の あ る こ と(Yoshidaeta1.,1993)、 体 外 受精 後 の雌 雄 両 前核 形 成 時 期 の 同 調 作 用(Grtteenetal.,1995)が あ る こ とがそ れ ぞ れ報 告 され て い る。 これ ら の知 見 を も と に、 本 実 験 で は 各 種 添 加 物 を添 加 した 培 地 で成 熟 さ せ た 卵 胞 卵 を レシ ピエ ン ト卵 細 胞 質 と して 用 いて 核 移 植 を行 った が 、 核 移 植 卵 の 発 生 能 は 無 添 加 区 と比 べて 大 差 は認 め られ な か った 。
非 共 培 養 下 で ウ シ体 外 受 精 卵 を体 外 培 養 す る と8細 胞 期 で 発 生 が 停 止 す る
"i
nvitro8℃ellblock'現 象(BarnesandFirst,1991)が み られ る 。 そ の た め 、 卵 丘 細 胞(Gotoeta1.,1988;福 田,1992)、 卵 管 上 皮細 胞(Eyestone andFirst,1989)な ど と共 培 養 す る こと に よ って 発 生 阻害 が 一 部 解 除 され 、 体 外 に お い て も胚 盤 胞 へ 発 生 す る こ とが 示 さ れ て い る。 近 年 、Takahashieta1.
(1993)は10〜50μMβ 一 メル カ プ トエ タ ノー ル 添 加 培 地 で6〜8細 胞 期 胚 を培 養 す る と非 共 培 養 系 にお い て も24〜35%が 胚 盤 胞 へ 発 生 す る こ と、
また この効 果 は細 胞 質 内 の グル タ チ オ ン濃 度 の上 昇 と関 係 して い る こ と を報 告 した 。 体 外 受 精 由来 の8〜16細 胞 期 胚 の 核 を除 核 未 受 精 卵 へ 核 移 植 して"初 期 化"し た 核 移 植 卵 を用 いた 本 実 験 で も、 この効 果 が 確 認 さ れ た 。
ウ シ卵 子 の核 移 植 に お け る ドナ ー 胚 は過 剰 排 卵 牛 か ら回 収 され た あ る い は 体 外 受 精 後 、 体 外 で 発 生 さ せ た3〜6日 齢 胚 が 使 用 さ れ て い る(Robleta1., 1987;Westhusinetal.,1991)。Pratheretal.(1987)は 、 ヒツ ジ結 紮 卵 管 内で 培 養 して 発 育 さ せ た2〜8細 胞 期 胚 、9〜16細 胞 期 胚 あ る い は17〜3
2細 胞 期 胚 の割 球 を 用 い た 核 移 植 卵 の 発 生 能 には 差 が 認 め られ な い こ と を 報 告 して い る。 しか しな が ら、 体 外 受 精 胚 を ドナー 胚 と して 用 いた 場 合 の 核 移 植 卵 の体 外 発 生 能 にお よ ぼ す ドナ ー 日齢 の 影 響 を調 べ た 報 告 は少 な い 。 す な わ ち 、 青 野 ら(1994)は 、116時 間 培 養 した 体 外 受 精 胚 の 割 球 を核 移 植 した 核 移 植 卵 の胚 盤 胞 へ の発 生 率 は、68、92あ る い は140時 間培 養 した 胚 の割 球 を 用 いた 場 合 よ りも高 い こ と を報 告 して い る。 本 実 験 で は、 体 外 受 精 後3.5〜
6.5日 齢 胚 の割 球 を ドナ ー 割 球 と して 甫 いた 核 移 植 卵 の発 生能 は 大 差 な い こ
とが 判 明 した 。Prathereta1.(1987)の 結 果 と合 わせ て考 え る と、2〜35 細 胞期 ウ シ 胚 の核 は 、 除 核 未 受 精 卵 卵細 胞 質 中 で 初 期 化 さ れ る こ とが 明 らか で
あ る 。
ウ シ未 受 精 卵 を 凍 結 ・融解 後 体 外 受 精 を行 う こ と によ って 産 子 が 得 られ て い る が 、 受 精 率 お よ び 体 外 発 生 能 は 低 い こ とが 知 られ て い る(Fukueta1.,
