体外培養系で作出したウシ核移植卵の体外発生能に関する研究
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(2) 博士 学位論文 体 外培養系 で作出 した ウ シ核移植 卵の体外発 生能 に関 す る研究. 平 成10年3月. 近畿 大学大学 院 興学 専攻(指. 農学研究科. 導:角 田幸雄教授). 大越. 勝広.
(3) 体 外培養 系で作出 した ウ シ核移植卵 の体 外発生能 に関す る研究. 近畿大学大学院農学研究科 農学専攻 大 越 一勝 広 (指導:角. 田幸 雄 教 授). StudiesontheNuclearTransferinBovine. KatsuhiroOhkoshi. GraduateSchool,KinkiUniversity DivisionofAgriculturalScience (Advisor:Prof.YukioTsunoda) March,1998. SubmittedtotheGraduateSchool,KinkiUniversitytofulfilltherequirementsforthe DoctorateDegree..
(4) 目次. 第1章. 緒 言. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …1. 第2章. 卵 胞 卵 の 成 熟 培 地 へ の 性 腺 刺 激 ホ ル モ ン,成. 長 因 子 「. お よ び. 第1節. シ ス テ ア ミ ン の 添 加 が 核 移 植 卵 の 発 生 能 に 及 ぼ す 影 響. 材 料. 1.・. と 方 法. レ シ ピ エ ン. 2..核. ト卵 子 お よ び. 実 験 結 果. 第3節. 考 察. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …5. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ….・. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …7. トエ タ ノ ー ル の 添 加 が. 核 移 植 卵 の 発 生 能 に 及 ぼ す 影 響. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …9. 材 料 と 方 法. 1.体. 外 受 精. と ド ナ ー 胚 割 球 の 作 出. 2.レ. シ ピ エ. ン ト卵 子. 3.核. 移 植 お よ び 核 移 植 卵 の 培 養. 4.Nメ. ル カ ブ. 第2節. 実 験 結 果. 第3節. 考 察. 第4章. ・ ・ ・ ・ ・ ・ …3. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …5. 体 外 培 養 液 へ の β 一メ ル カ プ. 第1節. ドナ ー 胚 の 作 出. 移 植 お よ び 核 移 植 卵 の 培 養. 第2節. 第3章. …3. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …9. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …10. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …10. トエ タ ノ ー ル 添 加 の 影 響. ・ ・ ・ ・ ・ ・ …10. ・ ・.・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …11. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …13. ドナ ー 胚 の 日 齢 が 核 移 植 卵 の 発 生 能 に 及 ぼ す 影 響. 第1節. 材 料. ・ ・ ・ …914. と 方 法. 1.ド. ナ ー 胚 お よ び. 2.核. 移 植 お よ び 核 移 植 卵 の 培 養. 第2節. 実 験 結 果. 第3節. 考 察. レ シ ピ エ ン ト卵 細 胞 質. ・ ・ ・ ・ ・ ・ …14. ・ ・ 。 ・ ・ ・ ・ ・ ・ …. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …15. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …18. .・1・5.
(5) 第5章. レ シ ピ エ. 発 生 能. 第1節. ン. に 及. 材 料. ト卵 子 の 凍 結 保 存 が 核 移 植 卵 の. ぼ す 影 響. の ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …20. と 方 法. 1..ド. ナ ー 胚 お よ び. 2.レ. シ ピ エ ン. 3.凍. 結. 4.卵. 齢 の 影 響. 5。. レ シ ピ エ ン. 第3節. 考 察. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …21. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …22. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …25. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …25. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …30. ドナ ー 胚 の 凍 結 保 存 が 核 移 植 卵 の 発 生 能. 第1節. ・ ・ ・ ・ ・ ・ …20. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …22. 継 代 核 移 植 の 影 響. 実 験 結 果. ト卵 細 胞 質. ト卵 子 の 凍 結 保 存. ・融 解 時 期 の 影 響. 第2節. 第6章. ・ …. に 及 ぼ す 影 響. 材 料 と 方 法' ・. 1.体. 外 受 精. 2.ド. ナ ー 胚 の 凍 結 保 存. 3.核. 移 植 お よ び 核 移 植 卵 の 培 養. 第2節. 実 験 結 果. 第3節. 考 察. 第7章. と 脂 肪 滴 の 除 去. 第1節. 材 料. 2.継. 代 核 移 植. 3.凍. 結 保 存. 実 験 結 果. 考. 察. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …33. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …33. に 及 ぼ す 凍 結 保 存 の 影 響. ・ ・ ・ ・ ・ …41. と 方 法. ナW胚. 節. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …32. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …39. 1.ド. 第2節. 5. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …33. 継 代 核 移 植 卵 の 発 生 能. 第3・. ・ ・ …32. と レ シ ピ エ ン. ト卵 細 胞 質. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …41. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …42. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …42. ・ ・,・ 。 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …43. ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …43.
(6) 第8章. 総合考察. 謝辞. 53. .... 引用文献. 要約. 48. .......................... ・. SUMMARY. ・. 54. .............................. ・. ・. ・. ・. ・. ・. ・. ・. ・. ・. ・. ・. ・. ・. ・. ・. ■. ●. ●. ●. ●. ●. ●. ■. ●. ●. ●. ●. ●. ・. ●. ・. ・. ●. ●. ・. ●. ・. ●. ・. ・. ・. ・. ・. …. ●. ●. ●. ●. ●. ●. 64 ■. ●. 69.
(7) 第1章. 緒言. 本 来 初 期 胚 核 の 個 体 へ の 発 生 能(全. 能 性)を. され た核 移 植 技 術 は 、Willadsen(1986)が. 検 討 す る た め の 技 術 と して 開 発. ヒツ ジ8∼16細. 胞 期 胚 の核 移 植 に. よ って 子 羊 の 作 出 に成 功 して 以 来 、家 畜 の 育 種 改 良 技 術 と して研 究 され る よ う にな って き た 。現 在 、 家 畜 にお け る核 移 植 は、 遺 伝 的 に優 良 な 形 質 を有 す る 個 体 を多 数 生 産 す る こと を 目的 に実 施 され て い る。 初 期 の研 究 で は 、 核 移 植 に 用 い る ドナ ー 胚 は過 剰 排 卵 処 置後 、 人工 授 精 して3∼6日. 後 に非 外 科 的 に 回収 し. た 初 期 胚 が 、 ま た 、 レシ ピエ ン ト卵 に は 同 じく過剰 排 卵 処 置 後 回収 した 未 受 精 卵 子 が 使 用 され 、 さ ら に作 出 され た 核 移 植 卵 は 、受 胚雌 へ 移 植 す る 前 に 一 時 的 に ヒ ツ ジの 結 紮卵 管 内 で 発 生 させ る と い う"invivo"系 い た(Prathereta1.,1987)。. が 使 用 され て. しか しな が ら、"invivo"系. は、主 と. して 経 済 的 問題 の た め 、 核 移 植 技 術 の実 用 化 を さ ま た げて き た。 一 方 、 哺 乳 動 物 の 受 精 機 構 を解 明 す る た め に研 究 され て き た 体 外 受 精 技 術 (Chang,1959)も. ま た 、 家 畜 の 繁 殖 技 術 と して応 用 す る方 向 で研 究 が 進 み. (Bracketteta1.,1982)、. 食 肉処 理 場 で 廃棄 され た ウ シ卵 巣 か ら卵 胞 卵 を回. 収 し、 体 外 で 成 熟 させ 、体 外 受 精 を行 い、 さ らに受 胚 牛 へ移 植 す る ま で 体 外 で 発 生 させ る と い っ た 一 連 の 技 術 が 確 立 さ れ た(花 1988).こ. 田,1985;Gotoeta1.,. の体 外 受 精 技 術 で 得 られ た知 見}ま、核 移 植 技 術 に応 用 さ れ 、 現 在 で. は体 外培 養 系 で の核 移 植 卵 の 作 出 も可能 とな って きて い る。 す な わ ち 、 体 外 成 熟 後 の 未 受 精 卵 を レ シ ピエ ン ト卵 細 胞 質 と して 、 また 、 体 外 成 熟 ・体 外 受 精 ・ 体 外 培養 によ り得 られ た 初 期 胚 を ドナ ー 胚 と して使 用 し、 作 出 さ れ た 核 移 植 卵 を体 外 培 養 に よ り受 胚雌 へ 移 植 可 能 な 時 期 で あ る胚 盤 胞 期 まで 発 生 させ る方 法 で あ る(Takanoetal.,1994)。. また 、 核 移 植 を実 用 化 技 術 と して 使 用 す る た. め に は、 胚 あ る い は卵 子 の凍 結 保 存 技 術 を確 立 す る こ とが必 要 で あ る。 す な わ ち 、 作 出 され た ク ロー ン胚 の 一 部 を使 用 して 胚 の 性 判 別 を行 っ た り、 受 胚雌 に 一1一.
(8) 移植 後得 られた 産子 の形質(肉 質 あるいは乳量 な ど)が 判明す るまでの問、残 りの ク ロー ン胚 を保存 す る必 要が あ る。 また、1個 の ドナー胚 を用 いて核移植 を繰 り返 し行 う継代 核移 植 を実施す る際 に世代 を重ね る毎 に大量 の レシ ピエ ン ト卵 細胞質 が必要 とな るが 、屠殺場 由来の卵巣か ら回収で きる卵 子 には限 りが ある。そ のため 、 レシ ピエ ン ト卵子 と して用 いる未受精 卵 の凍 結保存技術 もま た必 要で あ り、核 移植 技術 を実用的な家畜繁殖技術 と して使 用す るには いぜ ん として多 くの未解 決 の 問題 が残 されて いる。そ こで、本研究 で は、1)レ エ ン ト卵 細胞 質 として使 用す る未成熟卵 の体外 成熟培養 条件、2)核. シピ. 移植卵 の. 体外 発生培養 条件 、3)核. 移植卵 の体外発 生能 にお よぼす ドナ.__.胚 の 日齢 の影. 響 を検 討 し、つ いで4)レ. シ ピエ ン ト卵細 胞質な らび に5)ド. 存 の影響 お よ び6)継. ナー胚 の凍結 保. 代 核移 植卵 にお ける凍結 保存 の影 響 をそ れぞ れ検 討 し. た。. 一2一.
(9) 第2章. 卵胞 卵 の成熟培 地へ の性 腺刺激 ホルモ ン、成 長 因子 お よ び シス テ ア ミンの添加が核移植卵の発生能 に及ぼす影響. 本章で は、 ウシ卵子 の核移植 に用 いる レシ ピエ ン ト卵細 胞質 の体 外成 熟条 件 を検 討す るため、性腺刺激 ホルモ ン、成長 因子 およびシステア ミ ンを単 独で あ るいは組 み合 わ せて 成熟 培地 に添加 し、核移 植後 の体外 発 生能 を比 較検 討 し た。. 第1節. 1.レ. 材料 と方法. シ ピ エ ン ト卵 子 お よ び ドナ ー 胚 の 作 出. 屠 殺 場 で 得 ら れ た 卵 巣 は 、30∼37℃. に保 温 した 生 理 的 食 塩 水 中 に 保 持 し. て 研 究 室 に 持 ち 帰 っ た 。 卵 巣 表 面 の 小 卵 胞 よ り 吸 引 採 取 し た 卵 胞 卵 を 、5%子 ウ シ 血 清(CS,GIBCO)加TCM199液(Earle塩,GIBC O)に. 抗 生 物 質(100μg/m1ス. ト レ プ トマ イ シ ン と ア ン ピ シ リ ン)を. 添 加 し た も の を 基 本 培 地(1区)と 20∼24時. し て 、 以 下 の 添 加 物 を 添 加 した 成 熟 培 地 で. 間 成 熟 培 養 し た 。 す な わ ち 、2区;シ. ス テ ア ミ ン(50μM,. SIGMA,M-6500)(Takahashieta1.,1993)、3区;卵. 胞刺激 ホ. ル モ ン(FSH,0.02unit/m1,SIGMA,F-8001) (Takahashietal.,1993)お. よ び 黄 体 形 成 ホ ル モ ン(LH,100iu/. ml,SIGMA,L-9773)(Keefereta1.,1993)、4区;上. 皮成 長. 因 子(EGF,1!・/m1,SIGMA,E-1257)(lmandPark, 1995)と. 血 小 板 由 来 成 長 因 子(PDGF,0.1ng/ml,Becton. Dickinson)(HarperandBrackett,1993)、5区;10ng/ mlEGF、0.1ng/mlPDGFと -1. ,100ng/ml,和. イ ン シ ュ リ ン 様 成 長 因 子1(IGF 光 純 薬)(Lorenzoeta1.,1994)、6区; -3一.
