早稲田大学大学院 先進理工学研究科
博 士 論 文 概 要
論 文 題 目
多細胞性シアノバクテリアにみられる 自己組織的なパターン形成の解析
Analysis of Self-Organized Pattern Formation in Multicellular Cyanobacteria
申 請 者
石原 潤一 Junichi ISHIHARA
電気・情報生命専攻 細胞分子ネットワーク研究
2015 年 4 月
多 細 胞 生 物 で は 、 分 化 し た 細 胞 が 特 定 の 比 率 で 出 現 す る だ け で な く 、 位 置 情 報 を 伴 っ て 秩 序 だ っ た 空 間 （ 形 態 ） パ タ ー ン が 形 成 さ れ る 。 生 物 の 発 生 に お け る パ タ ー ン 形 成 現 象 の 多 く は 、 初 期 条 件 に 必 ず し も 依 存 せ ず 、 外 乱 が 加 え ら れ て も 自 律 的 に 進 行 す る 。 こ の 自 己 組 織 化 の プ ロ セ ス を 理 解 す る た め は 、 初 期 条 件 に 拘 束 さ れ ず 、 内 因 性 の ノ イ ズ に も 対 応 し な が ら 生 成 す る 空 間 パ タ ー ン 現 象 を 実 験 系 と す べ き だ ろ う 。
そ こ で 、申 請 者 は 、 周 期 的 な 細 胞 分 化 パ タ ー ン を 形 成 す る 、多 細 胞 性（ 糸 状 性 ） シ ア ノ バ ク テ リ ア A n a b a e n a s p . P C C 7 1 2 0（ 以 下 、A n a b a e n a）を 実 験 系 に 選 ん だ 。
A n a b a e n a を 培 地 中 の 窒 素 化 合 物 （ 窒 素 源 ） 飢 餓 条 件 下 で 培 養 す る と 、 直 鎖 状 に 連
結 さ れ た 栄 養 細 胞 の う ち 、 十 数 細 胞 に 一 つ の 割 合 で 、 ほ ぼ 等 間 隔 に ヘ テ ロ シ ス ト と 呼 ば れ る 肥 大 化 細 胞 に 分 化 す る（ ヘ テ ロ シ ス ト 分 化 パ タ ー ン ）。申 請 者 の 所 属 す る 研 究 グ ル ー プ は 、 顕 微 鏡 下 で A n a b a e n a の 単 一 個 体 （ フ ィ ラ メ ン ト ） の 長 期 間 に わ た る 培 養 と 連 続 観 察 を 行 い 、 マ ク ロ な 形 態 変 化 の み な ら ず 、 一 細 胞 レ ベ ル で の 遺 伝 子 発 現 や 光 合 成 活 性 の 経 時 変 化 を 解 析 し て き た 。 本 研 究 で は 、 こ れ ら の 解 析 を 通 じ て 得 ら れ た 細 胞 系 譜 プ ロ フ ァ イ ル を 再 解 析 し 、 と り わ け 経 時 的 な 細 胞 分 化 頻 度 や 空 間 的 な ば ら つ き に 配 慮 し な が ら 、 ヘ テ ロ シ ス ト 分 化 パ タ ー ン を 再 現 す る 数 理 モ デ ル を 作 成 し た 。 こ の 解 析 を 通 じ 、 窒 素 源 飢 餓 条 件 の 初 期 に 観 察 さ れ る 分 化 パ タ ー ン で は 、 後 期 の 分 化 パ タ ー ン に 比 べ 、 ヘ テ ロ シ ス ト 間 の 栄 養 細 胞 数 が 有 意 に 多 く な る メ カ ニ ズ ム に つ い て 新 た な 仮 説 を 提 案 し た 。 さ ら に 、 分 化 細 胞 の 位 置 情 報 が 形 成 さ れ る 過 程 を 解 析 す る た め 、 ヘ テ ロ シ ス ト 分 化 現 象 に 初 め て ラ マ ン 散 乱 分 光 計 測 を 適 用 し 、 申 請 者 が 見 出 し た 分 化 マ ー カ ー の 発 現 を 細 胞 ご と に 計 測 す る こ と で 、 そ の 発 現 強 度 の 時 間 変 化 を 追 跡 し た 。
