博 士 論 文 概 要

早稲田大学大学院 先進理工学研究科

博 士 論 文 概 要

論 文 題 目

多細胞性シアノバクテリア Anabaena sp.

PCC 7120 における概日機構の基本特性と

ヘテロシスト特異的な概日振動の解析

Analyses on the Kai-Based Circadian System and Heterocyst-Specific Rhythms

in the Filamentous Cyanobacterium, Anabaena sp. PCC 7120

申 請 者

櫛笥 博子 Hiroko KUSHIGE

電気・情報生命専攻 細胞分子ネットワーク研究

2012 年 12 月

（ 受 理 申 請 す る 部 科 主 任 会 開 催 年 月 を 記 入 ）

No.1

概 日 時 計 は 約 2 4 時 間 の 内 在 的 な 自 律 振 動 を 生 じ る 機 構 で あ り 、バ ク テ リ ア か ら 植 物 、 動 物 に 至 ま で 殆 ど の 生 物 が 日 々 の 環 境 変 動 に 適 応 す る た め に 利 用 し て い る 。 概 日 時 計 は 、 生 理 機 能 の 時 間 的 調 節 に 大 き な 役 割 を 果 た す だ け で な く 、 昆 虫 や 鳥 類 の 飛 行 に 用 い ら れ る 太 陽 コ ン パ ス 、 動 植 物 の 季 節 繁 殖 を 司 る 光 周 性 反 応 の 基 底 と な る 計 時 機 構 と し て も 機 能 す る 。 概 日 時 計 は 、 そ の 機 能 を 果 た す た め に 、 以 下 の 重 要 な 生 理 学 的 特 性 に よ っ て 定 義 さ れ る 。（1）周 期 が 約 2 4 時 間 で 自 律 振 動 性 を も つ こ と （ 自 由 継 続 性 ）、（2） 概 日 周 期 長 （ 時 間 ） が 生 理 学 的 温 度 範 囲 内 で あ ま り 変 化 を 受 け な い こ と（ 周 期 の 温 度 補 償 性 ）、（3）光 な ど の 環 境 変 化 に 対 し て 同 調 す る こ と （ 位 相 同 調 性 ） の 三 条 件 で あ り 、 こ れ ら を 満 た す 生 体 振 動 を 概 日 リ ズ ム と 呼 ぶ 。

現 在 概 日 リ ズ ム が 確 認 さ れ て い る 最 も 単 純 な モ デ ル 生 物 は 、 酸 素 発 生 型 の 光 合 成 を 行 う 原 核 生 物 群 、 シ ア ノ バ ク テ リ ア （ 藍 色 細 菌 ） で あ る 。 従 来 、 シ ア ノ バ ク テ リ ア の 概 日 リ ズ ム は 、主 に 単 細 胞 性 の S y n e c h o c o c c u s e l o n g a t u s P C C 7 9 4 2（ 以 下 、

S y n e c h o c o c c u s） に お い て 分 子 遺 伝 学 的 、 生 理 学 的 な 研 究 が 進 め ら れ て き た 。 た と

え ば 概 日 リ ズ ム の 発 生 に 必 須 な 遺 伝 子 群 と し て k a i A B C が 同 定 さ れ て い る 。 概 日 リ ズ ム の 発 振 機 構 と し て は 、 従 来 時 計 遺 伝 子 の 転 写 ・ 翻 訳 フ ィ ー ド バ ッ ク 制 御 が 提 唱 さ れ て き た 。 し か し 、S y n e c h o c o c c u s に お い て は 、 ほ ぼ 全 て の 遺 伝 子 で 転 写 が 行 わ れ な い 暗 期 に お い て も K a i C タ ン パ ク 質 の リ ン 酸 化 リ ズ ム が 継 続 す る こ と 、i n

v i t r o で も K a i A、K a i B、K a i C の 組 み 換 え タ ン パ ク 質 と A T P を イ ン キ ュ ベ ー ト す る