(10) 0.02unit/mlFSH,100iu/mlLH,10ng/rnl EGFと0.1ng/rnlPDGF、7区;0.02unit/mlFSH、 100iu/mlLH、10ng/mlEGF、0.1ng/mlPDGFと 100ng/mlIGF-1、8区;0.02unit/m1FSH、100 iu/mlLH,10ng/mlEGF,0.ing/mlPDGF,100 ng/mlIGF-1と50μMシ. ス テ ア ミ ン を そ れ ぞ れ 添 加 した 培 地 で 成 熟. さ せ た 。 な お 、 これ ら の添 加 物 の 濃度 は これ まで の報 告 に従 っ て決 定 した 。 体 外 成 熟 培 養 後 、3001U/m1ピ 6)添. ア ル ロ ニ ダ ー ゼ(SIGMA,H-350. 加 リ ン 酸 緩 衝 液(PBS)中. で 卵 丘 細 胞 を 除 去 し た 。 つ い で 、 第1極. を 有 す る 卵 子 の み をTakanoetal.(1993)に を 入 れ 、 第2減. 従 っ て 透 明 帯 の 一 部 に 切 り込 み. 数 分 裂 中 期 染 色 体 を 含 む 細 胞 質 を 第1極. 体 と と も に押 し出 して. 除 去 し た 。 押 し 出 し た 細 胞 質 は 、 ア ク リ ジ ン オ レ ン ジ(5μg/m1、 薬)で. 体. 和光純. 染 色 後 、 蛍 光 顕 微 鏡 下 で 染 色 体 の 有 無 を 検 査 し、 染 色 体 が 認 め られ た 場. 合 に 残 り の 細 胞 質 を レ シ ピ エ ン ト卵 細 胞 質 と し て 使 用 し た 。 な お 、 成 熟 率 の 判 定 は 第1極. 体 の 有 無 で 行 っ た 。 染 色 体 を 除 去 後 、Zirnmerman液. (WolfeandKraemer,1992)へ 流 を20μsec、2回 SH-1)。. を15分. 移 し て5分. 間 平 衡 後 、20V/mmの. 間 隔 で3回. 与 え た(島. つ い で 、10μ9/m1シ. 加TCM199液. 5mMカ. で 体 外 成 熟 後 、Takanoetal.. 従 っ て 体 外 受 精 した も の を用 い た 。 す な わ ち 、 融 解 した 凍 結 精 液 を フ ェ イ ン 加BO液(BrackettandOliphant,1975)で1800. rpm、5分 BO液. で. 間 培 養 した 。. ド ナ ー 胚 は 、5%CS加TCM199液 (1993)に. 津 製 細 胞 融 合 装 置,S. ク ロ ヘ キ シ ミ ド(SIGMA,G-62. 55)(PresicceandYang,1994;Yangeta1.,1994)添 ドナ ー 割 球 を 注 入 す る ま で9時. 直流 電. 間 遠 沈 洗 浄 後 、 ウ シ 血 清 ア ル ブ ミ ン(BSA、fractionV)加. で 精 子 濃 度 を1×107/mlに. に100μ1の. 調 整 した 。 つ い で 、 ミ ネ ラ ル オ イ ル 下. 精 子 浮 遊 液 小 滴 を 作 成 後 、 成 熟 卵 子 を 精 子 浮 遊 液 へ 導 入 し 、6. 一4一.
(11) 時 間 培 養(媒. 精)し. た 。 媒 精 後 、 卵 子 は5%CS加CRlaa液. (RosenkransandFirst,1991)で. 卵 丘 細 胞 と5.5日. 42細. 胞 期 へ 発 生 さ せ た 。 つ い で 、 胚 を0.5%プ. E,科. 研 製 薬)加PBS液. 間 共 培 養 し て 、24∼ ロ ナ ー ゼ(ア. クチ ナー ゼ. に移 して 透 明 帯 を除 去 した後 、 ピペ ッテ ィ ン グ操 作. を 繰 り返 して 単 一 の 割 球 と した 。. 2.核. 移 植 お よ び核 移 植 卵 の 培 養. ドナ ー 胚 か ら単 離 した 単 一・ 割 球 は 、 透 明帯 の切 り込 み を通 して 除 核 未 受 精 卵 の 囲卵 腔 ぺ 注 入 し た 。 Zimmerman液 上 に2本. 注 入 卵 子 は 、 成 熟 培 養 開始 後30時. へ 移 して10分. の ワイ ヤ ー を1mm幅. 間 目 に、. 間 平 衡 させ た 。 つ い で、 ス ラ イ ドガ ラス. で 設 置 した 融 合 チ ャ ンバ ー に融 合 液 を 満 た し、. そ こへ 卵 子 を 移 した 後 、 ピペ ッ トを使 用 して割 球 と卵 細 胞 質 の接 着 面 が 電 極 と 平 行 にな る よ うに 動 か し、100V/mmの. 直流 パ ル ス を50μsec与. えて. 膜 融 合 を 誘 起 した 。 つ い で 、 融 合 の み ら れ た 卵 子 は 、10μ1(新 ら,1993)の5%CS加CRlaa液. で卵 丘 細胞 と10日. 田. 間 共 培 養 して 体 外 で. の発 生能 を検 討 した 。 得 られ た 胚 盤 胞 の一 部 は 風 乾 法 に よ って 固 定 後 、 ギ ムザ 染 色 を行 って 細 胞 数 を計 測 した(Tarkowski,1966)。 て空 気 中5%CO2、38.5℃ は、x2検. 第2節. 表1に. 定 お よ びt検. の条 件 下 でお こな った 。 また 、 得 られ た 結 果 定 に よ り有意 差(p〈o.05)の. 有 無 を検 討 した 。. 実験結果. 、 核移 植 卵 の 発 生 能 に お よ ぼ す 成 熟 培 地 へ の性 腺 刺 激 ホ ル モ ン 、 成 長. 因 子 お よ び シ ステ ア ミ ン添 加 の影 響 を示 した。2∼8区 ∼87%で. なお、体 外培養 は、全. あ り、 対 照 区 で あ る1区. の79%と. にお け る 成 熟 率 は76. 比 べ て 大 差 が み られ な か っ た 。. ま た 、 これ らの卵 子 を レ シ ピエ ン ト卵 細 胞 質 と して 用 い て核 移 植 を行 った 結 一5一.
(12) . A解卜躯Kあ+﹁﹂O ︻+匹O O畠+﹂O国+= 一+= の脇+のU+ひひご≧ Q↑ 挿 0◎ 夙一匡 O ︻ +匹OO 傷+匹O国+=一+= の昌+のQ+ひひ=≧U↑ ド 儀 匹O O店+﹂○ 国+寓日+=の匹+のQ+ひひ二≧9↑ ぢ .腎﹂O ︻+店O (置 +隅○ 国+のU+ひひ自≧9↑ 塔. 〇〇り 十ひひ一∼臼U↑ 一笛.八曜卜躯Kあ十のり十ひひ二≧∪↑ 一 N 。のQ十ひひ一∼︻Q↑ 芸 管. . 匹O O山十﹂O国十のU十ひひ=≧O﹄﹂寸 . 工日十= の匹十. (一゜。)菖. (一ひ)ゆ寸 ＼ N寸. ( 寸◎e)めト こ O. oO. .O > 山 ) Ω に 欄 髄 に 坦 踵 即 建 蝋 蟹 匝. (°。め)2. (ゆ O. ( 卜 )笛. O .卜◎o. 卜. 刊. O. O. ⑩. ([11 儲). (℃◎o)笛卜 一＼o◎寸 ︻. (い◎◎)トリ ＼ トい (oうひ) 寸◎o ＼◎Q卜. (ひ◎○)い寸 ＼O寸. ( 卜卜) 8. ＼O寸. ゆ ￡(い◎o)等. (O卜)いト ＼ トい. (ひト)ひ◎Qミ ひ寸一. 無 愚照 糞＼. .一 榔. 契凶. H. cq. ◎ら. (卜◎o)Oト こ O. (いト) 9. (O邑)°。N. (め゜o)6うめ. ゆ (。。 )ゆ. (◎oの)導. ( 寸ひ)一◎◎ ＼O卜. ＼O寸. d(いひ)◎◎◎○ ＼ 寸◎o. ￡(い◎o)専. ￡(ひト)ひ。。一こ 9. 蝋 愚嬉 蓮 ＼. 麟 鼠簾 罎. ( ま). 麟愚如躍. (ま ). (cう◎o)トい一＼ Oの一. 寸. (6・°ら)6・ 一. ◎o. トひ. (9 )い. 昏 ゜。) さ ( ゆト) さ. (一◎o)OO一＼ O oら一. (°。 )°ら. ひ .oう O .いひ. (N寸)いめ. 邸(oい)°。斡. 制 q い=. (い1 1口 ) ◎O.い 一 制 O. ℃ ◎◎. (9 )=. 邸(°。一迂. (N11口)O O歪. (い11口 ) ひ. O訓 制. 制. (◎011 漏 ) ひ. ひト. ￡(。。。)卜N. (6・一)い. ゜( 8 N︻. い. ◎Qひ. (O卜)k ト. い .6う一 制. (ト ー1自) 邸◎o. 〇一 刑 (N" 口). ( 9N ) 9N. 扁余. ( こ) こ. 囲 羅 ゜。. い. ゆ◎○. 囲糊團. 刑. (◎011 口) 鳴N . ひ. ( 欄 塵・ 糾 腿 制興 肝 ) ( ま)麟 鼠 酬 課. 勲訟 eロ R錐 八 醒 卜 塩 〆 ら る % 霧 " 八山 弓 ムへ艇 艇 留 桜礫興憩・ e, <碧 蟄 簾 賢 や 協ゆ% 翼 U茄￠細 課 一略葦 e 愚 担﹃ 鐘逼 心 心. 較 刷興田帳e 制興 麹醤. 砧 図略 賢. 一6一.
(13) 果 、 分割 率 、8細. 胞 期 へ の 発 生 率 と も に1区. と比 較 して 、著 しい 差 異 はみ とめ. られ なか っ た(76対68∼84%,40対30∼50%)。 の発 生率 も、1区(17%)と. また 、胚盤胞 へ. 比 べ て6∼8区(7お. よ び8%)で. は低下す る. 傾 向 がみ られ た もの の 、 全 て の 区 にお いて 大 差 はみ とめ られ な か っ た 。 ま た 、 得 られた 胚 盤 胞 の細 胞 数 は 、6お 0と 対 照 区 の86.5に. よ び7区. でそ れ ぞ れ97.8お. よ び115.. 比 べ て 有 意 な増 加 が 見 られ たが 、他 区 にお い て は 大 差. はみ られ な か った 。. 第3節. 考察. 本 実験 か ら、性 腺 刺 激 ホ ル モ ン、 各 種 成 長 因子 お よ び シス テ ア ミ ン を単 独 で あ る い は組 み 合 わ せ て 添 加 した 培 地 で 成 熟 させ た体 外 成 熟 卵 子 を 、 レ シ ピエ ン ト卵 細胞 質 と して 用 い た ウ シ核 移 植 卵 の体 外 発 生能 は 、 これ ら を加 え な い培 地 で 成 熟 さ せ た 卵 子 を用 い た場 合 に比 べ て 大 差 が な い こ とが判 明 した 。 す で に、 体 外 成熟 培 地 へ のFSHとLHの Keeferetal.(1993)お. 添 加 は核 移 植 卵 の発 生 能 に影 響 しな い こ と を よ び加 藤 ら(1993)は. PDGF、EGF、PDGF、IGF-1あ IGF-1、. 報 告 して い る が 、EGFと るい はEGF、PDGF、. シ ス テ ア ミ ン を一 緒 に添 加 した場 合 で も大 差 が な い こ と が 判 明 し. た。 核 移 植 卵 の 発 生 能 に及 ぼ す成 熟 培 地 へ の成 長 因子 添 加 の影 響 を検 討 した 報 告 は 、 筆者 の 知 るか ぎ りみ られ な い 。 体 外 成 熟 と体 外 受 精 後 の発 生 能 に及 ぼ す 影 響 を調 べ た 報 告 は数 多 くみ られ る が 、 そ の効 果 は一 定 して いな い 。 す な わ ち 、 ImandPark(1995)は. 、EGFの. 添 加 は 卵胞 卵 の 体 外 成 熟 率 を 増 加 す る こ. と、L6renzoeta1.(1994)はEGFとIGF-1を. 組み 合わせ て添加す る こ. とに よ り成 熟 率 が 有 意 に 向 上 す る こ と、HarperandBrackett(1993)は PDGFをFSHと. 共 に 添 加 す る こ と によ って 体 外 受 精 卵 の発 生 能 が 向 上 す る 一7一.
