d L i q u i d P h a s e - S e p a r a t i o n Te c h n i q u e s ( IT P 2 0 1 5 ) ( H e r s i n ki , F i n l a n d ) , 2 0 1 5 年 8 月 31 日 8. 宮 部 寛 志 ・ 島 崎 裕 紀 ， “キ ャ ピ ラ リ ー 電 気 泳 動 を 利 用 す る 分 子 間 相 互 作 用 の 速 度 解 析 法 の 開 発 ” ， 日 本 分 析 化 学 会 第 6 4 年 会 （ 福 岡 市 ）， 2 0 1 5 年 9 月 9 日 9. 宮 部 寛 志 ・ 島 崎 裕 紀 ， “キ ャ ピ ラ リ ー 電 気 泳 動 法 に よ る 分 子 間 相 互 作 用 の 会 合 ・ 解 離 速 度 定 数 の 測 定 ” ， 第 3 7 回 生 体 膜 と 薬 物 の 相 互 作 用 シ ン ポ ジ ウ ム （ 熊 本 市 ）， 2 0 1 5 年 11 月 1 9 日 10. 宮 部 寛 志 ・ 島 崎 裕 紀 ， “分 子 の 固 定 化 や 化 学 修 飾 が 不 要 な 分 子 間 相 互 作 用 の 速 度 解 析 法 の 開 発 ” ， 新 ア ミ ノ 酸 分 析 研 究 会 第 5 回 学 術 講 演 会 （ 東 京 都 文 京 区 ）， 2 0 1 5 年 1 2 月 7 日 11 . K . M i y a b e , Y. S h i m a z a k i , “ C h r o m a t o g r a p h i c C a p i l l a r y E l e c t r o p h o r e s i s ( C C E ) : A M e t h o d f o r K i n e t i c S t u d y o f In t e r mo l e c u l a r In t e r a c t i o n ” , T h e 2 0 1 5 I n t e r n a t i o n a l C h e m i c a l C o n g r e s s o f P a c i f i c B a s i n S o c i e t i e s ( P a c i f i c h e m2 0 1 5 ) ( H o n o l u l u , H I U S A ) , 2 0 1 5 年 1 2 月 15 日 1 2 . 宮 部 寛 志 ，「 電 気 泳 動 に よ る 物 質 の 相 互 作 用 の 分 析 方 法 」（ 国 内 優 先 特 許 出 願 ） 特 願 2016-007834， 2016 年 1 月 19 日.
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