だ け で K a i C の リ ン 酸 化 リ ズ ム を 再 構 成 で き る こ と か ら 、 転 写 ・ 翻 訳 フ ィ ー ド バ ッ ク で は な く 、 タ ン パ ク 質 間 相 互 作 用 に 基 づ く 翻 訳 後 制 御 ネ ッ ト ワ ー ク に よ り 基 本 振 動 を 生 じ る こ と が 明 ら か に さ れ た 。

多 細 胞 生 物 、 と く に 動 物 の 概 日 シ ス テ ム に お い て は 細 胞 間 相 互 作 用 が 振 動 の 安 定 性 に 重 要 な 意 味 を 持 つ 。 た と え ば 、 哺 乳 類 の 脳 内 時 計 中 枢 S C N（ 視 交 叉 上 核 ） で は 、 多 く の 神 経 細 胞 同 士 が カ ッ プ リ ン グ し な が ら 強 力 な 時 計 細 胞 集 団 を 形 成 し て い る が 、 興 味 深 い こ と に 、 単 細 胞 性 シ ア ノ バ ク テ リ ア で は 細 胞 間 で 互 い に 概 日 リ ズ ム が 同 期 し な い と 報 告 さ れ て い る 。 こ れ に 対 し 、 多 細 胞 体 制 を 持 つ 糸 状 性 シ ア ノ バ ク テ リ ア で は 細 胞 間 連 絡 が 存 在 す る こ と か ら 、 隣 接 す る 時 計 細 胞 同 士 が 同 調 し て い る 可 能 性 が あ る と 考 え ら れ る 。

多 細 胞 性 シ ア ノ バ ク テ リ ア の 概 日 振 動 と し て 、 既 に 細 胞 増 殖 率 の 変 化 な ど が 報 告 さ れ て い る が 、 そ の 詳 細 は 明 ら か に さ れ て お ら ず 、 分 子 レ ベ ル の 解 析 も 殆 ど 行 わ れ て こ な か っ た 。 そ こ で 我 々 は 、 概 日 時 計 と 細 胞 分 化 を 伴 う 形 態 形 成 ・ 多 細 胞 体 制 と の 関 連 を 調 べ る た め の 最 も 単 純 な モ デ ル 生 物 と し て 、A n a b a e n a s p . P C C 7 1 2 0（ 以 下 、A n a b a e n a）に 着 目 し た 。A n a b a e n a は 、細 胞 分 裂 ／ 分 化 の プ ロ グ ラ ム 、 窒 素 固 定 代 謝 の 分 子 遺 伝 学 的 解 析 が 進 め ら れ て き た モ デ ル 生 物 と し て 知 ら れ 、 窒 素 欠 乏 条 件 下 で 1 0 - 1 5 細 胞 に 1 個 の 割 合 で 窒 素 固 定 に 特 化 し た 異 種 細 胞 （ ヘ テ ロ シ ス ト ） を 分 化 す る 。 窒 素 固 定 能 を 担 う 酵 素 ニ ト ロ ゲ ナ ー ゼ は 酸 素 に よ り 失 活 す

る た め 、 ヘ テ ロ シ ス ト で は 光 化 学 系 Ⅱ の 活 性 が 止 ま り 、 呼 吸 が 活 性 化 さ れ 、 さ ら に 多 糖 類 と 糖 脂 質 を 含 む 厚 い 外 膜 が 形 成 さ れ る こ と で 細 胞 内 の 酸 素 分 圧 が 低 下 し 、 窒 素 固 定 を 可 能 に し て い る 。