(14) こ と をそ れ ぞ れ 報 告 して い る。 しか しな が ら一 方 で 、ParkandLin(1993) は 、EGFの. 添 加 は 体 外 受 精 後 の 分割 率 を 向 上 さ せ な い こ と 、Kobayashiet. a1.(1994)は. 無 血 清 培 地 を用 いた 場 合 に比 べ る とEGFとTGF-aを. 添加. した 場 合 、 分 割 率 お よ び 胚 盤 胞 へ の発 生 率 は有 意 に 向上 す る が 、FCSの な らび に性 腺 刺 激 ホ ル モ ン(LHとFSH)を. 添加. 添 加 した場 合 と比 べ る と差 は認. め られ な い こ と を報 告 して い る。 本 実 験 で は 、 各 種 成 長 因子 の 添 加 は 卵 胞 卵 の 成 熟 率 お よ び 核 移 植 卵 の発 生 率 に著 し くは影 響 しな か っ た 。 これ らの 相 違 は 、 成 長 因 子 の 添 加 濃 度 や 成 熟 培 養 条 件 の違 い に よ る も の と も考 え られ るが 、詳 細 は明 らか で は な い。 シ ス テ ア ミ ン を 卵 胞 卵 の成 熟 培 地 に添 加 す る と、 卵 細 胞 質 内 グル タ チ オ ン濃 度 が 上 昇す る こ とが 報 告 さ れ て い る(Takahashieta1.,1993;DeMatoset al.,1995)。. グ ル タ チ オ ンは 、 酸化 障 害 か ら細 胞 を保 護 す る作 用 の 他 に 、 ブ タ. 卵 子 で は 体 外 受 精 後 の 雄 性前 核 形 成 を促 進 す る働 き の あ る こ と(Yoshidaet al.,1993)、 1995)が. 体 外 受 精 後 の雌 雄 両 前 核 形 成 時 期 の 同 調 作 用(Grupeneta1.,. あ る こ とが そ れ ぞ れ 報告 され て い る。 本 実 験 で は 、 シス テ ア ミ ンの 添. 加 に よっ て 体 外 成 熟 ウ シ卵 子 の質 的 向上 が 核 移 植 後 の発 生 能 に影 響 を及 ぼ す か 否 か を検 討 した が 、 対 照 区 と比 べ て 大 差 は認 め られ な か った 。 本 実 験 で は 、 卵 胞 卵 の成 熟 培 養 に用 い る5%CS加TCM199へ. の性 腺 刺. 激 ホル モ ン 、 各 種 成 長 因 子 お よ び シ ステ ア ミ ンの 添 加 が 核 移植 卵 の 体 外 発 生 能 に 及 ぼす 影 響 を検 討 した が 、分 割 率 な らび に胚 盤 胞 へ の発 生 率 は対 照 区 と大 差 な い こ とが 判 明 した 。. ・.
(15) 第3章. 体 外 培 養 液 へ の β一 メル カ フ トエ タ ノー ル の 添 加 が 核 移 植 卵 の 発 生 能 に及 ぼ す影 響. 前 章 にお い て 、 卵 胞 卵 の成 熟 培 養 に 用 い る5%CS加TCM199液. へ の性. 腺 刺 激 ホ ル モ ン、 成 長 因 子 お よ び シ ス テ ア ミ ンの 添 加 が 核 移 植 卵 の 体 外 発 生 能 にお よ ぼ す 影 響 を検 討 した 結 果 、 分 割 率 な らび に胚 盤胞 へ の発 生 率 は対 照 区 と 大 差 な い こ と が判 明 した 。 ウ シ受 精 卵 を体 外 で培 養 す る と8細 止す る"invitro8-cellblock"現 First,1991)が. 胞 期 で 発 生 を停 象(Barnesand. み られ る。 そ の た め 、 体 外 受精 卵 は卵 丘 細 胞,卵. 管上 皮細胞 な. どと 共培 養 す る こ と に よ っ て 発 生 阻害 が解 除 さ れ 、 受 胚 牛 へ 移 植 可 能 な 後 期 桑 実 胚 ∼ 胚 盤 胞 期 へ 発 生す る(福. 田,1992;梶. た 最 近 、Takahashieta1.(1993)は. 原 ら,1987;新. 田 ら,1993)。. ま. 、 卵丘 細 胞 との共 培 養 で 得 られ た 体 外 受. 精 由来6∼8細. 胞 期 ウ シ 胚 をチ オ ー ル 化 合 物 で あ る β一 メル カ プ トエ タ ノー ル. (β 一ME)を. 添 加 した 非 共 培 養 培 地 で体 外 培 養 す る と、 共 培 養 を継 続 した 場. 合 と 同程 度 に 胚 盤 胞 へ 発 生 す る こ と を 明 らか に した。 そ こで 、 本 章 は β 一ME 添 加 培 地 を 用 いて 、非 共 培 養 条 件 下 で 核 移 植 由来 の8∼16細. 胞期 胚 の体外培. 養 が 可 能 か 否 か を検 討す る こ とを 目的 に実 施 した。. 第1節. 1.体. 材料 と方 法. 外 受精 と ドナー 胚 割 球 の作 出. 卵 巣 か ら採 取 した 卵 胞卵 を第2章 で22時. に した が って 、5%CS加TCM199液. 間 成 熟 培 養 後 、 あ らか じめ受 精 能 を獲 得 させ た 精 子 浮 遊 液 に5時. して 体 外 受 精 を行 っ た。 つ いで 、10μ1の 199液. へ 移 して117時. 卵 丘 細 胞 を含 む5%CS加TCM. 問 目 まで 培 養 し、8∼16細. 部 の 胚 は 、 核 移 植 に用 い る た め0.5%プ 一9一. 間移. 胞期へ 発育 させ た。一. ロナ ー ゼ 加PBS液. へ 移 して 透 明 帯.
(16) を溶 解 後 、 ヒヘ ッテ ィ ン グ操 作 を く り返 して 単 一 割 球 と した 。. 2.レ. シ ピエ ン ト卵 子. 卵 胞 卵 を22∼24時. 間体 外 で 成 熟 培 養 し、 第2章. に従 っ て 第2減. 期 染 色 体 を除 去 した 。 染 色 体 除 去後 、5%CS加TCM199液 培養 開始 後33時. へ 戻 して 成 熟. 問 目 まで さ らに培 養 し、つ い で 単 為 発 生 刺 激 を あ た え た 。す. な わ ち 、 除 核 未 受 精 卵 をZimmerman液. に 浸 して10分. 後 、 融 合 用 平 行 チ ャ ンバ ー 内 のZimmerman液 mm、50μsecの. 直 流 パル ス を1秒. 2章 の方 法 に従 っ て ドナ ー 割 球1個 TCM199液. 数分裂 中. 間 隔で2回. 間平衡 させ た. へ 移 して 、100V/ 通 電 した 。 電 気 刺 激 後 、 第. を 除核 卵 子 の 囲 卵 腔 に注 入 し、5%CS加. に 戻 して 体 外 成 熟 培 養 開始 後42時. 間 に相 当す る時 期 まで さ ら. に 培 養 した 。. 3.核. 移 植お よび核移植 卵の培養. 第2章. の方 法 に 従 っ て 、 単 一 割 球 を除 核 卵 子 の 囲 卵 腔 へ注 入 後 、膜 融 合 を レ. シ ピエ ン ト卵 子 の 成 熟 培 養 開始 後42時 わ ち 、 操 作 卵 をZimmerman液. 間 目 に相 当す る 時期 に実 施 した 。 す な. μsecの. 直 流 パ ル ス を1秒. B(7.5μ1/mDを. へ移 して 平 衡 後 、100V/mm、50 間 隔で2同. 与 えた 。 電 気 刺 激 後 、 サ イ トカ ラシ ン. 含 む5%CS加TCM199液. の確 認 され た 卵 子 の み を卵 丘 細 胞 を含 む10μ1の. で1時. 間培養後 、融合. 発 生 培 地 に4∼5個. ずつ移 し. た。. 4.β. 一 メ ル カ プ トエ タ ノー ル添 加 の影 響. 対 照 区 と して 用 いた 体 外 受 精 卵 の 場 合 は、 卵 丘 細 胞 と117時 ∼16細. 間 共 培 養 後8. 胞 期 へ 発 育 して い る 胚 を 、 ヒ アル ロニ ダ ー ゼ 添加M2液(Fu辻tonand. Whitti㎎ham,1978)中. で ピペ ツテ イ ン グ操 作 を く り返 して 卵 丘細 胞 を完 全 に 1. 40一.
(17) 除去 した 。 つ い で 、 数 回5%CS加TCM199液 aメ. ル カ フ トエ タ ノー ル(a-ME)を. に移 しか え た 後 、10μM. へ 移 して5日. 添 加 した5%CS加TCM199液. 間 非 共 培 養 下 で 体 外 培 養 を行 った 。. 核 移 植 卵 の 場 合 は 、 卵 丘細 胞 と共培 養後72時. 問 目の検 査 で8∼16細. 発 育 して い る 胚 を用 い て 、 体 外 受 精 卵 の 場 合 と 同様 に10μMβ 地 で7日. 胞期へ. 一ME添. 加培. 間体 外 培 養 を行 った 。 な お 、 いず れ の場 合 も、 卵 子 の周 りに 付 着 す る. 卵 丘細 胞 を一 旦除 去 した の ち 、 卵 丘 細 胞 を含 む 同一 一の発 生 培 地 へ 再 び 戻 して さ ら に5ま. た は7日. 間 共 培 養 を行 う区 を設 けて 、a-ME添. 加 区の胚盤 胞へ の発. 育 率 と比 較 した 。 また 、 得 られ た結 果 は 、%2検. 定 で 有 意 差 の 有 無 を検 査 し た。 な お 、 体 外 成. 熟 培 養 お よ び 体 外 受 精 卵 な らび に核 移 植 卵 の培 養 はす べ て5%CO2、95% 空 気,38.5℃. 第2節. の 条 件 で 実 施 した 。. 実験結 果. 本 実 験 にお け る 体 外 受 精 卵 の8∼16細 295)で 47%が. あ った 。 これ らの 胚 を10μMβ. 胞 期 へ の発 生 率 は37%(108/ 一ME添. 加 培 地 で 培 養 した と こ ろ. 胚 盤 胞 期 へ 達 し、 これ は 共 培 養 を継 続 した場 合 の発 生 率37%と. 大差. が み られ な か った(表2)。 ま た 、 本 実 験 系 に お け る ドナ ー割 球 と除 核 卵 細 胞 質 の融 合 率 は74%(23 0/314)で. あ り、 この うち32%(74/230)が8∼16細. 育 した 。 表2に. 示 す よ う に、 これ らの 核 移 植 胚 を非 共 培 養 下 の β 一ME添. 地 へ移 した と こ ろ胚 盤 胞 へ の発 生 率 は24%と 意差 が み られ なか っ た 。. 一11一. 共 培 養 区(16%)に. 胞期 へ発 加培. 比 べて有.
