博 士 （ 医 学 ） 川 田 将 也
学位論文題名
Vaccination of fusion cells of rat dendritic and carclnoma cells prevents tumor growth i7ii VZVO
（ ラ ッ ト 樹 状 細 胞 と 癌 細 胞 と の 融 合 細 胞 の
ワ クチン投 与によ る生体で の腫瘍 増殖の抑 制）
学位論 文内容の要旨
目的
現在 、日 本 人の 死亡 原因 の一 位 は悪 性新 生物 であるが、多くの悪性 新生物では必ずしも決定的と 言 え る治 療法 は 見っ かっ てい ない 。 そこ で手 術療 法、化学療法：放射線 療法といった既存の治療法に 加 え 、免 疫療 法 など 新し い治 療法 の 確立 が強 く求 められており、近年、 免疫療法のうち特に樹状細胞 を 利 用し た細 胞 療法 の研 究が 蠱ん に 進め られ てい る。今後、樹状細胞の 機能解析、分離培養技術の進 歩 お よび 癌抗 原 の同 定に 伴っ て、 樹 状細 胞を 用い た治療は、ますます重 要な役割を果たしていくもの と 考 えら れる 。 樹状 細胞 は骨 髄幹 細 胞に 由来 し、 末 梢で 抗原 を獲 得し た 後、リンパ器官へと移動し てT 細 胞に 抗原 を 提示 し活 性化 する 抗 原提 示細 胞と しての強カな機能をも つ細胞である。樹状細胞を使 っ た 免疫 療法 に は、 腫瘍 特異 的抗 原 が既 知の 場合 はその蛋白やぺプチド を樹状細胞に添加する方法や 抗 原 遺伝 子を 導 入す る方 法が 試み ら れて いる 。一 方、未知の癌特異的抗 原を合む多数の抗原を標的と す る 場合 には 、 可溶 化し た癌 細胞 を 樹状 細胞 に加 え る方 法や 癌細 胞のmRNAを 導入 する 方法 の ほか、 樹 状 細胞 と腫 瘍 細胞 との 融合 細胞 を 用い る方 法が 行われ、マウスなどの 動物モデルでの有効性や最近 で は ヒト への 臨 床応 用も 報告 され て いる 。
本研 究で は 、こ の融 合細 胞を 用 いた 免疫 療法 の効果やその応用につ いて検討する目的で、ラット 肝 癌 細胞 株を 用 いた 移植 癌を モデ ル とし て、 樹状 細胞と腫瘍細胞の融合 細胞を使った免疫療法効果の 検 討 を行 った 。
材 料と 方法
6週 か ら8週 齢 の 雄 のWKAH系 ラ ッ ト を 用 い た 。 樹 状 細 胞 は 原 田 ら の 方 法に 準じ てラ ッ ト脾 臓か ら 分 離 し た 。 癌 細 胞 と し て は 化 学 発 癌WKAH系 ラ ッ ト 肝 癌 細 胞 株KDH‑8お よ び 対 照 に は 同 じ く 化 学 発 癌 さ せ たWKAH系 ラ ッ ト 神 経 膠 芽 腫 細 胞 株KEG‑1を 用 い た 。 ど ち ら も 可 移 植 性 で 、KDH‑8は WKAH皮 下 にlXl04個 接 種 す る と 約3週 目 よ り 皮 下 腫 瘍 を 形 成 し 、 約8週 目 で 全 て 腫 瘍 死 す る こ と を確認した。
細 胞 融合 は樹 状細 胞 とKDH‑8と を 等量 混合 し、polyethylene glycol法にて行った。7日間培養後 、 maorhistocompatibilitycompJex（MHC）classHをマーカーとして、magneticce】lsoning（MACS）によ り分 離 し、 融合 細胞 として実験に用いた。 融合細胞中に残存する腫瘍細 胞が増殖し優位になったも の に つ い て は 、 再 度MACSを 行 い 、MHCclassn陽 性 細 胞 が15ゲ 。 以 上 の も の を 実 験 に 用 い た 。 MACSお よ び フ ロ ー サイ トメ ト リ一 、免 疫染 色 、細 胞傷 害抑 制試 験 には 市販 また は供 与 され たマ