1992)。 そ の原 因 と して 、凍 結 ・融解 処理 によ って 卵 細 胞 質 の細 胞 骨 格を 形成 す る チ ュー ブ リ ンお よ び ア クチ ン構 造 が 破壊 され て減 数 分 裂 時 の紡 錘体 が 分 断
し、 そ れ に伴 って 染 色 体 が 分 散(AmanandParks,1994;Glenistereta1.,
1987)す る た め 、体 外 受 精 後 に異 数 体 とな り発 生 が 阻 害 され る ことが 考 え られ て い る。 ま た 、耐 凍 剤 の 影 響 で 通 常 は受 精後 に み られ る表 層 穎 粒 の 放 出 が 起 こ り、 透 明 帯 が 硬 化 し、 精 子 の侵 入 が 妨 げ られ る こ と によ って 受 精 率 が 低 くな る こ とが 報 告 さ れ て い る(Carrolletal.,1990;Fukueta1.,1995)。 そ の た め 、 本 実 験 で は 、体 外 成 熟 卵 か らあ らか じめ 第2減 数 分 裂 中期 染 色 体 を除 去 し た後 、凍 結 保 存 を行 い 、 融 解 後 ドナ ー 割 球 を融 合 して 体 外 発 生能 を検 討 した 。 そ の 結 果 、 凍 結 ・融 解 未 受 精 卵 を用 いた 核 移 植 卵 の1部 は 、胚 盤 胞 へ 発 生す る ことが 明 らか とな った 。 しか しな が ら、凍 結 しな い卵 細 胞 質 を用 いた 場 合 に比 べ て 発 生 率 が 低 い こ とか ら凍 結 ・融 解 除 核 未 受 精 卵 を レ シ ピエ ン ト卵 細 胞 質 と
して 用 い る に は、 凍 結 融解 法 を改 良 す る こ とが 必 要 と考 え られ た 。
また 、 ドナ ー胚 と して 使 用 す る体 外 受 精 胚 の 凍 結 保 存 が核 移 植 卵 の発 生 に及 ぼ す 影 響 を検 討 す る た め に 、体 外 受 精 卵 か らの 脂 肪 滴 の 除 去 が 有 効 か否 か を検 討 し左。 そ の 結 果 、遠 心 処 理 と脂 肪 滴 除去 操 作 の いず れ も体 外 受 精 卵 の 発 生 能 に は影 響 しな い こ とが 判 明 した 。 この 結 果 は 、WallandHawk(1988)お よ び Nagashimaetal。(1991)の 報 告 と 一 致 して い た 。 つ い で 、 体 外 受 精 後4〜6日 目胚 の耐 凍 性 が脂 肪 滴 除 去 に よ って 向上 す る か 否 か を検 討 した 。6日 目の 桑 実 胚 は脂 肪 滴 の 有 無 に 関 わ らず これ まで の報 告 と同様 に高 い耐 凍 性 を 示 した が 、 4お よ び5日 齢 胚 で は脂 肪 滴 を除 去 した場 合 、 融 合 後 の 生 存 性 は 向 上 した 。
一50一
Westhusinetal.(1991>お よ びYangeta1.(1993)は 、 生 体 か ら回 収 した 桑 実 胚 を凍 結 融 解 後 核 移 植 の た め の ドナ ー胚 と して使 用 した場 合 、 胚 盤 胞 へ の 発 生 率 は非 凍 結 胚 を使 用 した場 合 と比 べ て大 差 な い こ と を報告 して い る 。 本 実 験 で は、 脂 肪 滴 を 除 去 後5日 目で 凍 結 保 存 した 胚 の割 球 を 用 いて 核 移 植 を行 っ た 結 果 、 胚 盤 胞 へ 発 生す る こ とが観 察 され た 。
現 時 点 にお いて 多 数 の ク ロ,̲.̲....ン動 物 を作 出す る方 法 と して は、 核 移 植 後 発 育 した 胚 を再 び核 移 植 の た め の ドナ ー 胚 と して用 いて 核 移 植 を繰 り返 す 継 代 核 移 植 が 、 有 効 で あ る と考 え られ て い る(SticeandKeefer,1993;丁 欲anoeta1.,