(18) (卜 寸 ). (㊤ 一 ). (寸 eq ). り H. 一 N. ㊤. ①. ゆ 寸. 卜 oっ. 卜 oO. oO 寸. (卜 oっ ). ㊤ 一∼ oO. ( ー) 簾 ( +)裡 e 農 雅. 菅 国 ΣY Q Σ ミ 〇 一. 凶. °q 榔. .. 肛叡 賦 鋒. 埋 論逼. 癬 曇 課 e 刃留 累因 尽 . 楚 P 凶 暴 雅 廉 国Σ 1 範 静. ( 訳) 蕪盈釧課. 寵趣. 團罧囲羅. eイ 曇 繭 塩. (国 Σ i 範) ムへー ＼ 鉱 H ム ゜ 卜 只 ムへ凶 ー 噴. や 麺 % 興 U価 姐劃 課 煮 葦 e 遠 職 姻琶 礁⑩ 州∼ ○○快 田 鯉 譲 逼 筍 % 醤 翼 駆 鼠 葦 あ 心. 蜘醸e. 1十1十. ⑫.
(19) しか しな が ら、 β一ME添. 加 非 共培 養 区 、 無 添 加 共 培 養 継 続 区 の い ず れ にお. い て も体 外 受 精 卵 の 発 生 率 は 、 核 移 植 卵 の 発 生 率 に比 べ て 有 意(p<0 5)に. .0. 高 か っ た(37対16%,47対24%)。. 第3節. 考察. 本 実 験 結 果 か ら、卵 丘細 胞 との 共 培 養 下 で8∼16細 胚 を β一ME添. 胞 期 へ 発 育 した 核 移 植. 加 培 地 へ 移 して 非 共 培 養 下 で培 養 す る と、 体外 受 精 胚 と同 様 に. 共 培 養 下 で 培 養 を継 続 した 場 合 と 同程 度 の割 合 で胚 盤 胞 へ 発fす した 。 非 共 培 養 下 で ウ シ体 外 受 精 卵 を体 外 培 養 す る と8細. る こ とが 判 明. 胞期 で 発 生 が 停 止 す. る(BarnesandFirst,1991)。Takahashietal.(1993)は10∼50μM β一ME添. 加 培 地 で6∼8細. 胞 期 胚 を培 養 す る と、 そ の24∼35%が. 胚 盤胞. へ発 生 す る こ と、 また この 効 果 は細 胞 質 内 の グル タチ オ ン濃 度 の 上 昇 と関 係 し て い る こ と を報 告 した 。 体 外 受 精 由来 の8∼16細 へ核 移 植 して"初. 期化"し. 胞 期 胚 の核 を除 核 未 受 精 卵. た 核 移 植 卵 を用 いた 本 実 験 で も、 この 効 果 が 確 認 さ. れ た。 本 実 験 にお け る ドナ ー 核 と除 核 卵 細 胞 質 の 融 合 率(74%)お の8∼16細. 胞 期 へ の 発 育 率(32%)を. よび核移植 卵. 計算 に入 れ る と、 核 移 植 に 供 試 した. 除核 卵 子 の う ち、 わ ず か5.7%し. か 胚 盤 胞 へ は発 育 しな か っ た こ と にな る 。. また 、 核 移 植 胚 にお け る8∼16細. 胞 期 か ら胚 盤 胞 へ の 発 育 率 は 、 対 照 と した. 体 外 受 精 由 来8∼16細 一MEを. 胞 期 胚 の 胚 盤 胞 へ の発 育 率 に 比 べ る と、 共 培 養 で も β. 添 加 した 非 共 培 養 で も有 意 に低 い割 合 で あ っ た 。 した が っ て 、核 移 植. によ る ク ロー ンウ シ作 出 技 術 を実 用 化 す るた め に は 、そ れ ぞ れ の ス テ ップ ご と の 成 功率 を 高 め る と と もに 、核 と細 胞 質 との 相 互 関 係 を解 明す る こ と に よ って "正 常胚"を. よ り多 く複 製 す るた め の核 移 植 系 を確 立す る 必要 が あ る と考 え ら. れ る。 一13一.
(20) 第4章. ドナー 胚の 日齢 が核移植卵の発 生能 に及 ぼす影響. ウ シ卵 子 の核 移 植 にお け る ドナ ー 胚 は過 剰 排 卵 牛 か ら回収 され た あ る い は体 外 受 精 後 、 体 外 で 発 生 さ せ た3∼6日 1987;Westhusineta1.,1991)。. 齢 胚 が 使 用 さ れ て い る(Robletal., しか しな が ら、 核 移 植 卵 の 発 生 能 にお よ ぼ. す ドナ ー 胚 の 日齢 の影 響 は 明 らか で は な い 。Pratheretal.(1987)は で は な く ヒ ツ ジ結 紮 卵 管 内で 培 養 して 得 た2∼8細 る い は17∼32細. 胞 期 、9∼16細. 、体外 胞期 胚 あ. 胞 期 胚 の割 球 を用 いた 核 移 植 卵 の発 生 能 に は差 が 認 め られ. な い こ と を 報 告 して い る。 牛 島 ら(1991)は. 、8∼64細. 胞 期 胚 の割 球 を 用 い. た核 移 植 卵 の体 外 で の発 生能 を検 討 して い るが 、 胚 盤 胞 へ の 発 生 が 全 く認 め ら れ て い な い た め 差 が あ る か ど うか 明 らか で は な い 。 そ こで 本 章 で は 、 ウ シ核 移 植 卵 の体 外 で の発 生 能 にお よ ぼ す ドナ ー 胚 の 日齢 の 影 響 を検 討 した 。. 第1節. 1.ド. 材料 と方 法. ナ ー 胚 お よ び レシ ピエ ン ト卵 細胞 質. ドナ ー 胚 は 、 第2、3章. に した が っ て卵 胞 卵 を体 外 成 熟 ・体 外 受 精 後 、体 外. 培 養 に よ って 作 出 した 。 す な わ ち 、24時. 間 成 熟 培 養 した 卵 胞 卵 を、 あ らか じ. め 受 精 能 を獲 得 さ せ た 精 了 浮 遊 液 へ 導 入 し、5時 精 子 浮 遊 液 か ら回 収 し、5%CS加TCM199液 細 胞 と3.5∼7.5日. 間 媒 精 した 。 媒 精 後 、 卵 子 は あ る い はCRlaa液. で卵 丘. 間 共 培養 した 。. レ シ ピ エ ン ト卵 細 胞 質 は 、20∼24時. 間 成 熟 培 養 した 卵 胞 卵 の 卵 丘 細 胞. を 、 ピア ル ロ ニ ダ ー ゼ 添 加PBS液. 中 で ピペ ツテ イ ング によ り除 去 した 後 、 第. 1極 体 を有 す る 卵 子 を選 び 第2章. の方 法 に従 って 染 色体 を除 去 した 。 除 核 卵 子. は 、Zimmerman液. で 覆 った 融 合 チ ャ ンバ ー へ 移 し、 成 熟 培 養 開始 後 一14一.
(21) 24時. 間 目 に20V/rnrnの. 直流 ハ ルス を20μsec、15分. 間 隔 で3回. え て 活 性 化 を 誘 起 した 。 活 性 化 刺 激 後 、卵 子 は10μ9/m1シ ドを含 む5%CS加TCM199液. 2.核. で6時. ク ロヘ キ シ ミ. 間 培 養 した 。. 移 植 お よび 核 移 植 卵 の 培 養. 体 外 培 養 後3.5∼6.5日. 目の ドナ ー 胚 の透 明 帯 を0.5%プ. ロナ ー ゼ 溶. 液 で 溶 解 し、 つ い で ピペ ッテ ィ ング に よ り割 球 を単 離 した 。7.5日 胞 内 細 胞 塊(ICM)細 Mgイ. 与. 胞 は 、18G注. オ ンを 含 まな いPBS液. 常 な 形 態 を示 すICM細. 目の 胚 盤. 射 針 を用 いて 機 械 的 に分 離 後 、Caと. 中 で ピペ ッテ ィ ン グ に よ り単 離 した 。 な お 、 正. 胞 の み を核 移 植 に使 用 した 。. ドナ ー 胚 か ら単 離 した 単 一 割 球 あ る いは 単 一 細 胞 は、 透 明帯 の 切 り込 み を通 して 除 核 未 受 精 卵 の 囲卵 腔 へ 注 入 した 。 注 入 卵 子 は 、成 熟 培 養 開始 後30時 目に 、Zimmerman液. へ 移 した 。 ピペ ッ トを使 用 して 細 胞 の 接 着 面 が 電. 極 と平 行 に な る よ う に静 置 し、 割 球 を 用 いた 場 合 は100V/mmの スを 、ICM細. 問. 胞 で は100∼700V/mmの. 直流 パル. 直 流 パ ル ス を50μsec与. えて 膜 融 合 を 誘 起 した 。融 合 卵 は 、成 熟 培 養 で 使 用 した培 地 へ 戻 し、 空 気 中5 %COg、38.5℃. 第2節. の条 件 下 で10日. 間 卵 丘 細 胞 と共 培 養 した 。. 実 験結果. TCM199液. あ る い はCRlaa液. 精 胚 の細 胞 数 は 、6.5日. 間 培 養 した 体 外 受. 齢 胚 を除 い て いず れ の 日齢 で も培 養 液 間 で 大 差 は み. られ な か った(表3)。6.5日 細 胞 数(47.5)は. で3.5∼6.5日. 齢 胚 の場 合 に、CRlaa液. 、TCM199液. を用 いた 場 合(28.8)に. 意 に 高 か った 。 しか しな が ら、TCMl99液. とCRlaa液. を用いた場 合 の 比べ て有 で 培 養 した ドナ. ー 胚 を用 い た場 合 の 核 移 植 卵 の発 生 能 は 、 用 い た 培養 液 に よ って 大 差 が み られ 一15一.
(22) (寸N) 一 .Q 刑 寸 .QO. 態 ロ ゆ. 卜. ( 寸). も ぜ 刊 ゆ. 卜寸 ( 寸 ) "卜 . ゆ 制 oO .oON. 噛 ロ ゆ. ⑩. ( 寸 ) ◎つ . N 刑 ゆ. ⑩N (°っ ) N .c畑 制 O .oO N. 瞳 □ ゆ. ゆ. (ゆ O. .O > 傷 ). ( ゆ) ◎つ .oつ 刑 Q .oO 一 (寸 ) ㊤ .一 制 ゆ .ゆ 目. 噛 m ゆ. 寸. (① ). O .寸 刊 ◎○ . 寸一. ( ト). ① .H 刊 ⑩ .一 H. 覇 □ ゆ .°○. 麟蜜細隼. (). 燵獺嘗. ①①一. 邸邸一銘 9. 9裡 欄 麺 斡 起 窪 典 建 蝋 鰹 匝. ( 欄 瞳 斜 駆 刑斡 降 ) 癒型累-玉 忽. 魏 醸 e燵 獺 蝉や 廻 函 起蝋 留 累 e農 -弘 忽 . °○榔. 一16一.
