変 化 胞 群 経時的 免疫細 膜 下腔 膜 け 下出

5 0 6 金 沢 大学 十 全医 学 会 雑 誌 第1 0 4巻 第5 号 5 0 6 ^‑5 1 6 (i 9 9 5)

ラ ッ トの ク ^モ

膜 下 出

け

膜 下 腔

免疫細 胞

群

経 時 的 変 化

金沢大 学 医 学 部 脳神 経 外 科学 講 座 (主任^: 山 下純 宏 教授)

久 保 田 鉄 也

ク モ膜下出血 (s uba r a chn oid he rn o r rhage･ S A H) 後^に起^こる脳血管攣 縮^の原 因は充 分^には 明 ら かにさ れ ていないが, 脳

血管 攣 締^の病 因において免 疫 反 応^の果た し て^いる役 割^が注目 さ れ^{て い}る^･ 免疫 反 応^が脳^血管 攣 締^の病 態に関 与して いる か ど う か を解明する た めには, S A H 後^{の ク モ}膜 下 陛に何ら かの抗 原^が存 在^{し てい}る^のか, ク モ膜 下 腔に出 現し ている細 胞^がいか な る種 類^の免疫 反 応^に関わ っているのか, ま た その免 疫 反 応と脳血管 攣締^の間^に時 間 的な相 関 関 係^はあ^るのか, と^いう点を 明 ら か に し なければ_ならな^{い･ こ}れ らの問題を解決 する た め^に, ラッ トの実 験 的^{S A = モデル}を作 製し,S A H 後^{の ク モ}膜 下 陛にお ける免 疫 細 胞亜群^の経 時 的 変 化を解 析^した･ 1 0 8 匹のSpr agu e^‑Da wley ラッ トを 2 群^に分 け,

一方^に0^･3mlの自家血 を大 槽 内に 注入 し′ これ を S A H 群 と^した･ 他 方^には, 同量^の生理食 塩 水を注入 して これ を生食 群^{と した･ S A H} 導入 か ら1 0分 軋 1 ,

2 , 3 , 5 , 7 日後^の各 時 期にラッ ト を屠 殺し, 脳を摘 出^した･ 各 時 期毎^{に = E} 染 色を行^い, クモ膜 下 腔お よ び脳 底 動 脈^の組 織 学 的 変 化を観 察した･ ま た･ T 細 胞亜群と 主要 巌 織 適 合 性 遺 伝 子複 合 体(m ajo rhist_{o c o m}patibili_{t y} c o mple x,M H C) ク ラスⅠ 陽性 細 胞^の出現を免 疫 鼠 織 化学 染 色^によ り観 察L た^{■ フロ ー サ}イ t メ トリ ^ー を 用いて1 各 時期 如^こ抗^マ ク^ロ フ_ァ ^ー ジ抗 体お よ び T 細 胞亜群^の各 抗 体( C D 5, C D 4･C D 8) ^に一 そ れぞれ陽性^の細 胞^の出 現 率^を測 定し た^. 脳 底 動 脈の内 陸^の狭 小 化 外 膜^への

単 核 細 胞 出 現^{な どの}組 織 学 的変 化が観 察さ れ′ これら^の変 化は S A = 2 日乳 ^{3 日}後^に最 も 顕 著であっ た^. 免 疫 組 織 化 学で は, ク モ膜 下腔^における M H C ク ラス Ⅱ陽 性 細 胞^の増 加^{が S A =} l ^〜 3 日衡^こ認め ら れ, そ^の増 加ほ T 細 胞^亜群^の出 現^に先行 し て^いた･ フ ロ ^ー サイ トメト リ ^ー で はl 抗^マ ク^ロフ _ァ ^ー ジ抗 体 陽 性 細 胞^の出 現 率が, S A H 2 日後^に最 も 高 値 (1 3^.5 ±2^.5‰ 支 ±S E M) を 示 し た^･ S A H 群^における C D 4/^{C D 8 比は},S A H 2 日後^に有 意^に高値 (^{3.21 士0.8 9}) と なった^. 本実 験^の結 果は,

S A E 後^{の ク} モ膜 下 陛において, マ クロフ _ァ ^ー ジによ る抗 原情 報^の提示 と T 細 胞^によ る遅 延 型 過 敏 反 応^が起 き^ている^こと を 示 している･ これ ら^{の 一} 連^の反 応が, 脳血管攣 縮^の発 生に重要^な役 割^を果^{た して い}る 可能 性が 示唆さ れ た^.

