博 士 （ 獣 医 学 ） 古 賀 哲 文
学位論文題名
Antibacterial Activity of Plaunotol， aCytoprotective Antiulcer Agent，against Helicobacたゲpylori
（粘膜防御系抗潰瘍剤プラウノトールのHelicobacter pyloriに対する抗菌作用）
学位論文内容の要旨
胃 潰 瘍 の 発 生 機 序 は 胃 粘 膜 に 対 す る 攻 撃 因 子 と 防 御因 子 の ノ ヾ ラ ン ス の 失 調 に よ る と 考 え ら れ て い た 。
1983
年 にWarren
とMarshall
が 胃 炎 患 者 の 胃 前 庭 部 粘 膜 か らHelicobacter pylori
を 分離・ 同定 して以 来、本 菌と胃 炎や胃 潰 瘍 と の 関 連が 疑 わ れ る よう に な っ た 。H. pylori
感 染の 関 与 が 注 目 さ れ る に 至 っ た 理 由 は 、 そ の 除 菌 に よ っ て 胃・ 十 二 指 腸 潰 瘍 の 再 発 が 抑 制 さ れ た こ と に あ る 。 米 国 国 立衛 生 研 究所 はH
．pylori
の除菌 につ いて、 「H
，pylori陽性 の消化 性 潰 瘍 の 治 療 に は 初 発 、 再 発 を 問 わ ず 、 酸 分 泌 抑 制 剤と 抗 生 剤 と の 併 用 が 必 要 で あ る 」 と 勧 告 し た 。 本 菌 を 除 菌す る こ と は 非 常 に 難 し く 、 臨 床 で は 抗 生 剤2
剤 あ る い は3
剤 併 用 で 治 療 が 試 み ら れ て い る 。 従 っ て 、 副 作 用 の 少 な い優 れ た 抗H
・pylori
剤 の 開 発 が 望ま れ ている 。近年 、抗潰 瘍剤 の 中 に 本 菌 に 対 し て 抗 菌 作 用 を 示 す も の が あ る こ と が 明か と な っ た 。 プ ラ ウ ノ ト ー ル は タ イ 国 産 の 植 物 の 葉 よ り 得ら れ る 非 環 状 ジ テ ル ペ ン 系 の 粘 膜 防 御 系 の 胃 炎 ・ 胃 潰 瘍 治療 剤 で あ る 。 本 剤 に も 抗H
．pylori
作 用 が あ る と 推 定 さ れる ；こ の よ う に 本 菌 が 注 目 を 集 め た に も か か わ ら ず 、 動物 実 験 の 難 し さ か ら 本 菌 に 関 す る 研 究 は 遅 れ て い た 。 最 近に な っ て ヌ ー ド マ ウ ス を 用 い て 本 菌 の 病 原 性 の 解 析 あ る いは 本 菌 に 対 す る 薬 剤 の 治 療 効 果 の 評 価 が 可 能 に な っ た 。
本 研 究 は 、 従 来 か ら 抗 潰 瘍 剤 と し て 使 用 さ れ て い たプ ラ ウ ノ ト ー 丿 レ が
H
・pylori
に対 し て抗菌 作用を 持っこ とを 見 い だ し 、 そ の 作 用 点 を 検 討 し 、 さ ら に 動 物 モ デ ル を 用い て 本 剤 の 治 療 効 果 の 評 価 を 試 み た も の で あ る 。l
．粘膜防御系薬剤のH
． pylot:iに対する抗菌活性市 販 さ れ て い る プ ラ ウ ノ ト ー ル お よ び 同 系 の テ プ レ ノ ン 、 ベ ネ キ サ ー ト 、 ソ フ ァ ル コ ン 、 セ ト ラ キ サ ー ト 、ゲ フ ァ ル ナ ー ト の
H
．pyloo
に 対 す る 抗 菌 活 性 を 比 較 し た 。 こ れ ら の 薬 剤 の 中 で は 、 プ ラ ウ ノ ト ー ル が 最 も 優 れ た 抗菌 活 性 を 示 し た 。 そ こ で 次 にH
．pylori
に 対 す る プ ラ ウ ノト ー ル の 殺 菌 効 果 を 調 べ た 。 対 数 増 殖 期 の 菌 を 、 リ ン 酸 緩衝 液 に 約l07CFU/ml
に な る よ う に 調 製 し 、 こ れ に プ ラ ウ ノ ト ー ル を 添 加 し た 。 本 剤 の6 yg/ml
添 加 に よ り30
分 以 内 に 、 ま た12 ptg/ml
で は10