(23) (り )oO. (O )O. (O。○)專. (O◎う)O寸. (器 )自. ρ(oO⑩)o自. ( 寸 ト)◎○①. (◎うト)O°っ. 斎 一 .cq 制 寸 .oO. 。○. c測 .目 制 H .卜 ㏄. 寸N. ゆ. 寸. ゆ .ゆ. ゆ .⑩. ゆ .卜. (ゆ O .O> 山 ) O裡 網 額 に 2 誕 ⑫ 建 蝋 聾 匝. . 愈 畏 喫 ○ 槍 簑 聖 累 喫 ○ 拐 の レ D 駆 鰹 U心 壇鎧 余 菅. 。っ。。H＼①寸 肖＼N。○ 目. 卜. QO .N 料 O .卜 目. ㎝ .① 刊 O .ゆ oつ. 目. ①. 麟墨. e團 -承 鉱. 麟儀郵. e翼 -承 ユ. 態ロ. ゆ .◎っ. ( 訳) 蕪 愚嘱 趣 ＼. 細鰹. 邸 (oO。○)寸 。O H＼ ぢ. o(卜○○)㊤9 ＼①9. OH. 無 民如 遜. ( 網 塵 糾 腿 制興 降 ). N .N 制 ㎝ .oう H. 邸 (㎝。○)。うO㎝＼卜㊤ H. "(QO卜)8. ρ(§. ゆ 3 P J艇 如 藩 里 累 喫 ○慮 和 避 信 旺埋. 邸(① )ゆ一. 詞余. 邸 (一・○)り。っH. (⑩ ト)°○ °○. (寸oっ)卜。○. 型 羅 ○○. (寸 。っ)㊤ゆ. 邸(= )臼 o (O H)㊤ H. 型期墨. (訳 ) 蕪 忌 岬 課. 灘 醸 e 輩 □ e 農 - 弘 ユ や 廻 % 翼 9 濃 調 課 e 愚 埋 漣 箪 ら 心 .寸榔. 一17一.
(24) な か った こ とか ら、 両 者 の デ ー タ を合 わ せ て 表4に 未 受 精 卵 との 融 合 率 は 、3.5∼6.5日 8∼88%)。. 齢 胚 の 間 で 差 は見 られ な か った(7. 核 移 植 に使 用 した 内細 胞 塊 の 平 均 細 胞 数 は 、 胚 盤 胞 あ た りS. 4±2.4個 %)は. 示 した 。 ドナ ー 割 球 と除 核. で あ っ た 。 レシ ピ エ ン ト卵 細 胞 質 とICM細. 胞 の 融 合 率(28. 、 他 の 日齢 の ドナ ー 胚 で 得 られ た融 合 率(78∼81%)よ. りも有 意 に. 低 かった。 核 移 植 卵 の分 割 率(73∼81%)お %)は. 、5.5日. よ び8細. 胞 期 へ の 発 生率(22∼34. 齢 胚 を用 いた 場 合 の分 割 率(68%)を. 齢 間 で 有 意 差 はみ られ な か った 。3.5∼6.5日. 除 い て ドナ ー 胚 の 日 齢 胚 を ドナ ー 割 球 と して 用. い た 場 合 の 、 胚 盤 胞 へ の発 生率 は 、 ドナー 胚 の 日齢 問 で 有 意 な差 は 認 め られ な か った が 、ICM細. 第3節. 胞 を用 い た場 合 胚 盤 胞 へ の発 生 は全 く認 め られ な か った 。. 考察. 3.5∼6.5日. 間 体 外 培 養 した体 外 受精 胚 の 割球 を融 合 した 除 核 未 受精 卵. の体 外 で の 発 生 能 は 、・ ドナ ー 胚 の 日齢 に影 響 され な か った 。 核 移 植 卵 が 正 常 に発 生 す る た め に最 も重 要 と考 え られ る 要 因 は、 レ シ ピエ ン ト卵 細 胞 質 と 融 合 した ドナ ー核 が受 精 時 の状 態 へ 転 換 され る(初 か と い う点 で あ る 。 マ ウ ス8細. 胞期 胚 の核 を除 核2細. 期 化)か. どう. 胞 期 胚割 球 と融 合 させ た. 場 合 に 、 核 移 植 卵 は 体 外 で 胚 盤 胞 へ 発 生 し、 受 胚 雌 へ 移 植 後 低 率 で は あ るが 産 子 へ と発 生 す るが 、 コ ンパ ク シ ョ ンは8∼16細. 胞 期 で は な く4細. る こ とが 報 告 さ れ て い る(Tsunodaetal.,1987b)。 の 核 は2細. 胞 期で起 こ. この こ とは 、8細. 胞期胚. 胞 期 胚 の 細 胞 質 内 で 完 全 に は 初 期 化 さ れ て い な い こ と を示 して い. る 。 核 移 植 卵 の 発 生 能 に影 響 す る他 の 重 要 な 要 因 と して 、 ドナ.__..核 の細胞周期 と レ シ ピエ ン ト卵 細 胞 質 の 状 態 の組 み 合わ せ が 指 摘 され て い る(Campbellet a1.,1996a)。. 青 野 ら(1994)は. 、116時. 間培 養 した 体 外 受 精 胚 由来 割 球 を. 融 合 した ウ シ核 移 植 卵 の 胚 盤 胞 へ の 発 生能 は、68.92あ 一1$一. る い は140時. 間.
(25) 培 養 した 胚 由来 の割 球 を用 い た 場 合 よ り高 い こ とを 報告 して い る 。 同氏 らの結 果 は 、 異 な る発 育 ス テ ー ジ で ドナ ー 核 の細 胞周 期 が 異 な る た め にそ の よ うな 相 違 が 生 じた こ と を示 唆 して い る。 本 実 験 で は 、 ドナ ー 割 球 は、 あ らか じめ 単 為 発 生 刺 激 を与 え た 除 核 未 受 精 卵 へ 融 合 した 。そ の た め 、 ドナ ー 核 の 核 膜 は 消 失 せ ず 早 期 染 色 体 凝 集(PCC)を. 示 さ な い が 、 融 合 後 に核 の 直 径 は 増 加 す る. (T8kanoeta1.,1996)。Prathereta1.(1987)は した2∼32細. 、 結 紮 ヒ ツ ジ卵 管 で 培 養. 胞 期 胚 の割 球 を融 合 した 除 核 未 受 精 卵 の発 生能 は 、 ドナ ー 胚 の. 日齢 に よ っ て 大 差 な い こ とを 報 告 して い る。 同氏 ら(Pratheretal.,1987) は、 除 核 未 受 精 卵 へ融 合 後 の ドナ ー 核 の動 態 は調 べ て い な い が 、 レ シ ピエ ン ト 卵 細 胞 質 と して 体 外 成 熟 あ る い は 排 卵 直 後 の卵 子 を使 用 して い る た め お そ ら く 核 膜 は消 失 してPCCを. 生 じて い る と思 わ れ る(CampbelletaL,1996a)。. 本 実 験 結 果 とPratheretal.(1987)の 2∼35細. 報告 か ら、 体 内 あ る い は 体 外 受 精 した. 胞 期 ウ シ胚 の核 は 、核 膜 崩 壊 とPCCが. 誘 起 され る か ど うか に 関 わ. らず 核 移 植 後 に レシ ピエ ン ト卵 細胞 質 中 で 初期 化 され る こ とが 明 らか で あ る 。 両 生 類 にお け る 核 移 植 実 験 で は、 核 移 植 卵 の 発 生 能 は 核 を採 取 した組 織 の 発 育 ス テ ー ジ が進 む に つ れ て 低 下 す る こ とが 知 られ て い る(Gurdon,1986)。 ヒツ ジ(SmithandWilmut,1989)、. ウ シ(CollasandBarnes,1994;. Keefereta1.,1994;Zakhartchenkoeta1.,1996)、 Robl,1991)や. マ ウ ス(Tsunodaeta1.,1989)胚. ウサ ギ(Collasand 盤 胞 のICM細. 胞 を核 移 植. した 未 受 精 卵 の一 部 は体 外 で 胚 盤 胞 へ 発 生 す る。 さ らに 、 ウサ ギ の 場 合 を 除 い て 、 これ らの核 移 植 卵 は 受 胚 雌 へ移 植 後 産 子 へ 発 生 す る。 す な わ ち 、ICM細 胞 の 核 は 、 除 核 未 受 精 卵 内 で 受 精 の 時 点 へ と初 期 化 され 得 る こ と を 示 して い る。 本 実 験 で は 、ICM細. 胞 を 核 移 植 した 場 合 胚 盤 胞 へ の 発 生 は認 め ら れ な. か っ た が 、 そ の主 な原 因 は核 移 植 卵 の 全 体 的な 発 生 率 が 低 か っ た た め と考 え ら れ る 。 また 、 本実 験 で 用 いたICM細. 胞 の生 存 性 が 低 か った こ とや 栄 養 外 胚 葉. 細胞 が 混 入 して い た 可 能 性 が 考 え られ る。. 一19一.
(26) 第5章. レシ ピエ ン ト卵子の凍結保存が核移植卵 の発生能 に及 ぼす影響. マ ウ ス 未 受 精 卵 子 の 凍 結 保 存 が 可 能 で あ る と い う最 初 の 報 告(Tsunodaet a1.,1976;Whittingham,1977)以. 来 、 ウ シ卵 子 の凍 結 保 存 に 関す る研 究 が 幾 つ. か 報 告 さ れ て い る。 ま た 、 凍 結 ・融解 卵子 を体 外 受 精 後 、 受 胚 雌 へ 移 植 す る こ とに よ って 子 ウ シ が 生 産 され て い る(Fukueta1リ1992;Hamanoetal., 1992;Otoieta1.,1992)が. 、体 外 受 精 お よ び 体 外 培 養 後 の 発 生 率 は 、. Martinoeta1.(1996)の. 報告 を除 いて 概 して 低 い 。 そ の原 因 と して 、凍 結 操. 作 が 卵 子 の 細 胞骨 格 で あ る チ ュー ブ リン と ア クチ ン構 造 を破壊 す る こ と に よ っ て 、 減 数 分 裂 の完 了 に 必 要 な 紡 錘 体 を分断 させ 、 染 色 体 を分 散 さ せ る た め と考 え られ て い る(Glenistereta1.,1987;AmaraandParks,1994)。. さ ら に、. 凍 結 保 護 剤 は未 受 精 卵 の表 層 穎 粒 の放 出 を 誘 起 し、透 明 帯 を硬 化 させ る こ と に よ って 受 精 を 阻 害 す る可 能 性 が 指 摘 さ れ て い る(CarroUeta1.,1990;Fukuet al.,1995)。. 一一方 、 ウ シ卵 子 の核 移 植 で用 い る ドナ ー 割 球 は 、 あ らか じめ染 色. 体 を除 去 した 第2減. 数 分 裂 中期 の 卵子 へ融 合 す る 。 筆 者 の知 る限 りで は 、 ウ シ. 除核 未 受 精 卵 の 凍 結 保 存 に関 す る報 告 は これ まで み られ な い。 そ こで 本 実 験 で は 、1)活. 性 化 刺 激 前 あ る い は刺 激後 に凍 結 融 解 した 除 核 未 受 精 卵 へ 融 合 した. 核 移 植 卵 の 発 生 能 、2)凍. 結 融 解 後 の 核移 植 卵 の発 生 能 に及 ぼす レシ ピエ ン ト. 卵 子 の卵 齢 の 影 響 お よ び3)凍. 結 融解 卵子 由来 核 移 植 胚 の継 代 核 移 植 の影 響 を. 検 討 した 。. 第1節. 1.ド. 材料 と方法. ナ.___胚お よ び レ シ ピエ ン ト卵細 胞 質. 屠 殺 場 由 来 の卵 巣 か ら得 られ た 卵 胞 卵 は 、 ミネ ラル オ イ ル で 覆 っ た5%CS 加TCM199液. で 空 気 中5%CO2、38.5℃ 一24一. の条 件 下で18∼24時. 間.