K ey ^{w o r}ds c e r ebr al v a s o sp^{a s m} , S uba r a chn oid he m o r rhag^e, T l_ym pho cy t^{e, m a CrO}Phag^e,

c ellularim m u n lt y

脳 動 脈癌 破 裂^によ るク モ膜 下 出血(s uba r a chn oid he mo r rha^‑ ge,S A H) ^でほ, 約4 0% ^の患 者が死亡あ^るいは重 篤 な 神 経 症 状 をきたす^{1 ‑}. S A H 症 例^の予後^に影 響を及ぼす 病 態^{と し て} ,

S A H 急 性 期に起^こる頭 蓋 内圧 冗 進, 急 性水 頭 症, 脳^ヘ ル ニ ア

等^に加え て, 遅 発性 脳^血管 攣 締^が重 要^であ^{る1 ).} 遅 発 性 脳血管 攣 締^は, S A H 発 症 後 数日経 過^した時 期よ り脳 底 部 主 要 動 脈^に 攣 縮が発生し, S A H 7 ^〜1 0 日後^の時期^にそ^の攣 縮^{の ど ー ク}を 示す 現象^であ^る. そ^の結 果と L て, 攣 締 動 脈^の湾 流 域は脳 虚血 の状態^に陥り, 生 命 的 あるいは機能 的予 後^に重 要な影 響を 及 ぼ す･ 脳^血管 攣 締^の病 因^に関し て は未だ完 全に解明 され て はいな

いが, オキ^{シへ モ}グ^ロ ビ ゾ⁾

, ト^ロ ンボ キ^サゾ⁾, ロイ ^コト リ^ェ

ソ㌔ 血小 板 活 性 化 困 ヂ⁾, など, ク モ膜 下陛^の血腫 由来 もしく ほ 血腫と密接な関 係を持^つ血管収 縮 物 質^の関 与が報 告さ れ てき た^･ し か しながら, これ ら^の物 質^は, いず^れも単 独^{で は}脳血管 攣 縮^の機 転を十 分^{に は}説 明^し得 な^いものであり, 複 数^の物 質 あ るいは因 子が, 協 調 的^に働^いて脳血管 攣締^を惹 起 す^{る と}考え ら

れ ている.

一方, S A H 後^{の ク}モ膜 下 陛^にお^いて何ら かの免 疫 あ^るいは 炎 症^に関連し た反 応^が起^{こって い}る^こと が, 多 くの研 究によ り 示 さ れ^てきた^. S A H 患 者^の剖 検 例^では, ク モ膜 下 腔で の免疫 あるいほ炎 症 細 胞^の出 現⁶や, 攣 縮を 示 し た動 脈壁 ^への免 疫^グ

ロ ブ リンと補 体^{C 3 の}沈 着^"が観 察さ れ, S A H 後^の患 者^の脳 脊

髄 液 中で ほI T 細 胞 活 性 化因子^{の マ ー カ ー で}あ^{る ネオプテ リ}

ン^{8 )}や, イン タ ^{ー ロ}イ キン 6(^{inte rle u}kin^‑6,I L^‑6)^別の上昇が認め ら れ た^. ま た ト 脳血管攣 縮を 示 し た患 者の末 梢血中では, 全身 的な免疫 反応^の存 在^{を 示}す 免 疫 複 合 体が 上昇 する^こと が報 告^さ れ た^{1 D 11 い.} 以上^の事 実は, S A H 後^の脳血管 攣 縮^の発 生^に関して

免 疫 学 的反 応が何ら かの役 割を果^{た して いること を}強く^{示 して}

いる. 免 疫 反 応^は液 性 免 疫 反 応と細 胞 性 免 疫反 応^に大 別さ れ る が, 上記^の報 告で は▲ S A H 後^{の ク モ}膜 下 腔お よ び動 脈 壁^周囲 で ほ, 液 性 免 疫^と細 胞 性 免 疫^の両者^に関 連 する因子^の存 在^が報 告さ れ ていること か ら, 両 者^の相互作 用が起^こっ て いること が

平 成7 年⁶ 月^{7 日}受付^, 平 成⁷ 年⁸ 月1 1 日受 理 A b br eviation s

･^{: C D, Clu ste r of differ entiation, D A B , diami n oben zidine tetr ahyd ro chlo ride ; FI T C, fluor e s c ein} is othio cy^{a n a}te; I L, inte rle uk in; M H C, m aj^{o r histoc o m} p^atibili_{t y} co m pl_{e x ;} P B S , ph o sphate‑^{buffe r ed salin e ;} S A H , S ub a r a ch_{n o}id he m o r rhag^e