1997)。SticeandKeefer(1993)は 、"体 内 系"を 使 用 して 、4回 核 移 植 を 繰 り 返 し て1個 の 胚 か ら最 高54個 の 胚 盤 胞 の 作 出 に 成 功 し た 。 ま た 、 Takanoeta1.(1997)は 、 人 工 授精 後5日 目に 生体 よ り採 取 した 胚 を ドナ ー 割 球 と して 用 い、 体 外 で成 熟 さ せた レ シ ピエ ン ト卵 細 胞 質 へ の核 移 植 を3回 繰 り
返 し、 さ らに体 外 で培 養 す る こ とに よ っ て ユ個 の胚 か ら最 高43個 の ク ロー ン 胚 盤胞 を作 出 して い る。 体 外 受精 胚 を ドナ ー胚 と して用 い た 本 実 験 で も 、 低 率 で は ある が3世 代 目 まで の核 移植 卵 は 、胚 盤 胞 へ 発 生す る こと が判 明 した 。 本 実験 は多 数 の ク ロー ン胚 を 作 出 す る こ とを 目的 に実 施 した が 、 結 果 と して1ド ナV胚 あた り作 出 で きた 最 大胚 盤 胞 は10個 に 留 ま り、 これ ま で の報 告(54 個 、SticeandKeefer,;43個 、Takanoeta1.,;21個 、Ectorseta1.)と 比 較 して か な り少 数 で あ っ た 。
本 研 究 の結 果 、 屠 場 の卵 巣 か ら採 取 した 卵 胞 卵 を体 外 で 成 熟 させ て レ シ ピエ ン ト卵 細 胞 質 と して 、 ま た 体 外 受 精 後 体 外 で 発 育 させ た 胚 を ドナ ー 胚 と して も ち い た核 移 植 によ っ て 、1個 の ウ シ胚 か ら最 大10個 の ク ロー ン 胚 盤 胞 を作 出 す る こ とが で き た 。 こ の 結 果 は 、 ホ ル モ ン 処 置 を し た ウ シ か ら採 取 し た 未 受 精 卵 や 胚 を レシ ピエ ン ト卵 細 胞 質 や ドナ ー 胚 と して 用 いた 報告 や 核 移 植 卵 を ヒツ ジの 卵 管 内 で 培 養 す る こ と に よ っ て 発 育 させ た 報 告 と比 べ て 劣 る も の で あ っ た 。 しか しな が ら、 ク ロー ン牛 を 作 出 す る こ とを 目的 とす る核 移 植 技 術 を畜 産
の現 場 に普 及 さ せ るた め に は、 本研 究 で実 施 した よ うにす べ て の 操 作 を"体 外 系"で 行 う必 要 が あ る 。本 研 究 で得 られた 成果 は、 ウ シ に お け る実 用 的 な核 移 植 技 術 の 開発 に新 しい知 見 を提 供す る もの で あ る。
一52一
謝辞
本研究 を遂 行す るにあた りD終 始懇篤な御指導 を賜 わ り、さ らに本報告 の御 校 閲の労 を賜 わ りま した近畿大学 農学部教授 ・角田幸雄 博士 に深 謝 の意 を表 し ます 。
また 、有 意 義な御 助 言 を戴 き直接 御指 導賜 った本 学動 物発 生工 学研 究 所 助 手 ・加藤容子 博士 に深 く感謝す る。
また、本報告 を御校 閲戴 いた近畿大学農学部 教授 ・杉本毅博 士 、な らび に近 畿大学農学 部教 授 ・上野紘一博士 に深謝致 します 。
さ らに、核移植 技術 について御教示戴 いた奈 良県畜産試験場技 師 ・高野 博博 士(現 大阪 府 立大学農学 部)に 深謝 いた します。 ウシ胚 の採取 に御協 力戴 いた 奈良県 畜産 試験場 ・億正樹主任研 究員な らび に小財 千明主任研究 員 、奈 良県 食 品衛生検査 所、京 都市第二卸 売市 場の検査員 の先生方 に深謝 いた します。
最 後 に、 近 畿 大 学 農 学 部 畜 産 学研 究 室 大 学 院 生 ・新 田 良 平 氏(現 丸 紅 飼 料)、 秦正 樹氏 、外 丸祐介氏 、谷哲弥氏 をは じめ多 くの専攻生 の御協 力 に感 謝 いた します 。
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