本 論 文 は 4 つ の 章 か ら 構 成 さ れ て い る 。 各 章 の 要 約 を 以 下 に ま と め る 。 第 1 章 で は 、 序 論 と し て 、 生 物 に み ら れ る 空 間 パ タ ー ン 形 成 が ど の よ う に 理 解 さ ら れ て き た か を 概 観 し 、 特 に 理 論 的 な ア プ ロ ー チ を 紹 介 し た 。 次 い で 、 自 己 組 織 的 な 空 間 情 報 形 成 機 構 を 解 析 す る た め に 、 多 細 胞 性 シ ア ノ バ ク テ リ ア の 分 化 パ タ ー ン 形 成 を モ デ ル に 選 ん だ 理 由 に 触 れ 、 理 論 （ 数 理 モ デ ル 構 築 ） と 実 験 （ 顕 微 鏡 観 察 系 ） を 相 互 に フ ィ ー ド バ ッ ク さ せ る 意 義 に 言 及 し た 。
第 2 章 で は 、 ヘ テ ロ シ ス ト 分 化 パ タ ー ン を 再 現 す る セ ル オ ー ト マ ト ン モ デ ル を 作 成 し 、 細 胞 系 譜 の 解 析 結 果 や 顕 微 鏡 下 で の 観 察 結 果 を 反 映 さ せ る こ と で 、 パ タ ー ン 形 成 の 進 行 に 伴 っ て 分 化 運 命 決 定 の ダ イ ナ ミ ク ス が 変 化 す る こ と を 明 ら か に し た 。 私 た ち の 数 理 モ デ ル で は 、 細 胞 が 成 熟 す る 過 程 を 「 細 胞 成 熟 度 指 数 」 と し て 導 入 し 、 こ の 値 が 大 き く な る に つ れ て 分 裂 も し く は 分 化 す る 頻 度 が 増 加 す る こ と と し た 。 さ ら に 、 ヘ テ ロ シ ス ト が 隣 接 細 胞 の 分 化 を 抑 制 す る 効 果 （ 側 方 抑 制 ） も 取 り 入 れ た 。 こ の モ デ ル に は 、 細 胞 系 譜 の 解 析 か ら 決 定 で き る パ ラ メ ー タ と 、
N o . 1
実 測 で き な い パ ラ メ ー タ が 含 ま れ る 。 後 者 を 推 定 す る た め 、 分 裂 に 伴 う 細 胞 数 の 増 加 に 対 応 し な が ら 、 新 し い ヘ テ ロ シ ス ト の 空 間 情 報 が 形 成 さ れ る ダ イ ナ ミ ク ス を 近 似 的 に 解 析 す る 数 学 的 手 法 を 考 案 し た 。 ま ず 、 細 胞 成 熟 度 指 数 の 遷 移 ダ イ ナ ミ ク ス を と り あ げ 、 こ れ が マ ル コ フ 過 程 に し た が う も の と し て 、 平 均 場 近 似 を 用 い て マ ス タ ー 方 程 式 と し て 書 き 下 し 、 頻 度 分 布 を 求 め た 。 次 に 、 細 胞 成 熟 度 指 数 の 頻 度 分 布 が 定 常 状 態 に 達 し た と き 、 ヘ テ ロ シ ス ト 間 細 胞 数 の 遷 移 ダ イ ナ ミ ク ス を 、 同 様 に マ ル コ フ 過 程 に し た が う と 仮 定 す る こ と で 、 マ ス タ ー 方 程 式 と し て 書 き 下 し た 。 こ れ ら の 線 形 マ ル コ フ 近 似 に 基 づ く 解 析 を 統 合 す る こ と で 、 解 析 的 に ヘ テ ロ シ ス ト 間 細 胞 数 の 頻 度 分 布 を 計 算 し た（ 2 段 階 マ ル コ フ 近 似 ）。 こ の 頻 度 分 布 は 、 パ ラ メ ー タ 値 の 広 い 範 囲 に お い て 、 シ ミ ュ レ ー シ ョ ン か ら 得 ら れ た 頻 度 分 布 を よ く 再 現 す る こ と が 確 か め ら れ た 。 そ こ で 、 前 述 の パ ラ メ ー タ 値 を 推 定 す る た め 、 解 析 的 に 得 ら れ た 頻 度 分 布 と 、 窒 素 源 飢 餓 条 件 後 期 に 顕 微 鏡 観 察 さ れ た ヘ テ ロ シ ス ト 間 細 胞 数 の 頻 度 分 布 を 比 較 し 、 そ の 統 計 的 距 離 （ カ ル バ ッ ク ・ ラ イ ブ ラ ー 情 報 量 ） が 最 小 と な る 値 を 探 索 し た 。 推 定 さ れ た パ ラ メ ー タ 値 の 感 度 解 析 を 行 い 、 側 方 抑 制 効 果 に 関 わ る パ ラ メ ー タ が 、 ヘ テ ロ シ ス ト 分 化 の 等 間 隔 性 に 最 も 決 定 的 で あ る こ と を 示 し た 。
