博士（医学）田中伸哉 学位論文題名
Both the SH2 and SH3 Domains of Human CRK Protein Are Required for Neuronal Differentiation of PC12 Cells
（ ヒ 卜CRK蛋 白 質 に よ る 神 経 細胞 分 化 誘導 と 細胞 内 情 報伝 達 系 の解 析 ）
学位論文内容の要旨
序論：
細胞は、増殖因子やサイトカインによる刺激を細胞膜表面にある受容体で受けとり、
そのシグナルを核ヘ伝えることによって増殖、分化、その他の様々な応答を引き起こ すが、その際にチロシンキナーゼが重要な役割を担っている。近年、活性化された受 容体型チ口シンキナーゼまたは受容体と結合したチ口シンキナーゼの下流でSH2／ SH3と呼ばれる領域を有する蛋白群がシグナルを伝達することが明らかにされてい る 。SH2／SH3領 域 は、 チ 口 シン キ ナ― ゼ 型 癌遺 伝 子で あ るsrcと 相 同 性の あ る領域として同定され（src homology: SH)、その後ホスホリパーゼCーア（PLCア）、
GTPase活性イヒ蛋白（GAP）、ホスファチジルイノシトール3キナーゼ（PI―3K） などシグナル伝達にとって重要な酵素に存在することが示されている。SH2領域は りン酸化チ口シン残基を特異的に認識し結合することが明らかにされているが、SH 3領域はプ口リンリッチな配列に結合することが示唆されているものの、その機能は 未だに不明な点が多い。
我々は、SH2／SH3領域を 介する細 胞内シグ ナル伝達機 構を解明 するために、
構 造 の 大 部分 がSH2／SH3領 域の み から 成 り 立っCRK蛋白 に っ いて 研 究 を進 め てきたが、今回、CRK蛋白が神経細胞の分化を誘導することを見いだした。そして、
このCRKの分 化誘導の 系を詳し く解析す ることによ ってCRK蛋白 が、細胞内情報 伝達機構の中でアダプタ一分子として機能することを明らかにし、さらに、CRKの SH3領 域 の 標 的 と な る 分 子 を 同 定 す る 事 が で き た の で 報 告 す る 。 研究方法及び結果：
1）CRKタンパク質による神経細胞の分化誘導
ヒトCRKを 大腸 菌 で発 現さ せ精製し た後、ラ ットの末 梢神経腫瘍 細胞株PC12細
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胞の細胞質にImg ／ml の濃度で微量注入したところ、
16時間後から神経突起の 伸張がみられた。PC12 の突起伸張は約72 時間継続し、分化した細胞は10 日以 上生存し続けた。細胞内のCRK タンパク質の存在は、抗CRK 抗体による免疫染色 で確認した。
2)
抗
SH2抗体によるCRK 媒介細胞内情報伝達の抑制
SH2
領 域 は 、 細 胞 内 で り ン 酸 化 テ ロ シ ン と 特 異 的 に 結 合 す る こ と が 証 明 さ れ て い る が 、 我 々 は 、
SH2領 域 が 情 報 伝 達 に 必 要 で あ る こ と を 、
in vivoで 証 明 す る た め に 抗
SH2抗 体 と
CRKと を 同 時 に
PC 12細 胞 に 微 量 注 入 し た 。
2種 類 の 抗
SH2抗 体 の う ち
in vitroで り ン 酸 化 チ ロ シ ン と の 結 合 を 抑 制 す る
AD2は 、
CRKに よ る 神 経 突 起 伸 張 を 抑 制 し た 。 ま た 、
SH2領 域 が 、 必 須 で あ る こ と は 、
SH2領 域 の 中 で 高 度 に 保 存 さ れ た
1ア ミ ノ 酸 を 置 換 し た
CRK変 異 体 に よ っ て
PC12細 胞 が 分 化 誘 導 さ れ な い こ と か ら も 確 認 さ れ た 。
3)過 剰 量 の
SH3分 子 に よ る
CRK媒 介 細 胞 内 情 報 伝 達 の 抑 制 我 々 は 、
SH3領 域 も
SH2領 域 と 同 様 に 何 ら か の 分 子 間 結 合 に 関 与 し て い る 可 ー 能 性 を 検 討 し た 。 細 胞 内 に
SH3領 域 の 標 的 と な る 分 子 が 一 定 量 存 在 す る 場 合 、
CRK分 子 の 作 用 を 過 剰 量 の
SH3分 子 が 競 合 的 に 阻 害 す る と 考 え て 、
SH3分 子 を
CRKタ ン パ ク 質 と 同 時 に
PC 12細 胞 に 微 量 注 入 し た 。 そ の 結 果 、
SH3分 子 と
CRK分 子 と の モ ル 比 が
7以 上 の 時 に 、
CRKに よ る 神 経 分 化 は 阻 害 さ れ 、 そ の 程 度 は モ ル 比 に 依 存 性 で あ っ た 。 さ ら に 、
srcの
SH3、
PLC7の
SH 3、
PIー
3Kの
SH3分 子 を 用 い て 同 様 の 競 合 阻 害 実 験 を 行 っ た が 、 各
SH3分 子 ／
CRKの モ ル 比 が
7以 上 で あ っ て も 、 阻 害 効 果 は 認 め ぬ か っ た 。 こ の こ と か ら 、