A n a b a e n a の ゲ ノ ム D N A に は k a i A、k a i B、k a i C の 相 同 遺 伝 子 群 が 存 在 し 、K a i A、 K a i B タ ン パ ク 質 の 構 造 解 析 な ど が 試 み ら れ て い る も の の 、i n v i v o で の 実 際 の 概 日 リ ズ ム の 検 証 は 殆 ど 行 わ れ て こ な か っ た 。 そ こ で 、 我 々 は ま ず A n a b a e n a 概 日 機 構 の 基 本 特 性 を 検 証 し 、 分 子 生 物 学 的 ・ 生 理 学 的 解 析 に 耐 え る 実 験 系 を 構 築 す る こ と を 第 一 の 研 究 テ ー マ と し た 。 次 に 、 第 二 の テ ー マ と し て 、 代 謝 状 態 が 栄 養 細 胞 と は 異 な り 、 さ ら に 、 糸 状 に 細 胞 が 連 な っ た 個 体 上 で 、 栄 養 細 胞 の 連 鎖 を 一 定 間 隔 で 分 断 す る よ う に 分 化 す る ヘ テ ロ シ ス ト に お い て 時 計 が 機 能 し て い る の か と い う 疑 問 に 迫 っ た 。 こ れ ら の 知 見 は 、 時 計 細 胞 同 士 の カ ッ プ リ ン グ の 有 無 や 、 概 日 時 計 と 形 態 形 成 の 関 与 を 検 証 す る た め の 重 要 な 基 礎 デ ー タ と な る は ず で あ る 。 近 年 、 マ イ ク ロ 加 工 技 術 の 発 達 と と も に マ イ ク ロ 流 路 を 用 い た 一 細 胞 連 続 培 養 系 の 構 築 な ど 、 単 一 細 胞 で の 様 々 な 解 析 が 可 能 に な り つ つ あ る た め 、 こ れ ら の 局 所 的 な 顕 微 細 胞 操 作 技 術 や 観 測 技 術 を 細 胞 間 相 互 作 用 や 形 態 形 成 の 解 析 に 取 り 入 れ る こ と で 、A n a b a e n a に お け る 概 日 時 計 と 細 胞 間 の 複 雑 な 分 子 ネ ッ ト ワ ー ク の 相 互 作 用 を 解 き 明 か す こ と が で き る と 期 待 さ れ る 。

本 論 文 は 四 章 で 構 成 さ れ 、 各 章 の 要 約 を 以 下 に 示 す 。

第 一 章 は 序 論 で あ り 、 高 等 動 植 物 か ら バ ク テ リ ア ま で の 概 日 シ ス テ ム の 概 要 、 シ ア ノ バ ク テ リ ア の 概 日 シ ス テ ム と し て S y n e c h o c o c c u s に お い て 明 ら か に さ れ て き た 成 果 を ま と め る 。 さ ら に 、 分 化 ・ パ タ ー ン 形 成 の モ デ ル 生 物 で あ る A n a b a e n a の 研 究 報 告 を 紹 介 し 、 本 研 究 の 当 該 分 野 に お け る 意 義 に つ い て 記 す 。

第 二 章 で は 、窒 素 源 含 有 条 件 下（ 栄 養 細 胞 の み で 構 成 さ れ た 個 体 ）で の A n a b a e n a の 概 日 特 性 の 解 析 結 果 と 実 験 系 の 構 築 を 示 す 。S y n e c h o c o c c u s で 行 わ れ て き た 多 く の 分 子 遺 伝 学 的 、 生 理 学 的 な 研 究 に は 、 最 も 高 振 幅 な 転 写 振 動 を 呈 す る k a i B C の 発 現 が 指 標 と し て 利 用 さ れ 、 特 に そ の プ ロ モ ー タ ー 活 性 を モ ニ タ リ ン グ す る 発 光 レ ポ ー タ ー が 重 用 さ れ て き た 。A n a b a e n a に お い て も 、詳 細 な 概 日 転 写 振 動 を 解 析 で き る こ と が 重 要 で あ る た め 、我 々 は 、は じ め に A n a b a e n a の k a i 相 同 遺 伝 子 群 の 発 現 プ ロ フ ァ イ ル を 調 べ た が 、S y n e c h o c o c c u s の よ う な 顕 著 な 高 振 幅 の 転 写 振 動 は 観 察 で き な か っ た 。そ こ で 、A n a b a e n a に お け る 概 日 振 動 の 指 標 と な り 得 る 概 日 発 現 遺 伝 子 群 の 抽 出 を 行 う こ と を 目 的 に 、D N A マ イ ク ロ ア レ イ を 用 い た ゲ ノ ム ワ イ ド な 発 現 解 析 を 行 っ た 。 そ の 結 果 5 , 3 3 6 遺 伝 子 中 、 明 暗 同 調 後 の 連 続 明 条 件 下 で 顕 著 な 概 日 振 動 を 示 す 7 8 遺 伝 子 、 さ ら に 高 振 幅 を 示 す 1 8 遺 伝 子 を 同 定 し た 。 こ れ ら の 高 振 幅 概 日 発 現 遺 伝 子 群 の 中 か ら 選 ん だ 、 異 な る 位 相 を も つ 2 つ の 遺 伝 子 の プ ロ モ ー タ ー 活 性 を モ ニ タ ー で き る 生 物 発 光 レ ポ ー タ ー 株 を 作 製 し 、 そ の 発 光 リ ズ ム の 解 析 か ら 、A n a b a e n a の 転 写 振 動 が 概 日 時 計 の 三 つ の 生 理 学 的 特 性 を 満 た