さ ら に 、 申 請 者 は 、 窒 素 源 飢 餓 条 件 初 期 で ヘ テ ロ シ ス ト 分 化 頻 度 が 高 く な る メ カ ニ ズ ム を 解 析 す る た め 、 複 数 の 数 理 モ デ ル を 作 成 し て 比 較 を 行 っ た 。 ま ず 、 新 た に 観 察 ・ 解 析 し た 細 胞 系 譜 プ ロ フ ァ イ ル か ら 、 細 胞 分 裂 に 関 す る 細 胞 成 熟 度 指 数 依 存 性 は 、 窒 源 飢 餓 条 件 初 期 と 後 期 で 変 化 し な い こ と を 認 め た た め 、 モ デ ル で は 分 化 の 細 胞 成 熟 度 指 数 依 存 性 に つ い て の み 、 窒 素 源 飢 餓 条 件 初 期 と 後 期 で 変 化 さ せ た 。 先 程 と 同 様 に 、 2 段 階 マ ル コ フ 近 似 を 使 用 し て 解 析 的 に ヘ テ ロ シ ス ト 間 細 胞 数 の 頻 度 分 布 を 計 算 し 、 顕 微 鏡 観 察 さ れ た 頻 度 分 布 と 比 較 す る こ と で 、 パ ラ メ ー タ の 値 を 推 定 し た 。 そ の 結 果 、 窒 素 源 飢 餓 条 件 初 期 の パ タ ー ン で 推 定 さ れ た 値 は 、 後 期 の パ タ ー ン で 推 定 さ れ た 値 と 有 意 に 近 い こ と を 明 ら か に し た 。 し た が っ て 、 時 間 経 過 に 伴 っ て 分 化 パ タ ー ン が 自 発 的 に 変 化 す る メ カ ニ ズ ム は 、 分 化 の 細 胞 成 熟 度 指 数 依 存 性 の み の 変 化 に 帰 着 さ れ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 実 際 、 分 化 促 進 遺 伝 子 h e t R の 発 現 を 解 析 し た と こ ろ 、窒 素 源 飢 餓 条 件 初 期 で は 細 胞 の 成 熟 レ ベ ル （ 分 裂 後 の 時 間 ） に 依 存 せ ず に 発 現 す る が 、 後 期 で は 成 熟 レ ベ ル に 依 存 し て 上 昇 し た 。 こ れ は 、 数 理 モ デ ル か ら 得 ら れ た 知 見 が 現 象 論 的 に 妥 当 で あ る こ と を 強 く 示 唆 す る 。 申 請 者 は 、 窒 素 源 飢 餓 条 件 初 期 に 分 化 が 細 胞 成 熟 度 指 数 に 依 存 し な い 理 由 と し て 、 迅 速 に ヘ テ ロ シ ス ト の 数 を 増 や す こ と で 、 急 激 な 環 境 変 化 に 適 応 す る た め の 生 存 戦 略 だ と 考 察 し た 。 し か し 、 細 胞 分 化 は 個 体 に エ ネ ル ギ ー 的 な 負 荷 を 強 い る た め 、 窒 素 飢 餓 条 件 後 期 で は 生 長 に 最 適 な 頻 度 へ と 収 斂 さ れ て い く の だ ろ う 。
N o . 2
第 3 章 で は 、 分 化 細 胞 の 位 置 情 報 が 決 定 さ れ る ダ イ ナ ミ ク ス を 解 析 す る た め 、 ラ マ ン 散 乱 分 光 計 測 を 使 用 し 、 細 胞 内 で の 生 体 分 子 の 局 在 や そ の 濃 度 変 化 を 非 標 識 か つ 高 感 度 で 捉 え る こ と を 試 み た 。そ こ で 、励 起 波 長 7 8 5 n m の レ ー ザ ー を 使 用 し 、 栄 養 細 胞 と ヘ テ ロ シ ス ト か ら ラ マ ン ス ペ ク ト ル を 計 測 し た 。 得 ら れ た 特 異 的 な ラ マ ン バ ン ド を 帰 属 さ せ る た め 、 光 合 成 色 素 タ ン パ ク 質 の ラ マ ン ス ペ ク ト ル を 計 測 し 、 各 純 物 質 の 官 能 基 と 対 応 付 け た 。 