−23 ‑
ウ ス 単ク ロン 抗体 およ び 抗血 清を 用い た 。
融 合細 胞に よるin vivoでの 抗 腫瘍 効果 は、 マイ ト マイ シンCで不活化した1X l06個の 融合細胞を ラ ッ ト皮 下に2回 投与 後、lX104個 のKDH‑8を皮 下移 植 し、 その 腫瘍 形 成の 有無 で判 定し た。また、
こ の とき の腫 瘍部位を組織学的、 免疫組織化学的に検討した。 融合細胞により腫瘍形成に 抵抗性を示 し た ラ ッ ト に対 し ては 、そ の効 果の 特 異性 を確 認す る ため 、KDH‑8ある いはKEG‑1の 再移 植を 行 っ た 。 免疫 治療 のモ デル と して 、KDH‑8に対する抵抗性を獲得し たラットの脾細胞から分離 、in vitro で 再 刺激 したT細 胞を 用い ゝた 養 子免 疫治 療効 果や 、 外科 的腫 瘍切除術後に融合細胞を1週毎に投与 し 、 腫瘍 の再 発抑 制効 果 を検 討し た。
T細 胞のKDH‑8に 対す る 細胞 傷害 活性 や 特異 性の 検定 は、 上 記同 様のin vitroで 再刺激 したT細胞 を 用 いた 細胞 傷害 試験 お よび 抗体 によ る 細胞 傷害 抑制 試験 で 行っ た。
結果
in vivoに おけ る融 合細 胞の ワ クチ ン効 果の検 討では、control群である樹 状細胞あるいはKDH‑8の み で 前 処 置 し た ラ ッ ト に お い て 、 ど ち ら の ラ ッ ト群 でもKDH‑8移 植後 約4週目 には100％の 腫瘍 形 成 を 認 め た が 、 融 合 細胞 であ らか じめ 免 疫し たラ ット で は80日後 でも26頭 中18頭 に腫 瘍形 成を 認 め な か っ た 。 さ ら に 、 腫 瘍 形 成 を 認 め な か っ た ラッ トヘ 再度KDH‑8を 移植 し ても 、8頭中6頭で 腫 瘍 の 形 成 が 抑 制 さ れ た。 しか し、 異な る 腫瘍 であ るKEG‑1を移 植し た3頭で は 全て に腫 瘍の 形成 を 認 め た。 した がっ て、 融合細胞のワクチン効果は 腫瘍特異的であると考えられ た。病理組織学的には 融 合 細胞 で免 疫し たラ ッ トで は、controlラッ トで ほ とん ど見 られ ない腫瘍 周囲からの多数のCD8陽 性 リ ンパ 球の 浸潤 およ び 腫瘍 に多 数のssDNA陽 性ア ポ トー シス 死細 胞 を認 めた 。次 に融 合 細胞の免 疫 に よ り 腫 瘍 形 成 に 抵抗 性を 獲得 した ラ ット 脾T細胞 の細 胞傷 害性 を 検討 する と、KDH‑8に 特異 的 な 細 胞傷 害活 性を 認め た 。こ の細 胞傷 害 活性 は抗CD8およ び抗classI抗体 を添 加す ると 抑 制され、
腫 瘍 へ浸 潤し てい たと 同 様の くD8．陽 性 リン パ球 でclassI拘 束性 のKDH‑8特 異的細胞傷害性T細胞で あ る こ と が 確 認 さ れ た。 さら に、 このKDH‑8に 特 異的 な細 胞傷 害活 性 を有 するT細 胞を 腫瘍 細胞 と 混 合 して ラッ ト皮 下に 投与すると強い腫瘍増殖抑 制を認めた。また、外科的腫 瘍切除後に融合細胞を 接 種 する こと によ って6頭 中5頭で 腫瘍 再 発を 抑制 でき た。
