博 士 （ 獣 医 学 ） ア ー ロ ン シ マ ニ ェ ン グ ェ ム ウ イ ネ
学位論文題名
Development o 研agno 妬cMethodsforBOuneHerpeSuruslInfeCtion
（ウ シ ヘル ベス ウイルス1感染症の 診断法の 開発）
学位論文内容の要旨
あ る 特定の 疾病を予 防制圧す るための 計画を策定 するには 、それに 先立って まず 多 数の 動物 の集団に 発生する 疾病の疫 学とその制 圧対策の 問題点を 広く調査 、検討 す る必 要が ある。そ こで、ザ ンビアに おける家畜 のウイル ス病の分 布とその 制圧対 策 の現 状な らびに極 くわずか ながらこ れまでに行 われた研 究につい て収集で きる情 報 全て をレ ビューし た。調査 の結果、 次のことが 明かにな った。ザ ンビアで は□蹄 疫 が現 在 も なお 牛 産業 に 深 刻な 被 害 をもたらし ており、 これまで5血清到の ウイ少 ス が分 離さ れている 。他の届 出伝染痛 としては、 狂犬病、 リフトバ レー熟、 ラムピ イスキン病、アフリカ馬疫、ブJレータング、アフリカ豚コレラ、ニューカッス，レ病、
マ レッ ク病 、鶏痘お よび伝染 性フアブ リキウス嚢 病が発生 している 。これら の疾病 は その 正確 な発生頻 度はわか らないが 、全国に蔓 延してい る。さら に、今後 、ウイ ル ス病 の疫 学調査を より広範 に、正確 にそして迅 速に実施 する必要 がある。 そのた め に、 簡便 、高感度 でかつ特 異的な診 断法を開発 すること が必須の 課題であ ると結 論された。
上 述 の 調査 に よ って 、 ザン ビ ァ では ウ シヘ ル ベ スウ イ ルス1（BHV‑1）感 染症が 最 も発 生頻 度が高く 、牛産業 に深刻な 被害をもた らしてい ることが 判明した 。BHV‑
1は借伏 感染をし て、スト レスによ って再活 性化され ることを繰り返して、ウシ集団 内 に存 続す るため、 根絶する ことが困 難である。 以上の観 点から、 著者はBHV，1抗 原 と抗BHV‑1抗 体 を 非常 に 高い 感 度 で、特 異的に検出 する方法 、Immuno‑PCRを確立 し た。 こ の 試験 法 は、Sanoら （1992)の 方法 に 基づ ぃ て おり 、ELISA系の ウイ彫ス 抗 原に 対 す る単 ク ロー ン 抗 体の 特 異 性とPCRの感度 を組み合 わせたも のである 。彼
らの方法におけるストレプトアビジン・プロテインA キメラのかわりにビオチン標識 抗動物種抗体を門，
Jい、これにストレプトアビジンを反応させ、ビオチン標識DNA を インジケーターとして抗原を検出する。BHV‑1 感染培養糸nl 胞上清巾の抗原検出感度 は
Immu no‑PCR/Agが
MDBK細 胞 を 用 い た プ ラ ー ク 形 成 試験 の
103.7倍 、
ELISAの
10 7.0倍 そ し て
PCRの
l06.9倍 で あ っ た 。 こ の
Immuno‑PCR変 法 を 抗
BHV‑1免疫ウサギ血清の抗体検出に応用した
(Immuno‑PCR/Ab)ところ、抗体の検出感度は
ELISAの10 コ．0 倍であった。次に
BHV・1 に実！馳感染させたウシの鼻汁中のウイJ レ ス抗原をImmuno‑PCR/Ag によって検uj することを試みた。その結果、鼻汁中の抗原 およぴ.mIf か11 の抗体は、試験j 明I 瑚を通じて検出された。感染後21 日目の鼻汁は、
感染価測定 では陰性で あったが、
Immuno‑PCR/Agによれば 、
1：l04 希釈ま で
Iン イルス抗原1 鋤性であった。この成紺はホ法が高い感度と特典性を兼ね備えた試験法で あることを示すものである。このようにImmuno‑ PCR は現在用いられているどの抗原 または抗体検
tlj法よりも感度が高いので、BHV‑1 感染症の診断に利用できるものと 結論された。
僣伏感染は特にその診断が匪I 難である。BHV‑1 の自然宿主における僣伏感染に
1調 してさらに情報を得るため、実験感染牛の鼻汁と諦臓器について、ウイルス分離、
PCR
およ ぴ
Immuno‑PCR/Ag法 を′
Hい てしらべた 。野汁
Iljのウイルス 価が
104.3 TCID50か それ以上のサンブルでは、
PCRによってウイルスDNA が検出された。鼻汁
中のウイル ス抗原は、
Immuno‑PCR/Agによれば 、感染後の検査最終日である
19口
目まで陽性 であった。
PCR法によ って、感染 後