特 に 、 光 化 学 系 Ⅱ で 発 現 す る フ ィ コ シ ア ニ ン タ ン パ ク 質 （ の 官 能 基 ） は 、 1 6 2 9 c m- 1の ラ マ ン バ ン ド に 帰 属 さ れ 、 ヘ テ ロ シ ス ト 分 化 す る に つ れ て 減 少 す る こ と が 分 か っ た 。 こ れ は 、 分 化 す る 過 程 で フ ィ コ ビ リ ソ ー ム タ ン パ ク 質 複 合 体 が 各 サ ブ ユ ニ ッ ト に 乖 離 さ れ る か 、 も し く は 各 サ ブ ユ ニ ッ ト が 分 解 さ れ る 現 象 を 捉 え た も の と 推 察 さ れ る 。 次 に 、 1 6 2 9 c m- 1の ラ マ ン バ ン ド を 分 化 マ ー カ ー と し て 使 用 し 、 そ の 強 度 比 を フ ィ ラ メ ン ト 画 像 に マ ッ ピ ン グ す る こ と で 、 栄 養 細 胞 と ヘ テ ロ シ ス ト を 明 確 に 識 別 で き る こ と を 確 か め た 。 そ こ で 、 ラ マ ン 散 乱 分 光 装 置 の 中 で A n a b a e n a を 長 期 間 培 養 し 、 各 細 胞 の ラ マ ン ス ペ ク ト ル を タ イ ム ラ プ ス 計 測 す る こ と で 、 分 化 運 命 決 定 の ダ イ ナ ミ ク ス を 一 細 胞 レ ベ ル で 解 析 し た 。 そ の 結 果 、 窒 素 飢 餓 条 件 後 期 に ヘ テ ロ シ ス ト 分 化 す る 細 胞 で は 、 肥 大 化 が 観 察 さ れ る 前 か ら 1 6 2 9 c m- 1 の バ ン ド 強 度 が 低 下 し 始 め る こ と が 分 か っ た 。 こ の 際 、 一 旦 バ ン ド 強 度 が 低 下 し て も 、 当 該 細 胞 が 分 裂 す れ ば 、 再 び バ ン ド 強 度 は 増 加 し た 。 こ れ は 、 分 化 し か け た 細 胞 が 分 裂 す る と 、 そ の 履 歴 を 残 さ ず 栄 養 細 胞 に 可 逆 的 に 戻 る こ と を 示 唆 す る 。さ ら に 、こ う し た 細 胞 に 替 わ っ て 、 隣 の 細 胞 が 分 化 す る 過 程 も 観 察 さ れ た 。 こ れ ら の 知 見 は 、 従 来 の 標 識 方 法 で は 検 知 さ れ に く か っ た 光 合 成 色 素 タ ン パ ク 質 の 微 量 な 変 化 量 で さ え も 、 時 間 差 な く 高 感 度 で 解 析 で き る こ と を 示 し て い る 。
第 4 章 で は 、 第 2 章 と 第 3 章 で 記 述 し た 研 究 成 果 を 総 括 し 、 自 己 組 織 的 な ヘ テ ロ シ ス ト 分 化 パ タ ー ン 形 成 の メ カ ニ ズ ム に つ い て 考 察 し た 。 ま ず 、 ヘ テ ロ シ ス ト が 最 初 期 に 分 化 す る 段 階 で は 、 分 化 は 細 胞 成 熟 度 指 数 に 依 存 せ ず に 起 こ る た め 、 一 時 的 に す べ て の 細 胞 が 分 化 で き る 状 態 に な り 、 そ の 中 か ら 確 率 的 に 分 化 細 胞 が 選 ば れ る こ と を 提 案 し た 。 そ の あ と ヘ テ ロ シ ス ト 発 現 頻 度 が 低 下 す る の は 、 分 化 運 命 決 定 が 細 胞 成 熟 度 指 数 に 依 存 す る た め と 考 え ら れ た 。 こ れ は 、 従 来 提 案 さ れ て き た 側 方 抑 制 シ ス テ ム 自 体 の 変 化 で は な く 、 そ れ に 対 す る 栄 養 細 胞 側 の 感 受 性 が 変 化 す る と し た 新 し い 提 案 で あ る 。 さ ら に 、 各 細 胞 の ラ マ ン ス ペ ク ト ル 解 析 に よ り 、 他 の 細 胞 と 協 調 し な が ら 調 節 的 に 位 置 情 報 を 決 定 す る ダ イ ナ ミ ク ス が 捉 え ら れ た 。 