考察
抗腫 瘍免 疫 療法 のワ クチンと して樹状細胞と腫瘍細胞の 融合細胞を用いる利点は、未 知の抗原に対 し ても 対応 で きる こと 、単一の 抗原と異なり複数の腫瘍抗 原を提示していると考えられ 腫瘍細胞の変 異 にも 対応 で きる 可能 性がある こと、樹状細胞に比ベ比較 的安定で培養できることが挙 げられる。ま た、MHC classI．およびclass IIのほ か副刺激分子を発現しており 、養子免疫療法に必要な細胞傷害性 T細 胞 の増 殖に もそ のま ま 使用 でき る。 一 般に 融合細胞を 用いた抗腫瘍免疫療法では融 合細胞の高い 純 度が 求め ら れる 傾向 にあ るが 、 今回 の研 究で は15％ と必 ずし も高 い 純度の融合細胞 を使用してい な いに も関 わ らず 腫瘍 特異 的細 胞 傷害 性T細胞 が誘 導さ れ、 そ の抗 腫瘍 効果 は発 揮 され た。 一方 、 今 回の 研究 で はす でに 形成され た腫瘍に対しての効果は不 十分であった。しかし、外科 的腫瘍切除後 の再 発防止には融合細胞による ワクチン効果は有効であり、 今回は検討していなbゝが他 の免疫療法や 化 学療 法、 放 射線 療法 との組み 合わせにより、効果的な治 療法となる可能性が高く、今 後の検討課題 である。
結語
融合 細 胞を ワク チンと して接種することにより、in vlvoで腫瘍の増殖を抑制 することができた。免
一24―
疫組織学的検討および細胞傷害試験の結果から、
細胞が誘導されたことによるものと考えられた。
抑制治療など臨床応用への可能性が示唆された。
この抑制効果は腫瘍に対する特異的な細胞傷害性T また、養子免疫療法および外科的腫瘍切除後の再発
‑ 25―
学 位論文審査の要旨
学位論文題名
Vaccination of fusion cells of rat dendritic and carclnoma cells prevents tumor growth j7l
ぴzv0
（ ラ ッ ト 樹 状 細 胞 と 癌 細 胞 と の 融 合 細 胞 の
ワク チン投 与による 生体で の腫瘍増 殖の抑制 ）
近年、免疫療法のうち特に樹状細胞を利用した細胞療法の研究が盛んに進められ ている。本研究では、この融合細胞を用いた免疫療法の効果やその応用にっいて検討 する目的で、ラット肝癌細胞株を用いた移植癌をモデルとして、樹状細胞と腫瘍細胞 の融合細胞を使った免疫療法効果の検討を行った。
in vivo
における融合細胞のワクチン効果の検討では、control 群である樹状細胞ある いはKDH‑8 のみで前処置したラットにおいて、どちらのラット群でも
KDH‑8移植後 約
4週日には100 ％の腫瘍形成を認めたが、融合細胞であらかじめ免疫したラットで は
80日 後で も26 頭中18 頭に腫瘍形成を認めなかった。さらに、腫瘍形成を認めな かったラットヘ再度KDH‑8 を移植しても、8 頭中6 頭で腫瘍の形成が抑制された。し かし、 異な る腫瘍である
KEG‑1を移植した3 頭では全てに腫瘍の形成を認めた。し たがって、融合細胞のワクチン効果は腫瘍特異的であると考えられた。病理組織学的 には融合細胞で免疫したラットでは、control ラットでほとんど見られない腫瘍周囲か らの多 数の