(27) 成熟 培 養 した 。' ドナ,_..._.胚 は 、第2章. の方 法 に従 っ て体 外 成 熟 ・体 外 受 精 ・体 外 培 養 に よ っ て. 作 出 した 。 す な わ ち24時 気 中5%CO2、38.5℃. 間体 外 成 熟 させ た卵 胞 卵 は、 精 子 浮 遊 液 へ 導 入 し空 の 条 件 下 で5時. 浮 遊 液 か ら回収 し5日. 間 媒 精 した 。 媒 精 後 、 卵 子 を精 子. 間卵 丘細 胞 と共 培養 した 。 ドナー 胚 の透 明 帯 は 、0.5. %プ ロナ ー ゼ 溶 液 で 溶 解 し、 つ いで ピペ ッテ イ ン グ に よ り割 球 を単 離 した 。 レシ ピエ ン ト卵 細 胞 質 は 、18∼20時. 間 あ る い は22∼24時. 培 養 した 成 熟 卵 子 の卵 丘 細 胞 を 、 ピ アル ロニ ダー ゼ 添加PBS液 ィ ン グ に よ り裸 化 し、 第1極. 中で ピペ ツテ. 体 を有 す る卵 子 の み を選 び第2章. 染 色 体 を除 去 した 。 除 核 卵 子 は 、5%CS加TCM199液. 間体 外成 熟. の 方 法 に従 っ て で活 性化刺 激 あ る. いは 凍結 保 存 時 まで 培 養 した 。. 2.レ. シ ピエ ン ト卵 子 の 凍 結 保 存. 除 核未 受 精 卵 は 、sOMあ %CS溶. 液 中 で 室 温 で15分. る い は1.5Mグ. リセ リ ン を含 むPBS+20. 間平 衡 した 。 つ いで 、0.25ml精. 液 凍結用 ス. トロー へ 耐 凍 剤 と と も に 入 れ て 封 入 した 。 卵子 の入 っ た ス トロー は 、1.OM グ リセ リン の場 合 は ∼5.1℃. 、1.5Mの. 場 合 は 一6.5℃. に 設 定 した プ ロ. グ ラム フ リー ザ ー の エ タ ノー ル バ ス へ 投 入 し、 植 氷 後 これ らの 温 度 で15分 持 した 。 つ い で 、1.OMグ 5℃ へ 、1.5Mの らの温 度 で10分. リセ リンの 場 合 は0.3℃/分. 場 合 は0.5℃/分. で 一35℃. の速 度 で 一32.. へそ れ ぞ れ 冷 却 した 。 これ. 間 保 持 後 、 ス トロー を液 体 窒 素 へ 移 し24時. 間 か ら3週. 存 した。 凍 結 保 存 後 、 ス トロー は液 体 窒 素 か ら取 り出 して 空 気 中 で5秒 後 、37℃. の微 温 湯 へ30秒. 浸 漬 して 融解 した 。 グ リセ リン は 、0.5Mシ. ー ク ロー ス 添 加20%CS加PBS液. 保. 間保. 間保 持 ュ. を用 い て 段 階 希 釈 法 に よ っ て 除 去 した. (Limetal.,1991}o. 一21一.
(28) 3.凍. 結 ・融 解 時 期 の 影 響. 活 性 化 刺 激 前 あ る い は刺 激後 に凍結 ・融 解 した 除 核 未 受 精 卵 を使 用 した核 移 植 卵 の 体 外 発 生 能 を検 討 した 。 図1に 未 受 精 卵 は 成 熟 培 養 の30時 TCM199液. 示 す よ う に、 活 性化 刺 激 前 区 で は 、 除 核. 間 目に凍 結 保 存 し、 融解 後3時. 間5%CS加. で 培 養 後 形 態 的 に正 常 な もの を選 び 、20V/mmの. 0μsec問. 通 電 して 活 性 化 刺 激 を与 え た 。 さ ら に 、8∼9時. 割 球 を注 入 し、100V/mmの. 直 流 を50μsec間2回. 直 流 を2 間 培 養 後 ドナ ー 通 電 して 融 合 し. た。 一方 、 活 性 化 刺 激 後 区 で は 、 除核 未受 精 卵 に 成 熟 培 養 後33時 化 刺 激 を 与 え 、39時. 問 目に凍 結 保 存 を行 っ た。 融 解 後3時. 問 目に 活 性. 間 培 養 し、 形態 的. に正 常 な 卵 子 を選 抜 して ドナー 割 球 を注 入 し、 融 合 刺 激 を与 え た 。 両 区 と も融 合 卵 は、5%CS加TCM199液. で卵 丘 細 胞 と10日. 間共 培 養 して発 生 能 を. 検 討 した 。 な お 、対 照 と して 凍 結 融解 を行 わ な い除 核 未 受 精 卵 を 用 い て 同様 の 核 移 植 を行 い 、 発 生 能 を検 討 した 。. 4.卵. 齢 の影 響. 図2に. 示 す よ う に、 除 核 未 受 精 卵 と して 成 熟 培 養22時. い は32.5時. 間 目の 若 齢 卵 子 あ る. 間 目の 過 齢 卵 子 を用 い凍 結保 存 後 核 移 植 を行 っ て 発 生 能 を比 較. した 。 す な わ ち 、 融 解 後 、1.5時. 間培 養 して 形 態 的 に 正 常 な 卵 子 に電 気刺 激. を 与 えて 、 活 性 化 を行 った 。 若 齢 卵 子 の場 合 は成 熟 培 養 後23.5時. 問 目、 過. 齢 卵 子 の 場 合 は33時. 問 目に相 当す る。 つ いで 、 若 齢 卵 子 の 場 合 は 、活 性化 刺. 激後10μg/mlシ. ク ロ ヘキ シ ミ ド加TCM199液. 培 養 し、 成 熟 培 養 の32.5時. で 割球 注 入 ま で9時. 間 目に融 合 刺 激 を 与 えた 。 過 齢 卵 子 の場 合 は 、. 活 性 化 刺 激 後 シ ク ロ ヘ キ シ ミ ド無 添 加 培 地 で 培 養 後 、成 熟 培養 の42時 融 合 刺 激 を与 え た 。 両 区 と も融 合 のみ られ た 卵 子 は 、5%CS加TCMl99 液 で卵 丘 細 胞 と10日. 間. 間 共 培 養 して 発 生 能 を検 討 した 。. 一22一. 問 目に.
(29) レシ ピエ ン ト卵 子. ドナー胚. ohr. 成熟培養開始. 成熟 培養 開始. 22-24hr. 染色体除去. 卵胞 卵 培養 後 の時 間. [活性化刺激後 区] ﹁. F. ↓ 融解. 激 刺 化 性 活. ﹁ヨ. 1. 活性 イヒ束唖激. 凍結. 39hr. 融解 ▼. 球. 融. 発生培養. 図1.凍. 結 時 期 の影 響. 一23一. ﹄. 割. 合. 42hr. 養 培 生 発. 1. 3°hr甲. 33hr. 1精 媒. 1. [活性化刺激 前区].
(30) 1卵月 包馴オ 培養 後 の時 間 Ohr [若 齢 卵 」 な区]. 18-20hr. 染色体除去. ↓ 22hr ▼. 染色体除去. 22-24hr. 融解 ▼ 23.5hr. 活 性 イヒ刺 激 ▼. 凍結. 34hr ▼. ▼. 割球融合. 32.5hr. 融解 r. 33hr. 、. 活性化刺激. 鴨. 42hr ▼ 弓. 発. 培. J. 図2.卵. 一24. 齢の影響. 養.
(31) 5.継. 代核 移 植 の影 響. 除 核 未受 精 卵 は 、成 熟 培 養 の22時 f区)。. 問 目に 凍結 保 存 を行 った(図2の. 融 解 後 、 形 態 的 に 正常 な もの を選 別 し、1.5時. 若 齢卵. 間体外 培養後 活性 化. 刺 激 を 与え た 。 つ い で 、 シ ク ロヘ キ シ ミ ド添 加5%CS加TCM199液 養後 、 ドナ ー 割 球 を注 入 し、 成 熟 培 養 の33時 代ll)。1世. で培. 問 目に融 合 刺 激 を 与え た(1世. 代 目 の核 移 植 卵 を培 養 後 、9∼20細. 胞期 へ 発 生 した 胚 を次 世代. の ドナ ー割 球 と して 使 用 した 。 す なわ ち 、 非 凍 結 卵 子 を レシ ピエ ン ト卵 細 胞 質 と して1世. 代 目 と 同様 の 条 件 で 核 移 植 した 。 融合 した 卵 子 は 、10日. 養 して胚 盤 胞 へ の 発 生 を検 討 した(2世. 代 目)。. な お 、 体 外 培 養 は空 気 中5%COg、38。5℃ 得 られ た 結 果 は 、x2検. 間体外 培. の 条 件 下 で 行 っ た 。.また 、. 定 あ る い はFisherの. 直 接 確 率 計算 法 に よ っ て 有. 意 差 の有 無 を 判定 した 。. 第2節. 表5に. 実験結果. 、 活性 化 処 概 前 あ る い は 処 置後 に凍 結 ・融 解 した 除 核 未 受 精 卵 を 使 用. した 核 移 植 卵 の 発 生能 を示 した 。 発 生能 は 耐 凍 剤 と して 用 いた グ リセ リ ン の 濃 度 に は影 響 さ れ な か っ た こ とか ら …括 して 表 示 した 。 凍 結 ・融 解 後 のiE常 な 形 態 を示 す 卵 子 の割 合 は 、 両 区 で 差 は 認 め られ な か っ た(43お 融 合 率 もま た 両 区 間 で 大 差 な か った(57お た 対 照 区(88%)と. よ び67%)が. よ び46%)。 、 新 鮮 卵 子 を用 い. 比 較 した 場 合 に いず れ も有 意 に(p〈0.05)低. た 。 活 性 化 刺 激 後 に凍 結 ・融 解 した 区 にお ける 分割 率お よ び8細 率(50お 〈0.05)低. よ び13%)は. 、 対 照 区(79お. よ び32%)と. かっ 胞 期 へ の発 生. 比 べ て 有 意 に(p. 下 した が 、 活 性 化 刺 激 前 に 凍結 ・融 解 した 区 にお け る8細. 胞期. へ の 発 生 率 は対 照 区 と 差 が 認 め られ な か っ た。 しか しな が ら、 いず れ の 処 理 区 にお いて も胚 盤 胞 へ の 発 生 は認 め られ な か った 。. 一25一.
(32) ( ち. )o. ρ(。 )○. に(㏄{)き. 型糊鵠. ρ(。っ一)寸 ⊇(8 )ゆH. ￡ (oゆ)旨. 嘉余. 邸(①卜)㊤コ. (寸㎝)⑩. q5(cqOう)昏. 鯉 羅 ○○. ( 訳) 藩愚遡課. ρ (卜㊤)ゆ寸 ＼o。う. ρ(トゆ)寸寸 ＼ゆcq. (09 )ト①. ト①. 巡麺喜 ヨ翠埋. (ゆ O .O> ﹂ ) Q に 釈 繭 麺 U 謳 ゆ 波 螺 堅 匝. (⑩寸)ゆ寸. .ゆ照. 凶. 毒避 演. 濫 誕 藻 撃 憩・ 艶. 麟患. 寸9. ( 訳) 藩器. 潔遜. (oO① )cq9. ( 訳) 藩民. 竪回. (σっ寸)寸寸. ( 訳) 藩風嬉趣＼. 粧固譲醗. "(㊤oO)①⑩H＼⑩三. 藩 愚 如誕. 獅 融 e 罧 盤 潔 遜 e 卵 鼠 ← 八 H 加 あ ム や 稲心 怒 U鮪紅釧 課 芯 葦 e 風 運 鐘 輕 あ 心. 26.