こ の と き 、 母 細 胞 が 感 知 し た フ ィ ラ メ ン ト 内 の 空 間 情 報 は 、 娘 細 胞 に 引 き 継 が れ な い こ と が 示 唆 さ れ た 。 こ れ は 、 分 化 が 細 胞 の 成 熟 レ ベ ル に 依 存 す る こ と を 、光 化 学 系 Ⅱ の 発 現 ダ イ ナ ミ ク ス か ら 改 め て 示 し た こ と に な る 。し た が っ て 、 私 た ち が 新 規 に 提 案 し た 数 理 モ デ ル は 、 ヘ テ ロ シ ス ト 分 化 パ タ ー ン 形 成 の ダ イ ナ ミ ク ス を よ く 反 映 し て お り 、 そ れ か ら 導 出 さ れ た 知 見 の 妥 当 性 が 推 察 さ れ る 。
N o . 3
Ｎｏ.1
早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書
氏 名 石原 潤一 印
（2015 年 4 月 現在）
種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）
論文
講演
○Jun-ichi Ishihara, Masashi Tachikawa, Hideo Iwasaki, Atsushi Mochizuki.
Mathematical Study of Pattern Formation Accompanied by Heterocyst Differentiation in Multicellular Cyanobacterium.
Journal of Theoretical Biology, 371, 2015, 9-23.
○Jun-ichi Ishihara, Masashi Tachikawa, Atsushi Mochizuki, Yasushi Sako, Hideo Iwasaki, Shin-ichi Morita.
Raman Imaging of the Diverse States of the Filamentous Cyanobacteria.
The Proceedings of SPIE, Vol. 8879, 2013, 88790V1-4.
Hironori Asai, Shunsuke Iwamori, Kentaro Kawai, Shigeki Ehira, Jun-ichi Ishihara, Kazuyuki Aihara, Shuichi Shoji, Hideo Iwasaki.
Cyanobacterial cell lineage analysis of the spatiotemporal hetR expression profile during heterocyst pattern formation in Anabaena sp. PCC 7120.
PLoS ONE, 4(10), 2009, e7371.
・国際学会（口頭発表）
Jun-ichi Ishihara, Masashi Tachikawa, Hideo Iwasaki, Atsushi Mochizuki.
Mathematical study for regular pattern of cell differentiation in multicellular cyanobacteria.
The 2013 Annual Meeting of the Society for Mathematical Biology, Arizona, USA, 2013 June, The Society for Mathematical Biology.
・国際学会（ポスター発表）
Jun-ichi Ishihara, Masashi Tachikawa, Atsushi Mochizuki, Yasushi Sako, Hideo Iwasaki, Shin-ichi Morita.
Raman imaging of the diverse states of the filamentous cyanobacteria.