分 以 内 に 濁 度 の 減 少 に 伴 っ て 生 菌 数 が 減 少 し た 。 こ の 条 件 下 で 走 査 型 電 子 顕 微 鏡 を 用 い て菌 の 形 態 変 化 を 観 察 し た と こ ろ 、 菌 体 の 萎 縮 並 び に 内 容 物の 遊 出 像 が 認 め ら れ た 。 ま た 他 の 細 菌 に 対 す る プ ラ ウ ノ トー ル の 殺 菌 効 果 を 検 討 し た と こ ろ 、 グ ラ ム 陽 性 菌 と 界 面 活 性 剤 や 脂 肪 酸 な ど に 感 受 性 を 示 す 一 部 の グ ラ ム 陰 性 菌(Neisseria gononhoeae
，MorXe〃aく惣＆uTカa
丘S，fぬem9pカ口US 而打Uen
閲みに対して殺菌効果を示した。2
． プラ ウノ ト ール のH
．pylori
に 対する殺菌作用の 機序プ ラ ウ ノ ト ー 少 が
R pylori
、 グ ラ ム 陽 性 菌 お よ び あ る 種 の グ ラ ム 陰 性 菌 に 対 し て 短 時 間 に 殺 菌 作 用 を 示 し 、 電子 顕 微 鏡 観 察 に よ り 菌 体 の 萎 縮 お よ び 溶 菌 が 認 め ら れ た こと か ら、 プ ラウ ノト ー 丿レ は細 菌 細胞 膜に 作用す るものと推察さ れた 。 そこ でH・pylori
細 胞 膜の 主要 をり ン脂質であるフオ ス フ ァ チ ジ ー ル エ タ ノー ル アミ ンと カ ルジ オリ ピ ンで1
ノ ポ ソー ム を作 り、 プ ラウ ノト ー 丿レ の殺 菌作用 が阻害されるか 否 か を 検 討 し た 。 そ の結 果 、リ ポソ ー ム2.5 Lr.g/ml
の濃 度 で 殺 菌 作 用 は100
％ 阻 害 さ れ た 。 更 に プ ラ ウ ノ ト ー ル と そ の疎水性が異 なる誘導体（Mー4
，M
ー5，M−6）の殺菌作用を検 討 し た 。 殺 菌 作 用 は プ ラ ウ ノ ト ー ル 、M
−6
、M
ー5
、M
一4
の 順 に 強 く 、 疎 水 性 の 強 さ と 一 致 し た 。 更 に り ン 脂 質 に対 す る プ ラ ウ ノ ト ー ル の 作 用 を 調 べ る た め に 、 グ ル コ ー スを 封 入 し た1
ノ ポ ソ ー ム から の グル コー ス の遊 出量 を 測定 した 。 こ の り ン 脂 質 に 対 す る 作 用 の 強 さ も ま た 、 プ ラ ウ ノ ト ー ル 、M
−6
、M
−5
、M
一4
の 順 で あ っ た 。 こ れ ら の こ と よ ルプラウノトールの殺菌作用と抗菌作用はH ． py め顫の細胞膜リ ン 脂 質 に 対 す る 作 用 に 起 因 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。 次 に、H ． j リ面 細胞膜に対するプラウノトールの作用メ カニ ズムを 検討す るため、細胞膜の透過性の変化を本剤作 用後のH ． ヅ 0d 菌体から遊出する物質量を測定することに より 調べた 。菌体 からの遊出物はプラウノトールの濃度に 応じ て増加 した。 細胞膜の流動性について電子スピン共鳴 法 で 測定 し た と ころ 、 薬 剤 濃度 に 応 じ て流動 性が上 昇し た。 これら の成績 はプラウノトールの作用によって菌体膜 の透 過性が 上昇し 、細胞内容物が流出する結果、細菌細胞 が死ぬものと推察された。
3 ．ヌードマウスを用いた H ・ pyloni 感染系に対するプラウノ トールの治療効果
絶 食させ たヌード マウス に H ・ pylori を経口感染させ、
長期 間胃に 定着する 感染モ デルを確立した。この感染系を 用い て臨床 で用いら れてい る抗生剤（アモキシシリン、ク ラリ スロマ イシン） の治療 効果を検討したところ、投与量 に応 じて胃 内の生菌 数が減 少した。またプラウノトールが 抗潰 瘍作用 を示す量 におい て有意に胃内の生菌数を減少さ せた 。次に プラウノ トール と抗生剤との併用効果を検討し た。血vitr 〇でプラウノトールとアモキシシリンあるいはク ライ スロマ イシンと の併用 によって抗菌活性の相加あるい は相 乗効果 が認めら れた。 動物モデルにおいて抗生剤単剤 では 菌数の 減少が観 察され ない薬剤量にプラウノトールを 併 用 する と 、 無 治療 群 に 比 べて 有 意 に 胃内 菌 数 が減 少し た 。 この よ う に 面 Wy 〇 で も プラ ウ ノ ト ール と 抗 生剤 の相 加作用が認められた。