(33) 表6は. 、 凍 結 ・融解 した 除 核 未 受 精 卵 の核 移 植 後 の 発 生能 に お よ ぼ す 卵 齢 の. 影 響 を示 して い る 。 凍 結 ・融解 後 正 常 な形 態 を 示す 卵 子 の割 合 は 、 若 齢 卵 子 と 過 齢 卵 子 の 間 で 叢 は 見 られ な か っ た。 若 齢 区 にお け る凍 結 ・融 解 卵 子 の 融 合 率 は 、対 照 区 に比 べ て 有 意 に(p〈0.05)低. か った が 、過 齢 区 に お い て は 差. は 認 め られ な か った 。 若 齢 区 にお け る 分割 率 お よ び8細 区 に 比 べ て 有 意 に 低 か っ た(分. 割 率;41対71%、8細. 胞期 へ の 発 生 率 は対 照 胞 期;15対38. %)。. 過 齢 区 に お け る 分 割 率 も ま た対 照 区 よ り有 意 に低 か っ た(70対87. %)が. 、8細. 胞 期 へ の 発 生 率 に は 差 は 認 め られ な か っ た(26対38%)。. し. か しな が ら、凍 結 ・融 解 卵 子 を使 用 した 核 移 植 卵 の胚 盤 胞 へ の発 生 は 、 若 齢 区 で の み 観 察 さ れ た(2%)。 ち、2回. の実 験 で1個. な お 、 胚 盤 胞 は6回. 繰 り返 して 行 っ た 実 験 の う. ず つ 得 られ た 。. 凍 結 ・融 解 卵 細 胞 質 へ核 移 植 後 、8∼16細 ナ ー 胚 と して 用 い た 核 移 植 結 果 を表7に. 胞 期 へ発 生 した 胚 を2回. 示 した。 除核 未 受 精 卵 を凍 結 融 解 後 、. 正常 な 形 態 を 示 す 卵 子 の割 合 は36%(138/386)で. あ っ た 。 これ ら の. 卵 子 を レシ ピエ ン ト卵 細 胞 質 と して 用 い た核 移 植(1世 は94%で. 目の ド. 代 目)に. お ける融合 率. あ り、 新 鮮 卵 子 を使 用 した 場 合 と大 差 な か っ た。 分 割 率 、8細. 胞期. お よ び 胚 盤 胞期 へ の 発 生 率 は 、 いず れ も新 鮮卵 細 胞 質 を使 用 した 場 合 に 比 べ て 有 意 に(p<0.05)低 9%対3%)。. か っ た(62%対88%、50%対17%お. しか しな が ら、 凍 結 卵 細 胞 質 へ核 移 植 後 発 育 した 胚 の 割 球 を 、. 再 度 新 鮮 卵 細 胞 質 へ 融 合 した 場 合(2世 生 率 は1世. よ び1. 代 目)、. 代 目 に 比 べ て 有 意 に(p〈0.05)上. 分 割 率 お よ び8細. 胞期 へ の発. 昇 し、 新 鮮 卵 細 胞 質 へ 核 移. 槌 後 発 育 した 胚 の割 球 を再 度 核 移 植 に 用 いた 場 合 と比 べ て 大 差 が 見 られ な か っ た 。 しか しな が ら、 胚 盤 胞 へ の 発 生 率 は新 鮮卵 細 胞 質 へ 再 度 核 移 植 した 場 合 に お い て も2%と. 改 善 され な か っ た 。. 一27一.
(34) ρ(o )o. σ5 (ゆ 一)① H. (⑩N)曾. ㊦ (。○。っ)卜寸. ρ(oト)認. 扁余. ◎ゆ一. 卜寸. 邸(卜 。○)卜 〇 一. 訟 (ゆ H)ト 一 Q(§. )。q. ￡ (Oq. 訟 (ε. 邸 (・。 。。)。っ・。. 翻葭田帳Oo. " (。っ 州)・。。q. 潮螢酬劇樹塑. ( 訳) 鎌 忌超 課. ⊇( ①卜) ま. ＼苺. (ゆ QO)寸寸 一＼ σっeq 一. (寸◎○)oO°っ一＼⑩ =. ㊦( 寸 ①)ゆ。っN＼ = N. ( 訳) 麟 忌嘱 輩 ＼ 蝋愚如耀. (○○① )ゆ① H. oO曾. .㊤照. 凶. 湛蕪 覇湘. 纏遜. 避 簗 蓮唄. 潔迷. (ゆ O .OV へ ) 9に 網 噸 に 起 謳 即 建 蝋 聾 匝. (QO寸) 寸①. 藩忌. 寸 ○○寸. ( 訳) 蝋民 ( 訳) 麟民. 潔遜. (°っ寸)①①一 (ゆ① )eq⑩寸. 軽回. 荘H顯漣. 魏 醸 e 潔 遜 筍 % 翼 還 風 e 砧 尽 ム 八 H 卸 あ ム や 麺 怒 U鏑￠劃 課 e 尽 翠 譲 逼 あ 心. 一28一.
(35) )。。. の (cq ){. (。。. 鼠. ρ (。心⑩)①⑩. ρ (o。。)・。 一 邸 (ゆ。。)溶. Q(トH)孚. ①。。)①N "(N①)。。㊤. 醐余. 邸(oゆ)oゆ 螂 (。。。。)09. 鯉 累 ゜○. ρ(o。。)ゆこ. 8. 邸( 寸①)O= ＼°q=. 毫 (①oO)。っ。。 ＼苺. ㊦(°っ①)お 一＼°っ=. ( 訳) 蕪鳳嘱蓮＼. 型 期 鵠 喫 ⊃ 姻 課 憩 灸 9鰹 喫 ⊃ 旺 趣 U ⊃ 刃 1 玉 乙 静. ¥細. 凶. 避簗. 擢遜. (ゆ O .O > α) 9裡 報 髄 裡 U心謹 贈 津 蝋 婆 匝. 寸 ① ゜っ. 藩愚. (oO① )㊤ oO OO. ( 訳) 麟量 ( 訳) 藩鳳. 潔遜. (⑩ ゜っ )QO °○ 円. 軽回. 粧 周F 繧遷. 一?g一. も. (① 一)一。q. ρ(卜 )ゆ. も. 曇糊冨. 麟 愚 如誕. 魏 醸 e 埋 謹 攣 ξ 謬 筍 % 霧 禦 遜 e 帖 忌 ← 八 H 湿 あ ム や 魍 藤 u錨鯉酬 課 e 風 埋 諭 藝 あ 心 .卜榔. ( 訳) 藩風洲課. t-1(NFく(N.
(36) 第3節. 考察. 本 実 験 で は 、 凍 結 ・融 解 除 核 表受 精 卵 を 用 い た ウ シ核 移 植 卵 が 、 胚盤 胞 へ 発 生 す る こ と を 初 め て 確 認 す る こ とが で きた 。 しか しな が ら、凍 結 ・融 解 除 核 未 受 精 卵 を核 移 植 の た め の レシ ピエ ン ト卵細 胞 質 と して 実 際 に使 用 す る に は依 然 と して 問 題 が 残 って い る。 第1に %)。. 、 融 解 後 正 常 な形 態 を示す 卵 子の 割 合 が 低 い こ とで あ る(43∼48. 本 実 験 で は 、 第2減. 数 分 裂 中期 ウシ 未 受 精 卵 の凍 結 保 存 に効 果 の あ る こ. とが 報 告(Schellandereta1.,1994)さ. れ て い る1.OMあ. る い は1.5Mグ. リセ リ ン を耐 凍 剤 と して 用 いた が 、融 解 直 後 の形 態 的 正 常 卵 子 の 割 合 は 高 か っ た に もか か わ らず 、 約 半数 が1∼2時. 間 の 培 養 後 に 変 性 退 行 した 。 予備 実 験 に. お い て 、 除 核 操 作 直 後 に凍 結 す る と、融解 後 に 大 部 分 の 卵 子が 変 性 して しま っ た た め 、 凍 結 は 除 核 操 作 後 少 な く と も2時. 問 目か ら 開始 した。 除 核 未 受 精 卵 の. 凍 結 ・融 解 後 の 形 態 的 正常 率 が 低 い原 因は 明 らか で はな い が 、 凍 結 ・融 解 の あ いだ に形 成 さ れ る 氷 晶 が 卵 細 胞 質 の 除核 部 位 に触 れ 、 二分 離 胚 の 場 合 と同様 に 大 き な 障 害 を与 え た 可 能 性 が 考 え られ る(Tsunodaeta1.,1987a)。. しか し. な が ら、 染 色 体 を除 去 しな い無 処 置 の未 受 精 卵 を 凍 結 した 場 合 で も、 融 解 後 の 形 態 的 正 常 率 は 報 告 に よ っ て 大 き く異 な る(62.5%;Limeta1., 1991、28.6%;OtoietaL,1992)こ. とか ら、 凍 結 ・融解 法 を 改 善す れ ば. 除 核 未 受 精 卵 の 場 合 も凍 結 融 解 後 の 正常 率 が ヒ昇す る 可能 性 は あ る と考 え られ る。 第2は. 、 凍 結 ・融 解 除 核 未 受 精 卵 と ドナ ー 割 球 と の融 合 率 が 対 照 区 に 比 べ て. 低 い点 で あ る が 、 そ の 原 因 を明 らか にす る こ とは で きな か った 。 第3の. 、 そ して 最 も深 刻 な 問 題 は 、核 移 植 卵 の 発 生 率 の 低 さで あ る。 ウ シ胚. の核 移 植 で は 、 あ らか じめ 活 性 化 刺 激 を 与え た レ シ ピエ ン ト卵 細 胞 質 へ 核 移 植 す る と、 発 生 率 が 高 い ことが 報 告 され て い る(Kozloetal.,1994;SticeetaL, 一30一.
(37) 1994)。. 本 実 験 で は 、 活 性 化 刺 激 か ら融 合 まで の時 間 をKonoetal.(1994). に従 って9時. 間 に設 定 した。 活 性化 刺 激 前 に凍 結 ・融 解 した 卵 子 を用 い た 場 合. の核 移 植 卵 の 発 生率 は 、 活 性 化 刺 激 後 に凍 結 した 場 合 と比べ て 有 意 差 は 見 られ な か っ た が 、 わ ず か に高 い傾 向 に あ っ た 。 また 、 過 齢 卵 子 を用 い た 核 移 植 卵 の 分割 率 は、 若 齢卵 子 を用 い た場 合 に比 べ て 有 意 に 高か っ た(70対41%)。 しか しな が ら、 逆 に胚 盤 胞 へ の 発 生 は 過 齢 卵 子 で は認 め られ ず 、 わ ず か で は あ るが 若 齢 卵 子 か らのみ 得 られ た(2%)。. ドナ ー 割 球 を融 合 した 凍 結 ・融 解 卵. 子 の 胚盤 胞 へ の発 生 能 が 低 い原 因 を検 討 す るた め 、凍 結 ・融 解 卵 子 へ 核 移 植 後 発 育 した 胚 の割 球 を非 凍 結 除核 未 受 精 卵 へ 再 度 核 移 植 した 。 しか しな が ら、 再 核移 植 胚 の胚 盤 胞 へ の発 生 能 は以 前 と して 低 い ま ま で あ った(2%、 最 近 、Martinoetal.(1996)は. 表7)。. 超 急 速 凍 結 法 に よ っ て凍 結 した ウ シ卵 母 細 胞. は 、 体 外 受 精 後 比 較 的 高 い割 合 で 胚 盤 胞 へ 発 生 す る こ と を報 告 して い る 。 今 後 凍結 方 法 を改 良 す る こ とに よ って 、 凍 結 ・融 解 卵 子 を用 いた 核 移 植 卵 の発 生 能 が 向 上す る 可 能 性 が あ る と考 え られ る。. 一31一.
(38) 第6章. ドナー胚 の凍結保存が核移 植卵 の発生能 に及ぼす影 響. 最 近 、Nagashimaeta1.(1995)は. 、 ブ タ 受 精 卵 細 胞 質 か ら脂 肪 滴 を 除 去. す る と 、 凍 結 融 解 後 の 生 存 性 が 向 上 す る こ と を 報 告 し た 。 一・ 方 、 ウ シ卵 子 の 核 移 植 に は 、 コ ン パ ク シ ョ ン 前 の 初 期 胚 が 使 用 さ れ て い る(Prathereta1., 1987;Robletal.,1987)が. 、 コ ンパ ク シ ョ ン前 の初 期 胚 の 耐 凍 性 は 、 コ ンパ. ク シ ョ ン後 の 桑 実 胚 ∼ 胚 盤 胞 期 胚 に 比 べ て 低 い こ と が 報 告 さ れ て い る (Wilmuteta1.,1975;MohrandTrounson,1981)。 1)脂. そ こで 本 実 験 で は、. 肪 滴 の 除 去 が コ ン パ ク シ ョ ン 前 の ウ シ 胚 の 凍 結 保 存 に 有 効 か 否 か 、2). 脂 肪 滴 を 除 去 し た 凍 結 ウ シ 胚 が 核 移 植 の た め の ドナ ー 胚 と し て 使 用 可 能 か 否 か を検 討 した 。. 第1節. 1.体. 材料 と方法. 外受精 と脂肪 滴の除去. 体 外受精 は第2章 の方 法 に従 って行 った。す なわち、屠殺場 由来卵巣か ら採 取 し た卵 胞 卵 を体 外 で24時. 間 成 熟 培 養 後 、 あ らか じめ 受 精 能 獲 得 を誘 起 した. 精 子 浮 遊 液 に導 入 して5時. 間 媒 精 した 。 媒 精 開始 後10∼12時. 00×g、3分. で 遠 心 し、 脂 肪 滴 を偏 らせ た 後 、7.5μg/m1. 問 、20℃. サ イ トカ ラ シ ンB添. 加PBS液. 中で マ イ ク ロ マ ニ ブ レー ター を用 い て 脂 肪 滴 を. 除 去 した(Nagashimaetal.,1995)。 a液 で4∼6日. 間 目 に150. 脂 肪 滴 除 去 卵 は 、5%CS加CRla. 間 卵 丘 細 胞 と共 培 養 した 後 、凍 結 保 存 に供 試 した 。 また 、対 照. と して は脂 肪 滴 の 除 去 を行 わ ず に培 養 して 得 られ た4∼6日 た も のを 使 用 した 。. 一32一. 齢 胚 を凍 結 保 存 し.