The 2013 international Conference of Nano-Bio Sensing, Imaging and Spectroscopy, Jeju, Korea, 2013 February, The International Society for Optics and Photonics.
・国際学会（ポスター発表）
Risa Kajiyama, Jun-ichi Ishihara, Kentaro Kawai, Hideo Iwasaki, Shu-ichi Shoji.
Micro-channel array for long-term monitoring of multicellular filamentous cyanobacterium with controlled perfusion culture.
The 15th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences, Seattle, USA, 2011 October, The Chemical and Biological Microsystems Society.
・国際学会（ポスター発表）
Shunsuke Iwamori，Hironori Asai, Kentaro Kawai, Jun-ichi Ishihara, Shu-ichi Shoji, Hideo Iwasaki.
Cell lineage analysis on regular pattern formation in multicellular cyanobacteria under micro-environment.
International Symposium on Biological Rhythm and Photonic Bio-imaging, Sapporo, Japan, 2009 August, Department of Physiology, Hokkaido University, Graduates School of Medicine.
Ｎｏ.2
早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書
種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）
・国内学会（口頭/ポスター発表）
石原潤一，立川正志，岩崎秀雄，望月敦史
Analysis of pattern formation in multicellular cyanobacteria by Cellular Automaton model.
第46回日本発生生物学会大会，島根，2013年5月，日本発生生物学会
・国内シンポジウム（口頭発表）
石原潤一，立川正志，岩崎秀雄，望月敦史
セルオートマトンモデルによる多細胞性シアノバクテリアの形態形成原理の解明 細胞システムの動態と論理Ⅴ，埼玉，2013年3月，理化学研究所
・国内学会（口頭発表）
石原潤一，立川正志，岩崎秀雄，望月敦史
セルオートマトンモデルによる多細胞性シアノバクテリアの形態形成原理の解明 第 1 回若手理論ワークショップ，東京，2012年12月，東京大学
・国内学会（招待講演）
石原潤一，立川正志，望月敦史，盛田伸一，佐甲靖志，岩崎秀雄 多細胞性シアノバクテリアの形態形成原理の理解に向けて
バイオラマン研究会2.0，埼玉，2012年10月，バイオラマン研究会
・国内学会（口頭発表）
石原潤一，立川正志，岩崎秀雄，望月敦史
セルオートマトンモデルによる多細胞性シアノバクテリアの形態形成ダイナミクスの解 析
第 50 回日本生物物理学会年会，名古屋，2012年9月，日本生物物理学会
・国内学会（口頭発表）
石原潤一，立川正志，岩崎秀雄，望月敦史
セルオートマトンモデルによる多細胞性シアノバクテリアのパターン形成原理の解明 日本数理生物学会第 22 回大会，岡山，2012年9月，日本数理生物学会
・国内学会（口頭/ポスター発表）
石原潤一，立川正志，岩崎秀雄，望月敦史
Analysis of pattern formation in multicellular cyanobacteria by Cellular Automaton model.
第 45 回日本発生生物学会大会，神戸，2012年5月，日本発生生物学会
・国内学会（口頭発表）
石原潤一，浅井宏啓，岩森俊介，宮城康之，岩崎秀雄
タイムラプス観察に基づく多細胞性シアノバクテリアのヘテロシスト分化パターニング の解析
第71回形の科学会シンポジウム，千葉，2011年6月，形の科学会
Ｎｏ.3
早稲田大学 博士（理学） 学位申請 研究業績書
種 類 別 題名、 発表・発行掲載誌名、 発表・発行年月、 連名者（申請者含む）
・国内学会（ポスター発表）
石原潤一，岩森俊介，浅井宏啓，川合健太郎，庄子習一，岩崎秀雄
マイクロ流体デバイスを使用した多細胞性シアノバクテリアのパターン形成の観察 第42回日本発生生物学会大会，新潟，2009年5月，日本発生生物学会
・国内学会（ポスター発表）
岩森俊介，浅井宏啓，川合健太郎，石原潤一，庄子習一，岩崎秀雄 微小培養環境下における多細胞性シアノバクテリアの等間隔パターン形成
「細胞を創る」研究会1.0，大阪，2008年10月，「細胞を創る」研究会