No.3

す こ と を 確 認 し た 。 上 述 の 通 り 、A n a b a e n a の k a i 遺 伝 子 群 は 顕 著 な 発 現 振 動 を 示 さ な い が 、 概 日 リ ズ ム の 中 枢 で あ る 可 能 性 を 認 め 、k a i 遺 伝 子 ク ラ ス タ ー を 破 壊

し た k a i A B C 欠 損 株 を 作 製 し た 。 こ の 株 を 用 い て 高 振 幅 概 日 発 現 遺 伝 子 の 転 写 プ

ロ フ ァ イ ル を 確 認 し た と こ ろ 、そ の す べ て で 転 写 リ ズ ム が 失 わ れ て い た こ と か ら 、

A n a b a e n a に お い て も k a i 遺 伝 子 が 時 計 の 中 枢 で あ る こ と が 強 く 示 唆 さ れ た 。

第 三 章 で は 、窒 素 欠 乏 条 件 下 で 培 養 し た A n a b a e n a（ 栄 養 細 胞 お よ び ヘ テ ロ シ ス ト で 構 成 さ れ る 個 体 ） に つ い て 解 析 を 行 っ た 結 果 を 示 す 。 単 細 胞 性 の

S y n e c h o c o c c u s で は 、 酸 化 還 元 状 態 や A T P 濃 度 な ど の 細 胞 内 環 境 が K a i タ ン パ ク

質 複 合 体 の 生 化 学 的 な パ ラ メ ー タ に 変 化 を も た ら す こ と で 、 基 本 振 動 の 周 期 長 や 光 入 力 系 （ 位 相 応 答 ） に 影 響 を 及 ぼ す こ と が 知 ら れ て い る 。A n a b a e n a に お け る 細 胞 内 p H や 酸 化 還 元 状 態 に 関 す る 詳 細 は 不 明 な と こ ろ が 多 い が 、 独 立 栄 養 性 の 栄 養 細 胞 と 従 属 栄 養 性 の ヘ テ ロ シ ス ト の 細 胞 内 環 境 ・ 代 謝 状 態 は 大 き く 異 な っ て お り 、ヘ テ ロ シ ス ト に お い て も 概 日 時 計 が 機 能 し て い る の か は 不 明 で あ る 。そ こ で 、 我 々 は D N A マ イ ク ロ ア レ イ 解 析 を 用 い て 、 細 胞 分 化 し た 個 体 に お い て 概 日 転 写 振 動 を 示 す 遺 伝 子 群 を 同 定 し た 。 さ ら に 、 ヘ テ ロ シ ス ト を 選 択 的 に 濃 縮 し た ヘ テ ロ シ ス ト 濃 縮 画 分 を 用 い て D N A マ イ ク ロ ア レ イ 解 析 を 行 い 、 改 め て ヘ テ ロ シ ス ト 特 異 的 に 発 現 す る 遺 伝 子 群 を リ ス ト ア ッ プ し た 。 両 者 の 発 現 プ ロ フ ァ イ ル を 詳 細 に 検 討 す る こ と に よ り 、 最 終 的 に ヘ テ ロ シ ス ト 特 異 的 に 高 振 幅 な 概 日 転 写 振 動 を 示 す 遺 伝 子 群 a l l 1 4 2 7、h e s A B を 特 定 し た 。 さ ら に 、 ヘ テ ロ シ ス ト 分 化 の 中 心 制 御 遺 伝 子 h e t R を 欠 き 、 ヘ テ ロ シ ス ト を 形 成 で き な い h e t R 欠 損 株 に お い て は 、 窒 素 欠 乏 条 件 下 で も こ れ ら の 遺 伝 子 群 の 発 現 が 誘 導 さ れ な い こ と を 確 認 し た 。 以 上 の 結 果 か ら 、 我 々 は 多 細 胞 性 シ ア ノ バ ク テ リ ア A n a b a e n a で は 、 栄 養 細 胞 だ け で な く ヘ テ ロ シ ス ト に お い て も 概 日 制 御 が 行 わ れ て い る こ と を 見 出 し た 。 従 来 、 概 日 リ ズ ム と 細 胞 分 化 、 多 細 胞 体 制 と の 関 わ り は 高 等 動 植 物 で の み 解 析 可 能 な 課 題 で あ っ た が 、 こ れ ら の 成 果 は こ う し た 高 次 生 命 現 象 を バ ク テ リ ア に お い て も 解 析 で き る こ と を 強 く 示 唆 す る も の で あ る 。

