時 問 目に活 性 化 刺 激 を 与 えた もの を用 いた 。 一 部 の 卵 子 は染 色 体 除 去後 、 第6 章 の 方 法 に従 っ て15000×g、3分 間 、20℃ で遠 心 し、 脂 肪 滴 を偏 らせ た後 、7.5μ9/m1サ イ トカ ラ シ ンB添 加PBS液 中で マ イ ク ロマ ニ フ レ ー ター を用 い て 脂 肪 滴 を除 去 した。
2.継 代 核 移 植
ドナ ー胚 の割 球 は、 第2章 の方 法 に した が って 分 離 後 、 レシ ピエ ン ト卵 細 胞 質 に融 合 した(1世 代 目の 核 移 植 卵)。 つ いで 融 合卵 は、5%CS加TCM
199液 で 卵 丘 細 胞 と3〜6日 間 共 培 養 後 、 一部 の 胚 を次 世 代 の ドナ ー 胚 と し て 使 用 す る た め 単 一割 球 に単 離 し、 除 核 未 受 精 卵 へ 再度 融 合 した(2世 代 目 の 核 移 植 卵 〉 。 残 りの核 移 植 胚 は 、 体 外 培 養 を継 続 して 胚 盤 胞 へ の発 生 能 を検 討 した 。 以 後 、 これ らの 操 作 を繰 り返 して継 代 核 移 植 を行 っ た 。 また 、4回 目の 核 移 植 で得 られ た 胚 の 一 部 は次 世 代 の核 移 植 の ドナ ー胚 と して 用 い るた め 、 凍 結 保 存 を行 っ た 。
3.凍 結 保 存
核 移 植 胚 の 凍 結 ・融 解 は 、 第6章 の 方 法 に順 じて 行 っ た 。 耐 凍 剤 に は 、 1.5Mの エ チ レ ン グ リコ ー ル を使 用 し、核 移 植 胚 を1.5Mの エ チ レ ン グ リ コー ル を含 む20%CS加PBS液 に15分 間 室 温 に 静 置 後 、 精 液 凍結 用0.
25mlス トロー に封 入 した。 つ い で 、 ス トロー を 一6.5℃ に設 定 した プ ロ グ ラム フ リー ザ ー の エ タ ノ ー ル バ ス に 移 した の ち 、 植 氷 した 。 つ ぎ に、 毎 分 0.3℃ の 速 度 で 一35.0℃ ま で冷 却 した後 、 ス トロー を液 体 窒 素 に投 入 し て 保 存 し た 。 融 解 は 、 液 体 窒 素 か ら取 り出 し た ス トロ ー を 空 気 中 で10秒 保 持 した 後 、37QCの 微 温 湯 に10秒 間浸 漬 した。 ス トロー か ら回 収 した胚 は、2
0%CS加PBS液 で 洗 浄 す る こ とに よ って 耐 凍 剤 を1段 階 で 除 去 した の ち 、 5%CS加CRlaa液 へ 移 して核 移 植 に使 用 す る まで 培 養 した 。
一42一
第2節 実験 結果
本 実 験 で は 、合 計13個 の 体 外 受 精 胚 を 用 い て5回 の継 代 核 移 植 を行 っ た が 、そ の うち2個 で は核 移 植 で 胚 盤 胞 が 全 く得 られ な か った こ とか ら、 集 計 か らは 除外 した 。 表12に 示 す よ う に 、融 合 率 は86〜100%と いず れ の核 移 植 世 代 にお い て も高 か っ た 。 また 、 分 割 率 お よ び8細 胞 期 へ の 発 生 率 は 、 凍 結 保 存 前 の1〜4世 代 目で は大 差 な か っ た(79〜86%お よび25〜38%)
が 、4世 代 目 の核 移 植 胚 を凍 結 後 ドナ ー割 球 と して 用 い た5世 代 目で は全 く分 割 卵 は得 られ な か っ た 。 胚 盤 胞 へ の 発 生 率 は 、 世 代 を重 ね る毎 に低 下 し4世 代
目以 降 か らは胚 盤 胞 が 全 く得 られ なか った。
核 移 植 卵 の 凍 結 ・融 解 成 績 を表13に 示 した 。 合 計8個 の4世 代 目胚 を凍 結 した が 、融 解 後 正 常 な 形 態 を示 して い た割 球 は97個 の うちわ ず か3個 に す ぎ な か ったÒ
