博 士 （ 獣 医 学 ） 渡 邉 真 治
学 位論 文題 名
Functional and Structural Analysis of Pseudorabies Virus Early ProteinO
（ オー エス キー 病ウ イル ス初期 蛋白 質Oの機 能と 構造の解析）
学位論文内容の要旨
オ ー エ ス キ ー 病 ウ イ ル ス(PRV)の 初 期 蛋 白 質0(EPO)は 、 単 純 ヘ ル ベ ス ウ イ ルス1 (HSV‑1)の 前 初 期 蛋白 質ICPOと、 アミ ノ酸 配列 の一 部に 相 同性をもつ蛋白質として報告された。他のアルファヘルベスウイルスでは、
水痘 ・帯 状疱 疹ウ イル スの 前初 期蛋 白質ORF61、ウ シヘ ルペ スウ イル ス1 の 初 期 蛋白 質BICPOお よ び ウ マ ヘル ベス ウイル ス1の初 期蛋 白質EICPOが ICPO相同 蛋白 質として知られている。これらはいずれも転写調節に関与し ている。しかし、EPOの機能についてはこれまで詳細に検討されていない。
本研究では、EPOのウイルス遺伝子に対する転写調節作用とその機能ドメイ ン お よ び EPO遺 伝 子 の 発 現 調 節 機 構 に つ い て 検 討 し た 。 EPOの機 能を 解析 する ため にEPO発現 プラ スミドを構築した。まず、EPO の細胞内局在について間接螢光抗体法で検討した。EPOは、プラスミドを導 入した細胞において、PRV感染細胞におけると同様、核に局在した。次に、
EPOのPRVの 前 初 期(IE)、 初 期 チ ミ ジ ン キ ナ ー ゼ(TK)お よ び 後 期 糖 蛋 白質X (gX)遺 伝子 プ口 モー ター に対 する 転写調 節作 用を ク口 ラム フェ ニ コ ー ル アセ チ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ーゼ(CAT)アッ セイ によ り検 討し た。 そ の 結 果 、EPOは 、HSV1のICPOと 同様 、各 遺伝子 プ口 モー ター から の転 写 を活性化することが明らかになった。また、前初期蛋白質IE180との共同作 用に よっ て、TKお よびgX遺 伝子 プ口 モー ターに 対す る転 写活 性化 作用 が 増強 され た。 さらに 、EPOが 精製 ウイ ルス 粒子中に存在することならびに EPO発 現 プ ラ ス ミ ド とPRVゲ ノ ムDNAを細 胞に共 導入 する こと によ り、 ウ イルスの複製が増強されることが明らかになった。
EPO分子 上の 転写調節ドメインを決定するために、種々の欠失EPO遺伝子 を作 出し 、各 々の 遺伝 子か ら発 現さ れる 変異体 のIEおよ びTK遺伝 子プ 口 モー ター に対 する転 写調 節作 用をCATアッ セイにより検討した。アミノ末 ―990−
端 側か らRINGflngerドメインを含む領域を欠失させた変異体は、いずれの プ口モーターに対しても転写活性化作用を示さなかった。一方、410アミノ 酸 残 基か らな るEPOのカ ルボ キシ ル末 端側 から167ア ミノ 酸残 基を 欠失 さ せた変異体は、両遺伝子プロモ一夕ーに対して転写活性化作用を示したが、
さらに130アミノ酸残基を欠失させた変異体はその作用を示さなかった。こ の 領域 は酸 性ア ミノ 酸を 多く 含ん でお り、 この酸性領域がEPOの転写活性 化作用に関与するものと推定される。以上の結果から、EPOの転写活性化作 用 には 、RINGflngerドメインを含むアミノ末端側の84アミノ酸残基および ア ミ ノ酸114か ら243番目 まで の酸 性領 域が 必要 であ るこ とが 明ら かに な っ た 。 ま た 、RINGfngerドメ イ ン を含 む1から113番 目ま での アミ ノ酸 残 基からなる変異体は両遺伝子プ□モーターからの転写を抑制し、EPOと共存 し た場 合に はEPOの 転写活 性化 作用 を打 ち消 す性質を示した。さらに、こ の 変 異 体 を 発 現 す る 細 胞 株 はPRV感 染 に 対 し て 抵 抗 性 を 示 し た 。 