22日日のすべてのウシの三叉神経
節、卵巣、肺、鼻腔と気管の粘膜、牌臓、前府甲骨と鼠径リンバ節および末梢白IrIL
球にBHV‑1 DNA が検たu された。一方、これらのウシの骨格筋からはウイルスDNA が
検出されなかった。どの臓器からも感染性ウイルスは回収されなかった。こ．れらの
成績は
BHV‑1の僣伏感染に自血球が重要な役割を演じている可能性を示唆している。
学 位 論 文 審 査 の 要旨 主 査 教 授 喜 田 宏 副 査 教 授 小 沼 操 副 査 教 授 高 島 郁 夫 副 査 助 教 授 岡 崎 克則
学 位 論 文 題 名
Development o 研agnosIdcMethodsforB 而neHe 叩e 漸ms11 血c ぬ （ ウ シ ヘ ル ペ ス ウ イ ル ス 1 感 染 症 の 診 断 法の 開 発）
ザ ン ビ ア に お け る 家 畜 の ウ イ ル ス 病 の 分 布 と そ の 制 圧 対 策 の 現 状 に つ い て 調 査 し た 結 果 、 ウ シ ヘ ル ベ ス ウ イ ル ス1（BHV‑1)感 染 症 、 口 蹄 疫 、 狂 犬 病 、 リ フ ト バ レ ー 熱 、 ラ ム ピ イ ス キ ン 病 、 ア フ リ カ 馬 疫 、 ブ ル ー タ ン グ 、 ア フ1Jカ 豚 コ レ ラ 、 ニ ュ ー カ ッ スル 病、
マ レ ッ ク 病 、 鶏 痘 お よ ぴ 伝 染 性 フ ア ブ リ キ ウ ス 嚢 病 が 全 国 に 蔓 延 し て い る こ と が 判 明 し た 。 ウ イ ル ス 病 の 疫 学 調 査 を よ り 広 範 に 、 正 確 に 実 施 す る 必 要 が あ り 、 そ の た め に 、 簡 便 、 高 感 度 で か つ 特 異 的 な 診 断 法 を 開 発 す る こ と が 必 須 の 課 題 で あ る と 結 論 さ れ た 。 上 述 の 調 査 に よ っ て 、 ザ ン ビ ア で はBHV‑1感 染 症 の 発 生 頻 度 が 高 く 、 被 害 が 大 き い こ と が 判 明 し た 。BHV‑1は 潜 伏 感 染 と 再 活 性 化 を 繰 り 返 し て 、 ウ シ 集 団 内 に 存 続 す る 。 し た が っ て 、BHV‑1の 潜 伏 感 染 を 検 出 で き る 診 断 法 を 確 立 す る 必 要 が あ る 。 申 請 者 は BHV‑1抗 原 と 抗BHV‑1抗 体 を 高 感 度 で 、 特 異 的 に 検 出 す る 方 法 と し て 、Immuno‑PCR 法 を 確 立 し た 。 本 法 に よ るBHV‑1抗 原 の 検 出 感 度 はELISAのl07．0倍 で あ っ た 。 ま た 抗 体 の 検 出 感 度 はELISAのl05．o倍 で あ っ た 。BHV‑1に 実 験 感 染 さ せ た ウ シ の 鼻 汁 お よ び 血 清 中 の 抗 体 は 、Immuno‑PCR法 に よ っ て 試 験 期 間 を 通 じ て 、 高 感 度 に 検 出 さ れ た 。 感 染 後21日 目 の 鼻 汁 は ウ イ ル ス 分 離 試 験 で 陰 性 で あ っ た が 、Immuno‑PCRで は1：l04．o希 釈 ま で ウ イ ル ス 抗 原 陽 性 で あ っ た 。 以 上 の 成 績 は 本 法 が 高 い 感 度 と 特 異 性 を 兼 ね 備 え た 試 験 法 で あ る こ と を 示 す も の で あ る 。
BHV‑1の 自 然 宿 主 に お け る 潜 伏 感 染 に 関 し て さ ら に 情 報 を 得 る た め 、4頭 の 実 験 感 染 牛 の 鼻 汁 と 諸 臓 器 に つ い て 、 ウ イ ル ス 分 離 とPCR法 を 用 い て し ら べ た 。PCR法 に よ っ て 、 感 染 後22日 目 の す べ て の ウ シ の 三 叉 神 経 節 、 卵 巣 、 肺 、 鼻 腔 と 気 管 の 粘 膜 、 脾 臓 、 前 肩 甲 骨 と 鼠 径 リ ン バ 節 お よ ぴ 末 梢 白 血 球 にBHV‑1 DNAが 検 出 さ れ た 。 一 方 、 こ れ ら の ウ シ の 骨 格 筋 か ら は ウ イ ル スDNAが 検 出 さ れ な か っ た 。 ど の 臓 器 か ら も 感 染 性 ウ イ ル ス は 回 収 さ れ な か っ た 。 こ れ ら の 成 績 はBHV‑1の 潜 伏 感 染 に 自 血 球 が 重 要 な 役 割 を 演 ず る 可 能 性 を 示 唆 し て い る 。