第 四 章 で は 、 第 二 章 、 第 三 章 で 示 し た 研 究 結 果 を 総 括 し 、A n a b a e n a の 概 日 シ ス テ ム に つ い て ま と め る 。 ま た 、 栄 養 細 胞 間 、 ま た は 栄 養 細 胞-ヘ テ ロ シ ス ト 細 胞 間 の 位 相 同 調 や 、 ヘ テ ロ シ ス ト に お け る 概 日 制 御 の 生 理 学 的 機 能 、 細 胞 分 化 と 概 日 機 構 の 関 連 に つ い て 、 今 後 の 展 望 を 述 べ る 。

Ｎｏ.1

早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書

氏 名 櫛笥 博子 印

（2013 年 1 月 現在）

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

論文 講演

○ Hiroko Kushige, Hideyuki Kugenuma, Masaki Matsuoka, Shigeki Ehira, Masayuki Ohmori, Hideo Iwasaki

Genome-wide and Heterocyst-specific Circadian Gene Expression in the Filamentous Cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120

Journal of Bacteriology, in press

(published online ahead of print on 11 January 2013, doi:10.1128/JB.02067-12)

＜国際学会（ポスター発表）＞

○Hiroko Kushige, Masaki Matsuoka, Hideyuki Kugenuma, Hideo Iwasaki

Global circadian transcription rhythms without robust kai-gene cycling in the heterocyst-forming multicellular cyanobacterium, Anabaena sp. PCC 7120

12th Biennial Meeting, Society for Research on Biological Rhythms, Florida (May 2010)

○Hiroko Kushige, Masaki Matsuoka, Hideo Iwasaki

Circadian system in the heterocyst-forming cyanobacterium, Anabaena sp. PCC 7120

13th International Symposium on Phototrophic Prokaryotes (ISPP 2009), Montreal (August 2009)

○Hiroko Kushige, Masaki Matsuoka, Hideyuki Kugenuma, Hideo Iwasaki

Global analysis of circadian expression in the heterocyst-forming multicellular cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120

International Symposium on Biological Rhythm and Photonic Bioimaging, Sapporo (August 2009)

＜国内学会（口頭発表）＞

○櫛笥博子, 松岡正城, 岩崎秀雄

多細胞性シアノバクテリアの概日機構の解明

時間生物フォーラム東京 2009、東京 (2009年2月)

＜国内学会（ポスター発表）＞

○櫛笥博子, 久下沼秀之, 宮城康之, 岩森俊介, 松岡正城, 大森正之, 岩崎秀雄 細胞分化を伴う形態形成能を持つ多細胞性シアノバクテリア Anabaena sp. PCC7120 の概日時計

第53回 日本植物生理学会年会、京都 (2012年3月)