図3に 、 用 いた ドナ ー 胚 ご とに 得 られ た 総 胚 盤 胞 数 を 示 した 。1個 の 胚 か ら 1〜10個(平 均3.4個)の 胚 盤 胞 を作 出す る こ とが で き た 。
第3節 考 察
SticeandKeefer(1993)は 、 人 工 授 精後4〜6日 目 に生 体 よ り採 取 した 胚 の 割 球 を初 代 の ドナ ー 割 球 と して 、 また レシ ピエ ン ト卵子 も過 剰 排 卵 処 置 後 に 生 体 か ら回 収 した体 内 成 熟 卵 子 を使 用 して 核 移 植 を行 い、 融 合 後 の 核 移 植 卵 を 体 外 で は な く ヒ ツ ジ の 結 紮 卵 管 内 で 一 時 的 に 培 養 す る と い う"体 内 系"で 、4回 核 移 植 を繰 り返 して1個 の 胚 か ら最 高54個 の 胚 盤 胞 の 作 出 に成 功 した 。 ま た 、Takanoetal.(1997)は 、 人工 授 精 後5日 目に生 体 よ り採 取 した 胚 を ドナ ー割 球 と して 用 い、 体 外 で 成 熟 させ た レ シ ピエ ン ト卵 細 胞 質 へ の核 移 植 を3回
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一46一
繰 り返 し、 さ らに体 外 で 培 養 す る こ と に よ って1個 の胚 か ら最 高43個 の ク ロ ー ン胚盤 胞 を 作 出 して い る 。 また 、Ectorsetal.(1995)は 、1世 代 目 に体 外 受 精 胚 を使 用 し、得 られ た 核 移 植 卵 を再 度 核 移 植 して 、完 全 体 外 培 養 系 に お い て
も2世 代 目ま で の 継 代 核 移 植 が 可 能 で あ る こと を示 した。
本 実験 で も、 低 率 で は あ る が3世 代 目ま で の核 移 植 卵 は胚 盤 胞 へ 発 生 す る こ とが 判 明 した 。 分 割 率 、8細 胞 期 へ の 発 生率 は4世 代 目 ま で 大 差 が み られ な か っ た が 、 生 体 よ り採 取 した 胚 を 用 いたTakanoetal.(1997)の 報 告 と は 異 な って 胚 盤 胞 へ の 発 生 率 は2世 代 目で す で に低 下(5%)し て お り、4世 代 目
で は全 く観 察 され なか った 。 継 代 核 移 植 卵 の発 生率 は 、 生 体 よ り採 取 した 胚 の ・ 場 合 で も ドナ ー 胚 ご と に 異 な る こ と が 報 告 さ れ て お り(SticeandKeefer,
1993;Takanoeta1.,1997)、 本 実験 で 用 いた 体 外 受 精 胚 の"品 質"が 劣 っ て い たた め と考 え られ る。
ま た 、4世 代 目の核 移 植 で 得 られ た8〜21細 胞 期 胚 を、 第6章 の 実 験 結 果 に基 づ い て 凍 結 した が 、 融 解 後 正 常 な 形 態 を示 して いた 割 球 の割 合 は体 外 受 精 胚 の 場 合 と は異 な って わ ず か3%と き わ め て 低 率 で あ っ た 。本 実 験 で はそ の 原 因 を明 らか にす る こ と が で きな か っ た が 、 凍 結 の 時 期 が 早 す ぎ た 可 能 性 が 考 え
られ る。
また 、 本 実 験 は 多 数 の ク ロー ン胚 を作 出す る こ と を 目的 に実 施 した が 、結 果 と して1ド ナ ー 胚 あ た り作 出で き た 胚 盤 胞 は最 大10個 に留 ま り、 これ ま で の 報 告(54個 、SticeandKeefer,;43個 、Takanoetal.,;21個 、Ectors eta1.)と 比 較 して か な り少 数 で あ っ た 。 こ の こ とか ら、 体 外 実 験 系 を用 い て 多 数 の ク ロー ン動 物 を 作 出 す る た め に は、 体 外 培 養 系 の 改 善、 核 移 植 胚 の 凍 結 技 術 の 改 善 な ど の 多 く の 問 題 が 残 さ れ て い る 。