ク モ膜 下 出血 と免疫 細 胞^亜群^の変 化 _{5 0 7}

推測^{さ れ る が, S A H} 後^{の ク モ}膜 下腔に生じ る免 疫 反 応^の質 的 特 徴や その経 時 的な変 化^に関して詳 細な検 討は な さ れ ていな い■ もし, S A H 後の ク モ膜 下 腔^に抗 原^の存 在を前 提と し た免 疫 反応が惹起されるの であれ ば, 同部^に出現 する免疫 細 胞亜群

のそ れぞれ^に特 徴 的な経 時 的 変 化^が見ら れ る はずである^. ま た, 脳^血管攣 締 発 生^の磯 序^に対し ての免 疫 反 応^の責 任 的 関 与^を 検 討する た めには, S A H 後^{の ク モ}膜 下 脛で起^{こっ てい}る免 疫 反応^{につい て}, 以 下^の点^を解 明する 必要がある と考え ら れ る^. S A H 後^{の ク モ}膜 下 腔には何 らかの抗 原が出 現 する^のか, 脳血 管攣 締発 生^の時 期と免疫 反 応の時 期^には時 間 的相 関 関 係^がある のか, 免 疫 反 応^{の い}ずれ^のプ^ロセスが脳血管 攣 縮^に最 も影 響を 及ぼし う るのか, という点^につい てである. 本 研 究^{で は}l ラッ

ト を用^いて! 実験 的^{ク モ}膜 下 出血 を作 製し, ク モ膜 下腔^におけ る免疫 反 応^に特 異的な免 疫 細 胞^亜群 出現^の経 時 的 変化を, 免疫 組織 化 学 的 方法お よ びフ ロ ^ー サイ ト^メト リ ^ーの方 法を 用いて解 析^{した･ そ れ}ら^の結 果か ら, S A H 後^の脳血管 攣 締 発 生^の機 転

における 上記^の問題^につい て検 討した.

材 料お よ び方 法

Ⅰ^. 実 験 動 物

空 調飼 育 室 ( 室 温2 3 士2 ℃, 湿 度^{5 5 士5 %}) ^で飼 育して いる体 重2 0 0 ^〜4 0 0g の堆Spr agu e‑^{Da wle}y ラ ッ ト (ク レ ア , 大 阪) 1 0 8匹を用^いた･ 無 作 為^に, 5 4匹 ず^{つ の} S A H 作 製 群 (S A H 群) ^とl 対 照と して の生 食 群^の2 群^に分 けた.

Fig^･1^･ Sche matic r epr e s e nt_atio n of im pla nta tio n of the C athete rinto the ciste r n a m agn a of the r at. Arl a nim al

W a s pla c ed in a pr o n e p^{o s}iti_{o n}. T he s c alp w a s in cis ed,

a nd a s m all hole w a s m ade in the midlin e ju st r o str alto theint_{e r}pa rietalo c cipital s utu r e･ T he c athete r w a s p^{a s s e}d thr o ugh the hole, Sliding alo ng the in n e r table of o c ci_pital bo n e.

Ⅱ, ク モ膿 下 出血作製 1 ^. 実 験 準備

全 動 物1 0 8匹について^シリ^コ ンカ テ ^ー テ ルを大 槽 内^に留 置^し た^{･ ベ ン} トパ ル ビ タ ^ール (^{ダ イナポ}ッ ト, 大 阪) ^{5 0m} g/^kg の腹 腔 内注 射^によって全 身 麻 酔^を行^い, 自発 呼吸下^に以下^の処 置を 行った^･ 皮 切 部位^は十 分^に剃 毛し消毒^を行^い , 手術 器 具^ほ乾熱 滅 菌し たものを使^{用 し て}, 無 菌 的^に外 科 的 処 置^を行^った^. 図1

に示 し た ように_, 頭 皮を 正中^にて線 状 切 開し, 正中線^上の後 頭 骨と頭 頂 間骨^の縫 合線 吻側^に小孔を設 け^た. 小 孔を通じて後 頭 骨 内 側 面^に沿わ せ^{て シ} リ^{コ ン} カ テ ^ー テ ル (外 径 Im 町 内 径 0･5m m) (^{ダ ウ ･ コ ー エ ソグ}, 神 奈川) を挿^{入 し}, 先端^は大 槽 内