PC12細 胞 内 に は
CRKの
SH3領 域 に 特異的に結合する分子が存在することが示唆された。
4
）
CRKのSH3 変異体による神経細胞の分化誘導
CRK
の
SH3領 域 の 中 で 、 情 報 伝 達 に 必 須 な 部 位 を 同 定 す る た め に
SH3領 域 の ア ミ ノ 酸 を
1ま た は
3個 置 換 し た
CRK変 異 体 を 、
PC 12細 胞 に 微 量 注 入 し た 。 各 分 子 の
SH3領 域 に 高 度 に 保 存 さ れ た ア ミノ酸を置換したCRK 変異体である
K150、TQ 、L169 は神
経 分 化 誘 導 能 を 消 失 し た が 、 あ ま り 保 存 され て いな い アミ ノ 酸 を置 換 し た 変 異 体 で あ る
ovo、
TTは 依 然 と し て 情 報 伝 達 能 を 保 持 し て い た。
5
） ウ エ ス ト ウ エ ス タ ン 法 に よ る
CRKの
SH3領 域 結 合 タ ン パ ク 質
の検出
CRK − SH3 の細 胞 内 標 的 分 子が タンパ ク質 である 可能性 を検討 す る た め に 、 PC12 細 胞 か ら の 抽 出 タ ン パ ク 質 を SDS 一 PAGE で 分離し、フィルターに転写した後、膜上で SH3 分子との結合を試み た 。 そ の 結 果 、 野 生 型 の CRK の SH3 ま た は ovo 、 TT の SH3 で は 、 約 118 、 125 、 136kDa の 分 子 量 の バ ン ド が 検 出 さ れ た。また、これらのタンパク質は細胞分画法により、細胞質に存在し、
ていることが示された。しかし、情報伝達能を消失している K150.
TQ 、L169 のSH3 領域やsrc 、PLC ア、PI −3K のSH
3 領域を用いた場合には、上記のバンドは検出されなかった。以上よ り 、 CRK の SH3 が 3 っの 分 子 量 の タン パ ク 質 と 結合 す る こ と と 、 情 報 伝 達 能 を 保 持 す る こ と と の 間 に 相 関 が み ら れ た 。 6 ）抗Ras 抗体によるCRK 媒介情報伝達の抑制
神 経 成 長 因 子 （ NGF ） に よ る PC12 細 胞 の 分 化 誘 導 に は Ras タ ンパク質の活性化が必要であることが証明されている。我々は、CR K タ ン パ ク 質 が PC12 の 分 化 を 誘 導 す る 場 合 に も、 Ras の 活 性 化 が必須であるか否かを検討した。はじめに、我々が準備した抗Ras 抗 体が PC12 細胞 にた いする NGF の作 用を抑 制す ることを確認し た 後、こ の抗体 を CRK と 同時に PC12 細 胞に微 量注 入したところ、
CRK による 神経分 化誘導は抑制された。尚、この抗 Ras 抗体は陽 性 コ ン ト 口 一 ル と し て vRas に よ る PC12 細 胞 の分 化 誘 導 を 阻 害 することを確認している。以上より、 CRK の作用点は、細胞内情報 伝 達 系 の 中 で Ras の 上 流 に 位 置 し て い る と 考 え ら れ た 。 考察：
CRK は 大 部 分 が SH2 ／ SH3 領 域か ら 成 り 立 って お り 、 酵 素 活 性部位をもたないが、神経細胞に対して分化誘導能をもっことが明ら かに さ れ 、 こ の CRK の 情 報 伝 達能 に t ま SH2 ／ SH3 領 域 の 2 っ の 領域が必要であることが示された。´さらに、CRK は、チ口シンキナ ーゼからRas 蛋白へのシグナルの流れをっなぐアダプタ一分子とし て作用することが明らかにされた。
細胞内で CRK は自己リン酸化されたチロシンキナーゼ型の増殖因 子受容 体に SH2 領 域を介して結合し、また、SH3 領域を介して細 胞質内の標的タンパク質と結合することによって、CRK を介する細 胞内情報伝達分子複合体を形成する。この、細胞膜近傍に形成された 複合体によって、 Ras タンパク質が活性化された後、情報が核に伝 達され PC12 細胞の場合は分化誘導という表現形に至ると考えられ る。
一179 一
我 々 は 本 論 文 の 実 験 で 、
CRKの
SH3領 域 に 結 合 す る 分 子 量 約
1 30kDa前 後 の
3つ の 蛋 白 を 同 定 し た が 、 最 近 、 同 様 の 方 法 を 用 い て
SH3結 合 蛋 白 の
cDNAの ク ロ ー ニ ン グ を 行 ／ っ た 。 単 離 さ れ た 遺 伝 子 は 分 子 量
131kDaの 蛋 白 を コ ー ド し て お り 、
C末 端 に
Ras蛋 白 の 活 性 化 因 子 で あ る
GRF（
Guanine nucleotide releaseing factor） と の 相 同 領 域 を 有 し て い た た め
C3G（
CRK SH3 domain binding GRF）と名づけた（TANAKA ，S ．et al. ，Proc. Natl. Acad ．Sci.