(39) 2.ド. ナ ー 胚 の凍 結 保 存. 耐凍 剤 に は 、1.5Mの 1992)。. エ チ レ ン グ リコー ル を使 用 した(V㏄1kelandHu,. す な わ ち 、 体 外 受 精 後4∼6日. 目の胚 を、15分. ング リコー ル で 平 衡 後 凍 結 用0.25mIス 一6 .5℃. 間1.5Mの. エチ レ. トロー に封 入 した 。 ス トロー は. に設 定 した プ ロ グ ラム フ リー ザ ー のエ タ ノー ル バ ス に投 入後 、植 氷. した。 つ い で 、 毎 分0.3℃. の 速 度 でT35.0℃. まで 冷却 した 後 、 液 体 窒 素. に投 入 して保 存 した 。 融解 は液 体 窒 素 か ら取 り出 した ス トロー を空 気 中 で10 秒 間保 持 した 後 、37℃. の微 温 湯 に10秒. S液 を用 い て耐 凍剤 を1段 aa液. で12∼48時. は 、体 外 受 精 後5日. 間浸 漬 して 行 い 、20%CS加PB. 階 で 除去 した 。凍 結 ・融 解 胚 は、5%CS加CRl. 間培 養 後 、 形態 を検 査 した 。核 移 植 の た め の ドナ ー 胚 目の胚 を使 用 し、 凍結 ・融 解 後12時. 間 目の検 査 で 形 態 的. に正 常 な 胚 を使 用 した 。. 3。 核 移 植 お よ び 核 移 植 卵 の培 養 ドナー 割 球 は 、12時. 間 培 養 した凍 結融 解 胚 の割 球 を第2章. の 方 法 に従 っ て. 単離 した もの を用 いた 。 レ シ ピエ ン ト卵細 胞 質 は 、 卵 胞 卵 を20∼24時. 間体. 外 成 熟 培 養 後 、 染 色 体 を除 去 した 後 、20V/mm、20μsec、2回. の直. 流 電 流 を15分 /m1シ. 間 隔 で3回. 与 え て活 性 化 した もの を用 い た。 つ い で 、10μg. ク ロヘ キ シ ミ ド加TCM199液. し100V/m1、50μsecの 卵 は 、5%CS加CRlaa液. で9時. 間 培 養 後 、 ドナ ー 割 球 を注 入. 直 流 パ ル ス を与 えて 融 合 を誘 起 した 。 融 合 で10日. 間 卵 丘 細 胞 と共 培養 し、 発 生 能 を検 討. した 。. 第2節. 実験結果. 表8に 示 すよ うに、遠心処置 、遠 心処置 と脂肪 滴除去 を行 った体 外受 精卵 の 一33一.
(40) ⑩. ゆ. ◎っ. eq. (㊤ ○○) °○ 寸. N. (一⑩)寸 ゜○. (°○ ○○) 一 ⑩. 1. ( 寸 oっ) ① 一. (①ゆ) °○ 寸. ト ①. oO. (O °○)ゆ N. (O °○) °○ 卜. 扁㊦. (○○ゆ)⑩ ゆ. 紹 累 ゜○. ⑩. oO. 十. °運 擦 聖. (。DO8 い一). 脚 薮 自、 鋼. e粥 謹 ( ー)簾 ( + )斡 e. (1)縣 (+ )斡. 十. 十. .°○照. 一34一. (① ゜っ) °○ °。. 囲糊 塩. (訳 ) 無 愚 姻 課. や 脚 麟 魍 裂 風. 灘 醸 e 粥 鍾 運 醤 聖 る % 興 脚 摂 ρ 蝦 や 魍 % 興 U錨佃姻 課 e 愚 婁 駆 賦 葦. 獺 蕪 聾 風.
(41) 分割 率 、8細. 胞 期 な らび に胚 盤 胞 へ の 発 生 率 は 、 無 処 置 胚 と比 べ て い ず れ も差. が み られ な か った(分 8%、. 割;83と86対80%、8細. 胞 期;59と61対5. 胚盤 胞;30と34対39%)。. ま た 、 体 外 受 精 卵 の 耐 凍 性 にお よ ぼす 脂 肪 滴 除去 の影 響 を表9に. 示 した 。 融. 解 直後 に正 常 な 形 態 を示 した 卵 子 の割 合 は 、 いず れ の 日齢 で 凍 結 した 場 合 で も 脂肪 滴 除 去 の 有 無 に よ っ て 大差 み られ な か った 。 これ らの 正 常 胚 を培 養 した と ころ 、4な. らび に5日. 齢 胚 で は24時. 間 目に お い て 対 照 区 の脂 肪 的 除 去 を行 わ. な か った 区 で変 性 退行 す る 胚 が 多 い一 方 で 、 脂 肪 滴 除 去 区 にお い て は そ れ ぞ れ 75%と78%が. 正 常 な 形 態 を維 持 して い た 。 さ らに 、培 養48時. で は 全 て の胚 が変 性 した の に対 して 、 脂 肪 滴 除 去 区で は4日 日齢 胚 で43%が. 正 常 な 形 態 を維 持 して お り、5日. 間後対 照 区. 齢 胚 で25%、5. 齢 胚 で は胚 盤 胞 へ の 発 生 も. 観 察 され た(3/23、13%)。6日. 齢 胚 で は、 脂 肪 滴 除去 の有 無 に か か わ. らず 正 常 な 形 態 を示 す 胚 の 割 合 は72お. よ び63%と. 表10に. 高 かった。. 示 す よ う に 、核 移 植 に 用 い た ドナ ー 胚 の融 解 直 後 の 形 態 的 正 常 率. は、 対 照 区 お よび 脂 肪 的 除 去 区 でそ れ ぞ れ55%(12/22)お (12/19)で 36%お. あ っ た 。 また 、12時. よ び58%で. 滴 除 去 区 で20個 を、 表11に. 間 培 養 後 の形 態 的 正 常 率 は 、 そ れ ぞ れ. あ り、 正 常 な割 球 数 は無 処 理 区 で 平 均18.8個. 示 した 。 脂 肪 滴 除 去 区 の 胚 を用 い た 場 合 の融 合 率(83%)は. 率 も これ ら3区 期;21∼38%)。. 、. お よ び脂 肪 滴 除 去 も凍 結 も行 わ な い 区(80. 融 合 率 と差 が認 め られ な か った 。 ま た 、 分 割 率 お よ び8細 間 で 差 は 認 め られ な か っ た(分. 割 率;63∼70%、8細. 胞 期へ の発 生 胞. しか しな が ら、 胚 盤 胞 へ の 発 生 は脂 肪 滴 除 去 区で 観 察 さ. れ た(6%、5/81)が (16%)に. 、脂 肪. で あ った 。 これ らの 割 球 を ドナ ー核 と して用 い た 核 移 植 成 績. 除 去 せ ず に 凍 結 した 区(74%〉 %)の. よ び63%. 、 新 鮮 胚 を ドナ ー 割 球 と して 用 い た 場 合 の 発 生 率. 比 べ る と有 意 に低 か っ た 。. 一35一.
(42) Q(。。⑩)9. ρ( N卜蛍. ρ( ①⑩)コ. ρ (Oo卜)。。H. 0(N ト)。っ 一. ρ(σっ寸)9 邸 (トN)寸. 。っ。っと. ρ(ゆト)⑩. 鼠. 巡 踵 歯 寸eq. ( 訳) 藩 思荘 閣 纈 藻. 巡 窪 酋 ◎○寸. 爲 ( 。 )。. ゆ( § N. 邸(O )O. ⑩. (ゆ O. 巡辺駐謹 菅. ( 1) 壕( +) 裡. ゆ. 寸. .①欄. 運擦聖 覇 ロ. e栢 鍾. ㊤. O斡 網 噸 掴 U心 謳 血漣 蝋 堅喧. ( 09 ) 薦. (ゆ ① )O eq. (卜① )N °う. (eq ① )°う Q. ( N① )器. .O > 自 ). ⑩ (。っト)雪 邸 (・。卜)。。 一 邸 (N卜)。うN. 邸(ゆト)雪 ρ (。っ 。っ )。。. ( 訳). 癒愚. (OO 一)一゜っ. ( 訳) 蕪尽. 麟風. 潔遜. 。っ. 粧周. 軽回. ρ(8. 菅纈 凄. 獅 醸 e 粥 謹 埋 お 聖 や 麺 % 興 U心 摯 遜 蔭e 風 聖 剛 武 葦. 一36一. 十. T. T. 寸. つ ゆ σう(NIC刈. 】. Fl寸r-1ζ ζつ ζ＼】C＼. ○○ マ ー くN-H cつoOl-Ocつ. 澗 蝋 蟄 忌.
(43) 一 .ゆ 制 O .O eq. oO .oo 一. (○○ゆ) 州 一. (ゆゆ)N 一. (°っ⑩)N 一. (09 )eq N. (OO 一)① 一. eq N. ① H. 十. 十. 軽回. 麟盈. (訳 ). (㊤゜っ)oO. (訳 ). 麟 墨荘 日 鰹魍墜誕. 十. ( 1)簾 ( +)斡. e粥 鍾. 燵お聖. 脚 景 e鵠 1 弘 忽. 遜 裡 堵{. (°0 11信 ) 卜 .一 唱 oっ .oう. ト .㊤ 制. ( ㊤と ) oつ .一 料 ゆ .◎う (寸 11q ) 〇つ .卜 制 O . ㊤N. (訳 ). 無嶺荘H 鰹踵盤巽. .〇 一照. 一37. ゆ .一 制 ゆ .一. ( 無 嶺 細 鰹 11自) 綱 蟹 磐 腿 唱興 陽 藩 蚤報 興降. ↑. お. 藩髄翻 駆弩 興降. ノ ノ. s,へ 櫃 十. 鰹 怪 裡迷 雛 遜 e 麹 1 玉 忽. 潔 麟 遜 型.
(44) (ゆ O .O> ﹂ ) O に 柵 噸 裡 思 誕 中 建 畔 堅虚. 一 ゜○ ㎝ ゆ. (°っoO) oO ① ＼ ( 寸 卜) O 卜 ＼. 一 ⑩. (°っ㊤) 一 ゆ (°っ⑩) °○ °○. (OoO) ⑩ 卜 ＼. ( 1) 縣( +)櫓. e粥 謹. f. (N °○) ㊤ N (Hc心) H 一. (Oト) °○ 寸. ( 1) 聴. ( +)に. (°○ °○) °っ ゜q. 囲 累 ○○. 埋醤聖. .一 H榔. 園 景 e團 1 承 忽. e黎遜. 十. 1十. Q( O )ゆ ρ(o )o 邸( ⑩一)〇 一. 囲糊盈 ( 訳) 藏忌釧課. 1撃. 魏 醸 e 裡 塁 潔 遜 e 團 - 承 ユ や 逃 % 翼 U心 避 洲 課 e 量鯉 論軽. 璽.
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