に位 置 する ように留 置^{し た.} 管 内の閉 塞を防止 す^る目 的^にて 3

‑ 0 ナイ^ロ ン糸をカテ ^ー テ ル管 内に封入 し, 頭 皮を縫合^{L た.}

2 ^. ク モ膜 下艇 内血液 注入 と群 分^け

大 槽 内^{に カ テ ー テル}を留 置してか ら 7 ^〜1 0 日後に, 全 動物に 対し て, 再び^{ベ ン} トパ ルビタ ^ール(^{5 0m} g/^kg) ^の腹 腔 内 投 与^によ り麻 酔を行った. 大願 動 脈^{に 2 2 G のエ}ラ^{スタ ー} 針を挿入 し て 自 家動 脈^{血 1m}l を採取した^. S A H 群で は 巨頭 部を2 0皮下 降^さ せ, 頭 皮を再 切 開し, あら か じめ留 置^{し て おい}た^カテ ^ー テ ルを 通じ て大 槽 内^に自家 動 脈血 0^.3mI を約3分 間かけ^て注入する^こ とによ り, 人 工的な S A H を作製し た. 生食 群^{で は}l 同 様^の方 法お よ び手技^にて, 自家 動 脈血^のか わ り に生理食 塩 水0^.3ml を 注^{入 し た.}

Ⅲ^. 屠殺およ び固 定

自 家血あるいほ生理食塩 水を注入 してか ら1 0分 乱 1 日乳 2 日軋 3 日後, 5 日軋 お よ び 7 日後^の各時 期^{におい て}そ れ ぞれ 9 匹ずつ屠殺し た. 各 時 期^に屠 殺 する 9 匹のうち 2 匹 は H E 染色^に, 2 匹 は免疫 組 織化 学 染 色^に, 残り^の5匹は^{フ ロ ー}

サイトメ トリ ^ー に用^いた^. 屠 殺 時^にはt ベ ン ト パ ル ビタ ^ー ル (8 0mg/^kg) 腹 腔 内投 与^の深 麻 酔 下^に, 経心臓 的に生理食 塩 水 3 0 0ml によ る全 身潅 流^を行^っ た^. 濯 流 後速や かに, 頭 蓋よ り脳 を摘 出し た^. フ^{ロ ー} サイトメ ト リ^ー の解 析^に用^いるラッ ト につ いて は∴潅流 直 前^{に 1ml の}末 梢血 を心 臓^{か ら}採取した^.

H E 染 色お よ び免疫 組織 化 学^のた めに, ク モ膜^に包ま れ た脳 底 動 脈を含 む脳幹部^を切^り出^{し た. H E} 染 色用の試 料^は, 1 0%

ホ ル ^マリン液^にて 国定し た後, パ ラ フ_ィ ンに包 理^{し た.} 免 疫鼠 織 化 学用^の脳 幹部 艇 織は末固定の状 態^{に て}凍 結 切 片 用 包^理剤 O C T ^コン パウン ド(^{Tis s u e}‑^{Tek Pr odu c t s, M ile sIn c}, E ik ha rt,

しS A) に包理 し, 直ちに液体 窒 素^に浸^{し て}凍 結^ブロ ック標 本と して ^‑8 0 ℃^にて保 存^{し た.}

Ⅳ. H E 染 色

パ ラフ ィ ンブ^ロ ッ クか ら厚^{さ 5}世n の水平 断 切 片を作 成しJ

H E 染 色^を行^い, 脳 軌 ^{ク モ}膜下陛お よ び脳 底 動 脈^の組 織 学 的 変 化を観察し た^.

V . 免疫 組 織 化 学

クリオス タッ ト C O L D T O M E C M‑^{41(サ ク ラ}精 戟, 東京) を 用い て_, 厚さ 1恥m の水平 断 切片を作 成し た^. 各 動 物の脳ブ

ロ ッ クよ り3 0枚 ず^{つ の}切 片を採 取し た^. 切 片 標 本は, ス ライ ド ガラス に載せ て乾 燥1時 間^の後^に, 室 温で ウサギ 正常血清と1 0 分 間反 応さ せ た･ 2 4枚^の切片を ^一次 抗 体^{にて 4 ℃で2 4}時 間反 応 さ せ た･

一 次 抗体 とし て 用^いたモ ノ ク^{ロ ー}ナ ル抗 体^は, 抗^ラッ

ト C D 3 ^マウス抗 体 (I F 4) (^{1:1 0 0}) ( 生 化学工業, 東 京), 抗^ラッ

ト C D 4 ^マ ウス抗 体( W 3/^{2 5}) (1 :8 0 0 0) (C hemi c ｡hInte r n ati｡ n^̲ al･C A･ U S A), 抗^ラッ ト C D 8 ^マウス抗 体 (^{R l‑1 0 B 5}) (1:1 0 0)