USA
． 1994 ， in press) 。 結語：
本 論 文 の 結 果 と
C3G分 子 の ク 口 ー ニ ン グ によ り 、 細 胞 内 で の 、 受 容 体 ／ チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ →
CR，
K→
C3G→
Ras蛋 白 → 核 と い う シ グナル伝達機構が明らかにされた。
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学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
Both the SH2 and SH3 Domains of Human CRK Protein Are Required for Neuronal Differentiation of PC12 Cells
（ヒ卜CRK 蛋白質による神経細胞分化誘導と細胞内情報伝達系の解析）
目的：
細胞は、増殖因子やサイトカインによる刺激を細胞膜表面にある受容体で受 けとり、そのシグナルを核へ伝えろことによって増殖、分化、その他の様々な応 答を引き起こすが、その際にチロシンキナーゼが重要な役割を担っている。近年、
活性化され た受容体型 チロ，シン キナーゼの 下流でSH2 ／SH3 と呼ばれる領域 を有 す る蛋白群 がシグナル を伝達する ことが明ら かにされて いる。SH2 ／
SH 3領域は、癌遺伝子
srcと相同性のある領域として同定され（src homology: SH‑
）、その後、シグナル伝達にとって重要な酵素群に存在することが示されている。
SH2
領域は りン酸化チ ロシン残基を特異的に認識し結合することが明らかにさ れているが 、SH3 領域 はプロリンリッチな配列に結合することが示唆されてい るも の の、 そ の機 能 は未 だ に不 明 な点 が多 い。SH2 ／
SH3領域を 介する細胞 内シ グ ナル 伝 達機 構 を解 明 する た めに 、構 造の大部分 が
SH2／
SH3領域のみ から成り立つCRK 蛋白について研究を行った。
方法と結果：
（
1） ヒ ト
CRK蛋 白 を 、 末 梢 神 経腫 瘍
PC12細胞 の 細胞 質 に微 量 注入 レ た ところ、神経突起の伸張がみられた。細胞内のCRK 夕ンノくク質の存在は、抗C
RK抗 体に よ る免 疫 染色 で 確認 レ た 。（
2）
SH2領域が 情報伝達に 必要である こ と を 、
in vivoで 証 明 す る た め に 抗
SH2抗 体 を
CRKと を 同 時 に
PC12細 胞 に微量注入した。面
¥ritroでりン酸化チロシンとの結合を抑制する抗
SH2抗体は、
CRK
による 神経突起伸 張を抑制し た。また、
SH2領域が、必須であることは、
SH2
領域 の 中で 高 度に 保 存 され た
1ア ミ ノ酸 を 置換 レ たCRK 変異 体 によ って
PC12紐
I胞 が分 化 誘導 さ れな い こと か らも離 言忍された 。
(3）
SH3領 域が分 子間結合に 関与する可 能性を検討した。細胞内に
SH3領域の標的となる分子が 一 定 量 存 在 す る 場 合 、
CRK分 子 の 作 用 を 過 剰 量 の
SH3分 子 が 競 合 的 に
郎 暹 明 和
光 嶋 巻 沼 長 葛 柿 授 授 授 教 教 教 査
． 査
査
主 副
副
阻 害 す る と 考 え て 、 SH3分 子 を CRK夕 ン パ ク 質 と 同 時 に PC12細 胞 に 微 量 注 入 し た 。 そ の 結 果 、SH3分 子 と CRK分 子 と の モ ル 比 が 7以 上 の 時 に 、 CR Kに よ る 神 経 分 化 は 阻 害 さ れ 、 そ の 程 度 は モ ル 比 に 依 存 性 で あ っ た 。 さ ら に 、 他 の 酵 素 のSH3領 域 を 用 い て 同 様 の 競 合 阻 害 実 験 を 行 っ た が 、 各SH3分 子 ／ CRKの モ ル 比 が 7以 上 で あ っ て も 、 阻 害 効 果 は 認 め な か っ た 。 