CD8陽性リンパ球の浸潤および腫瘍に多数のssDNA 陽性アポトーシス死 細胞を認めた。次に融合細胞の免疫により腫瘍形成に抵抗性を獲得したラット脾T 細 胞の細胞傷害性を検討すると、KDH‑8 に特異的な細胞傷害活性を認めた。この細胞傷 害活性は抗CD8 および抗classI 抗体を添加すると抑制され、腫瘍ヘ浸潤していたと 同様の
CD8陽 性リン パ球 でclassI 拘 束性 のKDH‑8 特異的細胞傷害性T 細胞であるこ とが確 認さ れた。さらに、この
KDH‑8に特異的な細胞傷害活性を有するT 細胞を腫 瘍細胞と混合してラット皮下に投与すると強い腫瘍増殖抑制を認めた。また、外科的 腫瘍切除後に融合細胞を接種することによって
6頭中5 頭で腫瘍再発を抑制できた。
抗腫瘍免疫療法のワクチンとして樹状細胞と腫瘍細胞の融合細胞を用いる利点は、
未知の抗原に対しても対応できること、単一の抗原と異なり複数の腫瘍抗原を提示し ていると考えられ腫瘍細胞の変異にも対応できる可能性があること、樹状細胞に比べ 比較的安定で培養できることが挙げられる。また、
MHC classIおよびclass II のほか 副刺激分子を発現しており、養子免疫療法に必要な細胞傷害性T 細胞の増殖にもその まま使用できる。一般に融合細胞を用いた抗腫瘍免疫療法では融合細胞の高い純度が
暹 敬
之
紘
巻 木
藤
葛 吉
加
授 授
授
教 教
教
査 査
査
主 副
副
求められる傾向にあるが、今回の研究では15 ％と必ずしも高い純度の融合細胞を使用 していないにも関わらず腫瘍特異的細胞傷害性T 細胞が誘導され、その抗腫瘍効果は 発揮された。一方、今回の研究ではすでに形成された腫瘍に対しての効果は不十分で あった。しかし、外科的腫瘍切除後の再発防止には融合細胞によるワクチン効果は有 効であり、今回は検討していないが他の免疫療法や化学療法、放射線療法との組み合 わ せ に よ り 、 効 果 的 な 治 療 法と な る 可 能 性 が 高 く 、 今 後の 検 討 課 題で ある。
融合細胞をワクチンとして接種することにより、in vivo で腫瘍の増殖を抑制するこ とができた。免疫組織学的検討および細胞傷害試験の結果から、この抑制効果は腫瘍 に対する特異的な細胞傷害性
T細胞が誘導されたことによるものと考えられた。また、
養子免疫療法および外科的腫瘍切除後の再発抑制治療など臨床応用への可能性が示唆 された。
口頭発表において古木敬教授より養子免疫療法モデルの特異的リンパ球接種のタイ ミングについて、外科的腫瘍切除術後の腫瘍の再発抑制効果モデルでの腫瘍ワクチン の投与経路について、融合細胞の融合効率にっいて、臨床における腫瘍ワクチンの不 活化方法について質問があった。っづいて加藤紘之教授より外科的腫瘍切除術後の腫 瘍の再発抑制効果モデルでのラットの観察項目にっいて、具体的な臨床症例と重ね合 わせて腫瘍周囲へのりンパ球浸潤に関する考察にっいて質問があった。また葛巻より 融合細胞の染色体分析の実施について、融合細胞の表面抗原発現たどの安定性にっい て、樹状細胞と腫瘍細胞を混合した場合の抗腫瘍効果にっいて、外科的腫瘍切除術後 の腫瘍の再発抑制効果モデルの融合細胞以外にワクチン接種の実施にっいての質問が あったが、申請者はおおむね妥当な回答をした。
この論文は、樹状細胞と腫瘍細胞との融合細胞が、腫瘍特異的細胞傷害性T 細胞を 誘導し、生体で強い腫瘍抑制効果を示すことを証明したことで高く評価され、今後臨 床応用に向けての発展も強く期待される。