○櫛笥博子, 久下沼秀之, 松岡正城, 大森正之, 岩崎秀雄

多細胞性シアノバクテリアAnabaena sp. PCC7120が刻む概日時計のシステムとは？

第52回 日本植物生理学会年会、仙台（2011年 3月 地震災害の為、要旨掲載をもって 学会発表となった、要旨集p.336）

Ｎｏ.2

早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

講演 その他

久下沼秀之, 櫛笥博子, 松岡正城, 岩崎秀雄

多細胞性シアノバクテリアAnabaenaにおける概日時計機構の解析 時間生物フォーラム東京 2011、東京 (2011年2月)

久下沼秀之, 櫛笥博子, 松岡正城, 岩崎秀雄

多細胞性シアノバクテリアAnabaena における発光レポーターを用いた概日時計機構の 解析

第17回 日本時間生物学会学術大会、東京 (2010年11月)

○櫛笥博子, 岩森俊介, 松岡正城, 浅井宏啓, 久下沼秀之, 岩崎秀雄

Anabaena sp. PCC 7120 における時空間パターン形成：概日時計と形態形成 かずさDNA研究所研究会・ラン藻の分子生物学2009、千葉 (2009年12月)

○櫛笥博子, 松岡正城, 久下沼秀之, 岩崎秀雄

多細胞性シアノバクテリアAnabaena sp. PCC 7120における概日遺伝子発現リズム 第16回 日本時間生物学会(ASRS, JSSR, JSC Joint Congress 2009)、大阪 (2009年10 月)

松岡正城, 櫛笥博子, 岩崎秀雄

Anabaena sp. PCC 7120 における時計制御機構の解析 第15回 日本時間生物学会学術大会、岡山 (2008年11月)

＜国際学会＞

Kumiko Miyoshi, Takahiro Ouchiyama, Hiroko Kushige, Hideyuki Tamaki, Nakao Nomura, Norio Sugiura, Yuhei Inamori and Masatoshi Matsumura

Investigation of biological and chemo-physical treatment in model lake

The proceedings of IWA specialized conference Nutrient Management in Wastewater Treatment Processes and Recycle Streams, 1251-1255, Poland (September 2005)

＜国内学会（口頭発表）＞

櫛笥博子, 小出昌弘, 稲森悠平, 板山朋聡

マイクロウェルを用いた有害藍藻類の個体同定のための分子生物学的手法の開発 第40回日本水環境学会年会, 仙台, (2006年3月)

胡湛波, 孔海南, 田中伸幸, 桑原享史, 櫛笥博子, 小出昌弘, 板山朋聡, 稲森悠平

土壌トレンチシステムにおけるamoA 遺伝子に基づいたアンモニア酸化細菌群の分子生 物学的解析

日本水処理生物学会第42回大会, 静岡 (2005年10月)

櫛笥博子, 野村名可男, 松村正利, 三好久美子, 玉木秀幸 環境要因変動に対する淡水底質微生物生態系の応答解析 第39回日本水環境学会年会, 千葉 (2005年3月)

Ｎｏ.3

早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書

種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）

その他 三好久美子, 大内山高広, 嶋本ひかり, 櫛笥博子, 野村名可男, 松村正利

模擬湖沼における流動シミュレーションを用いた湖沼浄化システムの有効性の検討 第39回日本水環境学会年会, 千葉 (2005年3月)

櫛笥博子, 野村名可男, 松村正利, 三好久美子, 玉木秀幸

変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(DGGE)法による淡水底質微生物生態系の環境要因変動に 対する応答解析

日本水処理生物学会第41回大会, つくば (2004年10月)

三好久美子, 大内山高広, 櫛笥博子, 松村正利 湖沼モデル系における生物膜の構築

日本水処理生物学会第41回大会, つくば (2004年10月)

＜教育業績＞

・東京有明医療大学「分子遺伝学」講義（2012年度 前学期）

・早稲田大学 理工学基礎実験1A/1B（2009～2011年度 前期・後期）

・第18回 日本時間生物学会 ポスター賞審査委員（2011年）

・第17回 日本時間生物学会 ポスター賞選考委員（2010年）

・品川女子学院高等部にて模擬講義（2009年11月11日）