こ の こ と か ら 、 PC12細 胞 内 に は CRKの SH3領 域 に 特 異 的 に 結 合 す る 分 子 が 存 在 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。 （4） CRKの SH3領 域 の ア ミ ノ 酸 を 1ま た は 3個 置 換 し たC RK変 異 体 を 、 PC12細 胞 に 微 量 注 入 し た 。 各 分 子 の SH3領 域 に 高 度 に 保 存 さ れ た ア ミ ノ 酸 を 置 換 し たCRK変 異 体 は 神 経 分 化 誘 導 能 を 消 失 し た が 、 あ ま り 保 存 さ れ て い な い ア ミ ノ 酸 を 置 換 レ た 変 異 体 は 依 然 と し て 情 報 伝 達 能 を 保 持 し て い た 。 （5） CRKのSH3の 細 胞 内 標 的 分 子 が タ ン パ ク 質 で あ る 可 能 性 を 検 討 す る た め に 、PC12細 胞 か ら の 抽 出 夕 ン パ ク 質 を フ ィ ル タ ー に 転 写 レ た 後 、 膜 上でSH3分子との結合を試みたところ、約118、125、13 6kDaの分
子 量 の バ ン ド が 検 出 さ れ た 。 ま た 、 こ れ ら の タ ン パ ク 質 は 細 胞 分 画 法 に よ り 、 細 胞 質 に 存 在 し て い る こ と が 示 さ れ た 。 （6） CRK夕 ン パ ク 質 が PC12の 分 化 を 誘 導 す る 場 合 に も 、Rasの 活 性 化 が 必 須 で あ る か 否 か を 検 討 し た 。 抗 Ras 抗 体 を CRKと 同 時 に PC12細 胞 に 微 量 注 入 し た と こ ろ 、 CRKに よ ろ 神 経 分 化 誘 導 は 抑 制 さ れ た 。CRKの 作 用 点 は 、 細 胞 内 情 報f云 達 系 の 中 でRasの 上 流 に 位 置 し て い る と 考 え ら れ た 。 （ ：7） CRKの SH3結 合 蛋 白 のcDNAの ク ロ 一 二 ン グ を 行 っ た 。 単 離 さ れ た 遺 伝 子 は 分 子 量 131kDaの 蛋 白 を コ ー ド し て お り 、C末 端 にRas蛋 白 の 活 性 化 因 子 で あ るGRF（ ：G旧ninenucIeotidcreIeasein堊 Atctor1と の 相 同 領 域 を 有 し てL、 た た めC3G（ 、CRKSH3domainbindingGRFノ と 名づけた（TANAKA，S．ctal．，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1994，in5ress）。以上の結果 よ り 、 細 胞 内 で の 、 受 容 体 ／ チ 口 シ ン キ ナ ー ゼ →CRK→ C3G→ Ras蛋 白 一 X→核というシグナル伝達機構が明らかにされた。
口 頭 発 表 に あ た り 、 癌 研 分 子 遺 伝 葛 巻 教 授 よ り 、 ア ダ プ 夕 一 分 子CRK、G RB2と レ セ プ タ ー の 結 合 の 特 異 性 、SH3領 域 と 為 ‖ 胞 骨 格 の 結 合 に つ い て 、 免 研 細 菌 感 染f市 沼 教 授 よ り 、SH3領 域 と プ 口 リ ン リ ッ チ 配 列 と の 結 合 に つ い て の 質 問 が な さ れ た が 、 申 請 者 は 概 ね 適 切 な 回 答 を 行 っ た 。 ま た 、 副 査 の 葛 巻 、fm沼 両教授には個別の審査を受け合格と判定された。
以 上 、 本 研 究 はCRK蛋 白 が チ 口 シ ン キ ナ ー ゼ の 下 流 で ア ダ プ タ ー 分 子 と し て 機 能 しC3Gを 介 し てRas蛋 白を 活 ． 『！1イ ヒす る こ とを 明 ら かに し た も ので あ り 、 チロシンキナーゼを介する翁‖胞内 f．1，報f云述饑＋障の觧Iリjに人きく頁献したものであ る 。 よ っ て 、 噂 士 t、 医 学 ， の 学 位 授 与 に 充 分 値 す る も の と 判 冫 ピ さ れ た 。