以 上の こ と か ら、 プ ラ ウ ノト ー ル は H ・ f 桝 研 に対 して 抗菌 カを持 ち、細胞 膜の透 過性を上昇させることにより、
細菌 細胞を 死に至ら しめる ことが示唆された。また、ヌー
ドマ ウスを 用いた実 験系で 胃内の細菌数を減少させる効果
を 示 し 、 血 W 加 と 面 Wy 〇 で 抗 生 剤 と の 併 用 効果 が 観 察 さ
れた 。以上 の成績は 胃潰瘍 の治療にプラウノトールと抗生
剤 を 併 用 す る こ と の 意 義 を 支 持 す る も の で あ る 。
学 位 論 文審 査 の 要 旨 主査
副査 副査 副査
教 授 喜 教 授 斉 教 授 高 助 教 授 杉
田 宏 藤 昌 之 島 郁 夫 本 千 尋
学位論文題名 1
Antibacterial Activity of Plaunotol ，aCytoprotective Antiulcer Agent ， against Helicobac た ダ pylori
（粘膜防御系抗潰瘍剤プラウノトールのHelicobacter pyloriに対する抗菌作用）
胃潰瘍の発生にHclicobacrer pylori感染が関与すると考えられている。H. pyloriの 除菌 に より 阿 ・十 二指腸潰 瘍の再発 が抑制され るからで ある。従 って、臨 床ではH.
pyめガ陽性の消化性潰瘍の治療に、酸分泌抑制剤と抗生物質の併用が試みられている。
しか し 、本 菌 を完 全に除去 すること が困難であ るため、 副作用の 少ない優 れた抗H.
pylori剤の開発が望まれている。
本 研究 は 、 非環状 ジテルペ ン系の粘 膜防御系の 胃炎・胃 潰瘍治療 剤である ブラウ ノトーJレ がH. pyloriに対して 抗菌作用 を持つことを見い出し、次にその作用機序を 解析し、 さらに動物 モデル系 を確立し て本剤の治療効果の評価を試みたものである。
ブ ラウ ノ ト ールお よび同系 のテブレ ノン、ベネ キサート 、ソファ 渺コン、 セトラ キサート 、ゲファル ナートのH．pyloriに対す る作用を 調べた結 果、ブラウノトール が最も低 濃度で溶菌 を起こす ことが判 明した。H. pylori細胞膜の 主要なりン脂質で あるフォ スファチジ ルエタノ ールアミ ンとカルジオリヒ ンで調製したりボソームが ブラウノ トールの殺菌作用を効果的に阻害したことから、ブラウノトールはH. pylori の細胞膜1Jン脂質に作 用するも のと推定 した。ブ ラウノト ールのH. pylori細胞膜に 対す る 作用 機 序の 解析によ り、本剤 が細胞膜の 透過性と 流動性を 上昇させ るため、
細 胞 内 容 物 が 流 出 し 、 H. pylori細 胞 が 死 に 至 る も の と 解 さ れ た 。 絶食させ たヌードマ ウスにH. pyloriを 経口感染 させ、本 菌が胃に 定着するモデル 系を 確 立し た 。こ の感染系 を用いて 、抗生物質 アモキシ シリンお よびクラ リスロマ イシ ン の治 療 効果 を検討し たところ 、投与量に 応じて胃 内の生菌 数が減少 した。ブ ラウノト ーJレは抗潰 瘍作用を 示す量で 胃内の生 菌数を減 少させた 。さらに、プラウ ノトール と抗生物質 との併用 により、in vitroで抗菌活性の相加あるいは相乗効果が 認め ら れた 。 動物 モデ渺系 において 抗生物質の みでは菌 数を減少 させない 量でもこ れにブラウノトールを併用すると、胃内菌数が減少した。
以上の成 果はブラウ ノトール に抗H. pylori活性 があり、 その作用 機序は菌細胞膜
の透過性を上昇させることによる殺菌であることを明らかにするとともに、胃潰瘍 の治療に本剤と抗生物質を併用することの意義を支持するものである。よって審査 員一同は古賀哲文氏が博士（獣医学）の学位を受ける資格を有するものと認めた。