EPO遺伝 子の 発現機構を解析するために、EPO遺伝子の上流領域のプ口モ 一 夕 ー活 性をCATア ッセ イに より 検討 した 。翻 訳開始 コド ンか ら213bp上 流の領域はプロモーター活性を有し、IE180によってこのプ口モ一夕ーから の 転写 が増 強さ れることが明らかになった。この領域はTATA配列を欠いて い るが 、シ ス調 節配列としてイニシエーター配列、IE180およびSpl結合部 位が存在する。シス調節配列の変異体を解析した結果、このプロモーターか ら の 基本 転写 およ びIE180に よる その 活性 化に はSpl結合 部位 が重 要で あ ることが明らかになった。
以上 の成 績か ら、EPOは 、1）PRVの前 初期 、初期および後期遺伝子プ□
モーターを活性化する、2） IE180との共同作用により初期および後期遺伝 子 プ ロモ 一夕 ーに 対する 作用 を増 強す る、3） PRVゲ ノムDNAから のウ イ ル スの 複製 を増 強す る、4） PRV粒 子中 に存 在する、そして5）EPO分子上 のRINGf]mgerド メイ ンを 含む アミ ノ末 端側 の領域（1から84番目）および 酸 性 ア ミ ノ 酸 を 含 む114から243番目 まで の領 域がEPOの 転写 活性 化作 用 に 必 要で ある こと ならび にEPO遺 伝子 プ口 モー ターはIE180に よっ て活 性 化されることが明らかになった。
学位論文審査の要旨 主 査 教授 喜田 宏 副 査 教授 桑原幹典 副 査 教授 小沼 操 副査 助教授 小野悦郎
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学位論文題名
Functional and Structural Analysis of Pseudorabies Virus Early ProteinO
（オーエスキー病ウイルス初期蛋白質Oの機能と構造の解析）
オーエスキ ー病ウイル ス(PRV)の初 期蛋白質0(EPO)は、 単純ヘルベスウイ ルス1 (HSV‑1）の転写活性化因子である前初期蛋白質ICPOの相同蛋白質として 報告された。しかし、EPOの機能については不明であった。本研究では、EPOのウ イルス遺伝子に対する転写調節作用とその機能ドメインおよびEPO遺伝子の発現 機構について検討した。
ま ず、EPOのPRV遺 伝子の プ口モ一夕 一に対する 転写調節作 用をク口ラ ム フェニコールアセチルトランスフウラーゼ(CAT)アッセイにより検討した。そ の結果、EPOは、HSV‑1のICPOと同様、用いた遺伝子のプ□モー夕一からの転写 を活性化することが明らかになった。また、前初期蛋白質IE180との共同作用によ って転写活性化作用が増強された。さらに、EPOが精製ウイルス粒子中に存在する ことならびにEPO発現プラスミドとPRVゲノムDNAを細胞に共導入することによ り 、 ウ イ ル ス の 複 製 が 増 強 さ れ る こ と が 明 ら か に な っ た 。 次に、EPO分子上の転写調節ドメインをCATアッセイにより解析した。その結 果、EPOの転写活性化作用には、RING fingerドメインを含むアミノ末端側の84ア ミノ酸残基およびアミ丿酸114から243番目までの酸性領域が必要であることが明 らかになった。
さらに、EPO遺伝子の発現機構を解析するために、EPO遺伝子の上流領域のプ口 モ一夕一活性をCATアッセイにより検討した。翻訳開始コドンから213塩基対上 流の領域はプ口モ一夕一活性を有し、IE180によってこのプ口モ一夕ーからの転写 が増強されることが明らかになった。
以上の成果から、オ一工スキー病ウイルス初期蛋白質EPOの機能とその分子上の ドメインが明らかになった。これらの知見は、真核細胞におけるウイルス遺伝子の
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発現調節機構を理解する上で重要な情報を提供するものである。よって審査員一同 は渡辺真治氏が博士 （獣医学）の学位を受ける資格を有するものと認めた。
